生物信息學(xué)分析精選(九篇)

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第1篇：生物信息學(xué)分析范文

摘要：

采用RACE技術(shù)，獲得茶樹武夷奇種C18葉片花青素合成途徑中的花青素合成酶（ANS）基因的cDNA全長(zhǎng)序列。采用染色體步移技術(shù)獲得該基因的啟動(dòng)子序列。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)該基因在不同遮光處理下的表達(dá)動(dòng)態(tài)。結(jié)果表明，CsANS全長(zhǎng)cDNA為1000bp，其中ORF（OpenReadingFrame）為957bp，編碼320個(gè)氨基酸，含有DIOX-N和20G-Fell-Oxy保守功能結(jié)構(gòu)域；分離得到CsANS基因上游調(diào)控序列1010bp，其含啟動(dòng)子核心元件TATA-box及ACE、GT1-motif、Sp1（光響應(yīng)元件）、circadian（生物鐘相關(guān)元件）等與花青素合成途徑相關(guān)的重要順式作用元件。熒光定量PCR分析表明，該基因在全光照處理（CK）時(shí)表達(dá)量較高，75%遮光時(shí)表達(dá)量較低。說明該基因的表達(dá)受光照強(qiáng)弱的控制。

關(guān)鍵詞：

茶樹；CsANS基因；啟動(dòng)子；生物信息學(xué)分析

茶樹武夷奇種C18，無性系。灌木型，中葉類，中生種。是福建省武夷山市茶葉研究所從武夷群體種中選育的優(yōu)良品系。芽葉紫紅色，茸毛較密，節(jié)稍長(zhǎng)。且芽葉生育力強(qiáng)，發(fā)芽較密，持嫩性較強(qiáng)，是一種稀有的特色茶樹資源。武夷奇種C18芽葉呈現(xiàn)紅紫色，花青素含量較高[1-2]。研究表明，花青素是茶樹葉片呈現(xiàn)“紅紫色”的主要原因[3]。植物花青素的生物合成途徑已有較為深入的研究，其中花青素合成酶（Anthocyaninsynthase，ANS）是將無色花青素經(jīng)氧化脫水形成紅紫色花青素的關(guān)鍵酶[1]。環(huán)境信號(hào)激活花青素合成途徑中相關(guān)基因的表達(dá)[4]。在花青素合成的前期，光能調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，弱光可以抑制或下調(diào)基因的表達(dá)，從而減少花青素的合成；而強(qiáng)光可以誘導(dǎo)花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)，使花青素的含量增加[5]。光信號(hào)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子結(jié)合的強(qiáng)弱，并影響結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，其表達(dá)量也會(huì)隨之發(fā)生相應(yīng)的變化[1]。目前在茶樹上，ANS基因的啟動(dòng)子還未克隆。本研究根據(jù)已有的茶樹ANS基因的EST（Expressedsequencetags）序列，采用同源克隆和GenomeWalking方法，克隆了紫葉茶樹的ANS基因及分離5′調(diào)控序列，再利用生物信息學(xué)法，預(yù)測(cè)了啟動(dòng)子的順式作用元件，采用熒光定量PCR技術(shù)，分析ANS在不同光照條件下的表達(dá)模式，有助于揭示ANS在紫色茶樹葉片對(duì)環(huán)境信號(hào)響應(yīng)過程中的作用，解析光強(qiáng)對(duì)武夷奇種C18ANS基因的調(diào)控機(jī)理，為紫芽茶樹特異種質(zhì)的創(chuàng)制和利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與處理1.1.1植物材料試驗(yàn)材料為武夷奇種C18，由福建省武夷山市茶葉研究所資源圃提供。選取武夷奇種C18的成熟葉片，迅速用液氮處理，置－80℃冰箱保存,用于基因組DNA的提取，克隆CsANS啟動(dòng)子序列。

1.1.2遮光處理試驗(yàn)在福建省武夷山市茶葉研究所資源圃中完成。2015年4月中旬，挑選生長(zhǎng)發(fā)育良好、整齊一致、樹形基本相似的植株27株，分為3組（每9株為1組，每重復(fù)3株），掛牌標(biāo)記，并對(duì)其進(jìn)行同一高度的修剪。待茶樹芽頭萌動(dòng)之時(shí)，開始遮光處理。設(shè)2個(gè)處理：分別用75%和60%的黑色遮蔭網(wǎng)遮光，以全光照處理為對(duì)照。經(jīng)過15d的遮光處理，取經(jīng)遮光處理和全光照處理（CK）的武夷奇種C18葉片（第一葉位），經(jīng)錫箔紙分裝于－80℃保存，用于熒光定量PCR檢測(cè)。

1.1.3試劑FHPlantDNAKit(北京德曼特爾生物科技有限公司)；PrimerStar(TaKaRa公司)；AgaroSeGelDNAExtractionKit(TaKaRa公司)；SMARTerRACE5′/3′Kit(TaKaRa公司)；染色體步移試劑盒(TaKaRa公司)；pEASY-BluntZeroCloningKit(福州都拜特生物技術(shù)有限公司)；引物合成及樣品測(cè)序由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司完成。

1.2方法

1.2.1茶樹葉片總RNA及基因組DNA的提取本試驗(yàn)參照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取茶樹總RNA；采用FHPlantDNAKit(北京德曼特爾生物科技有限公司)試劑盒提取紫葉茶樹基因組DNA。

1.2.2茶樹CsANS5′RACE、3′RACE及全長(zhǎng)ORF的PCR擴(kuò)增cDNA第一鏈的合成按RevertAidTMFirst-StrandcDNASynthesisKi試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)已報(bào)道的擬南芥、葡萄、茶樹等ANS基因序列，用DNAMAN設(shè)計(jì)同源克隆引物。上游引物：5′-CAACAATGATGACTACAGTGGCTG-3′，下游引物：5′-GCGCCTTTAGAGCCAAGTTCTTG-3′。PCR擴(kuò)增體系：12.5µLEx-Taqmix，2µLcDNA模板，0.5µLANS-R，0.5µLANS-F，補(bǔ)ddH2O至25µL體系。94℃預(yù)變性4min，94℃變性40s，56℃退火30s，72℃延伸3min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在其ORF兩端設(shè)計(jì)特異引物qANS-R：5′-ATGGCTCTCTGTACATATGCATGTC-3′；qANS-F：5′-TTATACAATTGTTACACCCCCGGTC-3′擴(kuò)增全長(zhǎng)序列。

1.2.3CsANS基因啟動(dòng)子的克隆根據(jù)TaKaRaGenomeWalkingKit引物設(shè)計(jì)原則，在已知的茶樹ANS基因（GenBank收錄號(hào)為AY830416.1）的已知序列區(qū)（最好不少于500bp）分別設(shè)計(jì)3條反向且退火溫度較高的特異性引物SP1、SP2和SP3，再與試劑盒中提供的4種經(jīng)過獨(dú)特設(shè)計(jì)的退火溫度較低的兼并引物AP1、AP2、AP3和AP4進(jìn)行熱不對(duì)稱PCR反應(yīng)[6]，經(jīng)過3次巢式PCR反應(yīng)獲得已知序列的側(cè)翼序列。用于擴(kuò)增ANS基因啟動(dòng)子序列的特異性引物情況詳見表1。以提取的武夷奇種C18茶樹葉片DNA為模板，按照TaKaRaGenomeWalkingKit說明和林玉玲等[7]的方法進(jìn)行ANS基因啟動(dòng)子的克隆。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的條帶克隆至pMD18-T載體，37℃連接過夜后進(jìn)行轉(zhuǎn)化測(cè)序（鉑尚生物技術(shù)有限公司）。

1.2.4熒光定量PCR表達(dá)分析分別提取遮光75%、60%和全光照處理（CK）的武夷奇種C18第一葉位總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，稀釋10倍作模板。以18S-rRNA基因?yàn)閮?nèi)參（18SⅠ：5′-CCTGAGAAACGGCTACCACA-3′，18SⅡ：5′-CACCAGACTTGCCCTCCA-3′）。運(yùn)用DNAMAN軟件，按照熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物（ANS-R：5′-GTTGCTGTAATAGGCGATGGTG-3′，ANS-F：5′-CCTGTTGGACTGTAATCTGCTAAG-3′）。參照SYBRPrimeScriptTMRT-PCRKit（TaKaRa）說明書，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增體系：cDNA模板1µL，2×SYBRPremixEx-TaqTM5µL，上下游引物（10µmol•L-1）各0.2µL，用RNase-freeH2O補(bǔ)足至10µL。95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃復(fù)性34s，共40個(gè)循環(huán)。每份樣品設(shè)3次重復(fù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用MicrosoftExcel2007軟件，采用2-ΔΔCt法計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量[8]；應(yīng)用SPSS軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析。應(yīng)用MicrosoftExcel2007軟件作柱狀圖。

1.2.5生物信息學(xué)分析CsANS序列通過在線NCBI的Blast功能進(jìn)行氨基酸序列同源性比較；通過Protparam軟件對(duì)基因的分子量、等電點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，初步分析目的基因的功能；通過TMHMM和TMPred軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)；SignalP4.1進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；在線SOPMA預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。ProtCompVersion9.0進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。啟動(dòng)子序列通過在線PlantCAR[9]及Place軟件[10]預(yù)測(cè)其順式作用元件的種類、分布情況和生物學(xué)功能[11]。通過在線軟件BDGP[12]預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及可能的核心啟動(dòng)子區(qū)域。

2結(jié)果與分析

2.1茶樹CsANS基因cDNA全長(zhǎng)克隆

2.1.1茶樹CsANS基因PCR結(jié)果分析經(jīng)PCR擴(kuò)增回收測(cè)序及使用DNAman軟件拼接獲得CsANS基因全長(zhǎng)序列1000bp（GenBank收錄號(hào)為KT215319）。（圖1）該序列包含1個(gè)完整的閱讀框（15~977bp），編碼320個(gè)氨基酸，該基因含有起始密碼子ATG、終止密碼子TAA，并含有保守功能結(jié)構(gòu)域DIOX-N、20G-Fell-Oxy，屬于DIOX-N和20G-Fell-Oxy超級(jí)家族。

2.1.2茶樹CsANS基因的進(jìn)化分析將武夷奇種C18茶樹ANS基因的氨基酸序列與已知的茶樹、高叢越橘（Vacciniumcorymbosum）、和甘薯（Ipomoeabatatas）等11種植物ANS基因的氨基酸序列進(jìn)行同源進(jìn)化樹分析（圖3）。發(fā)現(xiàn)所克隆的ANS蛋白與同屬茶樹ANS蛋白（登錄號(hào)：AY830416.1）的一致性高達(dá)100%。與其他物種比較，發(fā)現(xiàn)茶樹ANS蛋白在親緣關(guān)系上與高叢越橘最近，同源性為78%。

2.1.3CsANS基因氨基酸生物信息學(xué)分析通過ProtParam軟件對(duì)CsANS氨基酸進(jìn)行基本信息分析可知，CsANS基因編碼320個(gè)氨基酸；相對(duì)分子量36113.6kD；理論等電點(diǎn)pI為6.23；負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）為46個(gè)，正電荷殘基（Arg+Lys）為43個(gè)；不穩(wěn)定指數(shù)為41.05，屬于不穩(wěn)定蛋白；脂溶系數(shù)為：88.97，平均疏水性（GRAVY）為－0.397；分子式：C1626H2576N432O472S12，總原子數(shù)為5118，氨基酸組成中谷氨酸含量最高，占總氨基酸的10.3%；其次為甘氨酸，占6.9%，其他氨基酸占82.8%。利用在線軟件TMHMMServerv.2.0工具預(yù)測(cè)CsANS蛋白的跨膜螺旋區(qū)，如圖4顯示，該蛋白不是膜蛋白，無跨膜螺旋區(qū)。使用TMpred預(yù)測(cè)也顯示蛋白都分布在膜外，無跨膜蛋白。通過在線軟件COILS對(duì)CsANS氨基酸預(yù)測(cè)，在CsANS蛋白的25個(gè)氨基酸左右預(yù)測(cè)到強(qiáng)超螺旋信號(hào)。經(jīng)過SignalP-4.1預(yù)測(cè)信號(hào)肽顯示，CsANS編碼的氨基酸不含信號(hào)肽，不是分泌蛋白。對(duì)氨基酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示CsANS編碼的氨基酸中α螺旋結(jié)構(gòu)較多，有125個(gè)占所有氨基酸的39.06%，其次為無規(guī)則卷曲占31.87%，延伸鏈占17.81%，β折疊所占比例最低為11.25%。通過ProtCompVersion9.0軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，其亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)。

2.2CsANS基因啟動(dòng)子克隆

2.2.1CsANS基因啟動(dòng)子擴(kuò)增結(jié)果以武夷奇種C18的DNA為模板，經(jīng)3輪巢式PCR反應(yīng)后，擴(kuò)增到1條大于1000bp的目的片段（圖5）。將該片段進(jìn)行克隆、測(cè)序，結(jié)果顯示，獲得的片段實(shí)際長(zhǎng)度為1236bp。序列經(jīng)過分析整理后，以ATG為起始位點(diǎn)，得到茶樹CsANS上游長(zhǎng)度為1010bp的DNA序列。

2.2.2茶樹CsANS啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的預(yù)測(cè)經(jīng)過啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在線預(yù)測(cè)，茶樹CsANS基因1010bp的5′端調(diào)控序列可能存在3處核心啟動(dòng)子區(qū)域，位于35~85、316~366、480~530bp，分值分別為0.96、1和0.88，可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分別為G、C和T。此結(jié)果可推測(cè)位于316~366bp的序列很可能就是該基因真正的核心啟動(dòng)子區(qū)域，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為位于第357bp的C（圖6）。

2.2.3茶樹CsANS基因啟動(dòng)子順式元件分析啟動(dòng)子生物學(xué)功能的在線預(yù)測(cè)結(jié)果表明，CsANS基因啟動(dòng)子區(qū)域中，除了含有大量的核心啟動(dòng)子元件如CAAT-box和TATA-box之外，還存在多種順式元件，如脫落酸相關(guān)元件ABRE，厭氧誘導(dǎo)相關(guān)的元件ARE，熱應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)元件HSE，晝夜控制調(diào)節(jié)元件circadian，低溫應(yīng)答元件LTR，光響應(yīng)相關(guān)元件Sp1、ACE、I-box及MYB結(jié)合位點(diǎn)等（表2）。

2.3相對(duì)熒光定量PCR表達(dá)分析以18S-rRNA為內(nèi)參，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)不同遮光處理及未處理的武夷奇種C18葉片CsANS基因表達(dá)進(jìn)行了分析，結(jié)果（圖7）表明，其表達(dá)量在全光照處理（CK）時(shí)較高，75%遮光時(shí)較低。隨著遮光度增加，呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)。說明茶樹葉片在光照強(qiáng)時(shí)花青素合成酶（ANS）表達(dá)量高，光照弱時(shí)表達(dá)量低。

3討論

CsANS是紫葉茶樹花青素合成的最后一個(gè)酶，也是將無色花青素經(jīng)氧化脫水形成紅紫色花青素的最關(guān)鍵酶，此中間產(chǎn)物進(jìn)一步與3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（3GT）偶聯(lián)并且被傳送到液泡中，形成顯色的3-O-糖苷化花青苷[13]，在植物色澤形成中具有重要作用[14]。ANS基因最初是利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)從玉米的A2突變體中鑒定和克隆得到[15]，近年來在茶樹（AY830416.1）、擬南芥（AT4G2288）、小麥（T.aestivum，AB247921）[16-17]等多種植物中也已經(jīng)得到其克隆。本研究從武夷奇種C18中克隆得到了CsANS的cDNA全長(zhǎng)序列，該基因編碼的蛋白具有典型ANS蛋白的保守結(jié)構(gòu)域：DIOX-N、20G-Fell-Oxy。DIOX-N（嗎啡合成非血紅素加氧酶的N-末端）是蛋白質(zhì)與2-酮戊二酸/鐵（Ⅱ）依賴性雙加氧酶活性的高度保守的N-末端區(qū)域。2OG-FeⅡ_Oxy氧化酶結(jié)構(gòu)域由2-酮戊二酸和Fe(Ⅱ)-依賴的氧化酶超家族組成，該家族包括脯氨酰4-羥化酶α亞基的C末端。全酶由一個(gè)α2β2復(fù)合物組成，α亞基是其主要的活性位點(diǎn)。能夠催化反應(yīng)：前膠原L-脯氨酸+2-酮戊二酸+O2=前膠原反式-4-羥基-L-脯氨酸+琥珀酸+CO2[14]。與其他已知的ANS蛋白相比，CsANS編碼的氨基酸具有較高的同源性，它與高叢越橘（JN654701.1）的同源性較高，一致性為78%。所以推斷CsANS與高叢越橘中典型的花青苷元合成酶基因的生物學(xué)功能類似。環(huán)境信號(hào)激活花青素苷合成途徑，并促使茶樹葉片開始積累花青素[18-20]。

第2篇：生物信息學(xué)分析范文

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通過多重序列比對(duì)篩選保守序列是生物信息學(xué)方法的基礎(chǔ)，幾乎所有的注釋序列的意義、研究序列結(jié)構(gòu)的方法都是建立在此基礎(chǔ)上的。保守序列是指病毒在進(jìn)化過程中基因組序列保持不變或變異很小的序列。在進(jìn)化過程中，變化很小或者不變的序列往往承擔(dān)著極其重要的功能，一旦出現(xiàn)變化，功能就會(huì)受影響或者被破壞，物種就有被淘汰的危險(xiǎn)。因此，保持不變或變化很小的序列可能具有相同的功能。國(guó)際上已有專門的數(shù)據(jù)庫(kù)（如Blocks、PROSITE和IDENTIFY）和分析軟件（如BLAST、DNAsis、FASTA、GCG、MOST、Emotif和Tool）用于保守序列的分析。

本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)歐文氏桿菌基因組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了71個(gè)與鐵代謝相關(guān)的基因，分別參與了歐文氏桿菌中鐵載體的生物合成以及鐵的運(yùn)輸、吸收、貯存和調(diào)控。

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第3篇：生物信息學(xué)分析范文

關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌；pst S1基因；擴(kuò)增；生物信息學(xué)

結(jié)核?。═uberculosis， TB ）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis， MTB）所致的、以呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性傳染病。世界衛(wèi)生組織全球結(jié)核病疫情報(bào)告表明，當(dāng)前結(jié)核病已成為可治性感染疾患中頭號(hào)致死疾病[1]。到目前為止對(duì)結(jié)核分枝桿菌的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多特異性的抗原，但還沒有一個(gè)單抗原能達(dá)到WHO對(duì)結(jié)核診斷抗原的陽(yáng)性率要求，即總陽(yáng)性率大于80%，特異性大于95%[2]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白Pst S1是比較重要和相對(duì)特異的一種抗原，可引起特異的保護(hù)性免疫反應(yīng)。因此，可用作亞單位疫苗。本研究對(duì)pst S1基因進(jìn)行擴(kuò)增，利用生物信息學(xué)方法對(duì)該基因進(jìn)行分析，為構(gòu)建新型結(jié)核疫苗、制造診斷試劑和設(shè)計(jì)藥物靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量marker、2×PCR Master Mix、細(xì)菌基因組提取試劑盒、DNA電泳凝膠回收試劑盒購(gòu)自Promega公司，Agarose購(gòu)自西班牙，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，結(jié)核分枝桿菌為濰坊市第二人民醫(yī)院患者體內(nèi)分離。

1.2方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank報(bào)道的結(jié)核分枝桿菌pst S1基因序列，自行設(shè)計(jì)特異性引物，序列如下：P1：gtggaattcgtgaaaattcgtttgcat； P2：atactcgaggctggaaatcgtcgcgat。均由上海生物工程公司合成。

1.2.2 結(jié)核分枝桿菌基因組DNA的提取

將結(jié)核分枝桿菌接種于蘇通液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)4周，取3ml培養(yǎng)物80℃，滅活2h，按照細(xì)菌基因組提取試劑盒的操作說明操作（該步在市疾病預(yù)防控制中心生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室中完成）。

1.2.3 pst S1基因的擴(kuò)增和生物信息學(xué)分析

以MTB基因組DNA為模板，按照常規(guī)PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，61℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，循環(huán)30次，72℃延伸8min。將擴(kuò)增出的pst S1基因送上海生物公司進(jìn)行測(cè)序，然后利用DNA Star5. 0軟件中對(duì)pst S1基因的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，測(cè)其蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

2結(jié)果

2.1 pst S1基因的測(cè)序結(jié)果及編碼蛋白的分子特征

測(cè)序結(jié)果表明， 擴(kuò)增的pst S1基因的全長(zhǎng)1112bp， 與GenBank中公布的標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的pst S1基因的核酸序列相比較同源性為92.7%。GC含量為64.95%，編碼362個(gè)氨基酸。推導(dǎo)出的蛋白分子質(zhì)量約為38kD，含有74個(gè)強(qiáng)堿性氨基酸（K，R），28個(gè)強(qiáng)酸性氨基酸（D，E），101個(gè)疏水性氨基酸（A， I， L， F，W，V），68個(gè)極性氨基酸（N，C，Q， S，T，Y），等電點(diǎn)為11.989。

2.2pst S1基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及可讀框分析

用Chou-Fasman法分析Pst S1基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，可見有11個(gè)α螺旋、5個(gè)β折疊和32個(gè)β轉(zhuǎn)角。一般認(rèn)為α螺旋、β折疊結(jié)構(gòu)較規(guī)則，形態(tài)固定，常處于蛋白質(zhì)的內(nèi)部；而β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲多處于蛋白質(zhì)的表面，有利于抗體空間構(gòu)象上與抗原的嵌合，其膜外的β轉(zhuǎn)角可能是具有較強(qiáng)免疫原性的區(qū)域，見圖1。通過分析還可見該基因含有多個(gè)ORF，其中最長(zhǎng)的一個(gè)是756bp，可能是編碼序列。

2.3 pst S1基因的親水性、疏水性以及抗原性分析

運(yùn)用生物信息學(xué)軟件DNAstar6.0的Protean對(duì)pst S1基因表達(dá)蛋白的親水性和疏水性預(yù)測(cè)分析，表明pst S1基因的含有多個(gè)較強(qiáng)的親水區(qū)，可能是形成抗原表位的重要部位。用Jameson-Wolf方法抗原性分析顯示pst S1有多個(gè)明顯的具有抗原活性的結(jié)構(gòu)域 ，抗原性指數(shù)最強(qiáng)為1.7，結(jié)合Hopp-Woods方法進(jìn)行親水性分析，表明這些結(jié)構(gòu)域的親水性普遍較強(qiáng)，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示該基因含有大量β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，結(jié)合AMPHI方法預(yù)測(cè)該基因含有21個(gè)免疫優(yōu)勢(shì)輔T淋巴細(xì)胞抗原位點(diǎn)，7個(gè)含有特定基序（motif）的潛在T 淋巴細(xì)胞抗原決定簇。綜合上述分析，表明這個(gè)基因可能含有良好的抗原

3討論

在結(jié)核分枝桿菌已發(fā)現(xiàn)的特異性抗原中，Pst S1抗原是目前公認(rèn)的血清學(xué)診斷的最佳單抗原，并發(fā)展有多個(gè)商品化的試劑盒[3]。Pst S1蛋白是一種磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 [4]，以膜蛋白和分泌蛋白的形式存在，能刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，特異性較強(qiáng)。通過分析發(fā)現(xiàn)，該株結(jié)核桿菌與GenBank中公布的標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的pst S1基因的核酸序列相比較同源性為92.7%，變異程度較?。辉摶蚓幋a蛋白含有多個(gè)β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，有利于抗體空間構(gòu)象上與抗原的嵌合；含有多個(gè)明顯的具有抗原活性的結(jié)構(gòu)域和免疫優(yōu)勢(shì)輔T 淋巴細(xì)胞抗原位點(diǎn)，抗原性較強(qiáng)；并且該菌株的生物學(xué)特性與其它株相比基本相同，對(duì)常見的抗結(jié)核藥物具有耐藥性。所以該菌株具有一定的代表性，其分泌蛋白不僅可能是治療結(jié)核病的新的切人點(diǎn)，而且有可能作為新型亞單位疫苗用于防止結(jié)核病復(fù)發(fā)。本研究成功擴(kuò)增了Pst S1基因，為地方結(jié)核病的防治以及進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能和潛在的臨床應(yīng)用前景奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]WHO.Global tuberculosis control：surveillance，planning，finacing[J].Geneva：World Health Organization，2006：242.

[2]Julian E，Matas L，Alcaide J，et parison of antibody response to a potential combination of specific glycolipids and proteins for test sensitivity improvement in tuberculosis serodiagnosis [J].Clin Diagn Lab Immunol， 2004，11（1）：70-76.

第4篇：生物信息學(xué)分析范文

【摘要】 目的：從歐猥迭宮絳蟲成蟲cDNA文庫(kù)中識(shí)別出膜聯(lián)蛋白E1（Annexin E1）基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和功能預(yù)測(cè)。方法：從歐猥迭宮絳蟲cDNA文庫(kù)中獲取Annexin E1基因的核酸序列，應(yīng)用NCBI、ExPASy等多種生物信息學(xué)在線分析工具結(jié)合Vector NTI Advance 10、Geneious Pro等軟件包，對(duì)所獲基因及其編碼蛋白的基本理化特征、亞細(xì)胞定位、保守功能域、抗原表位、二級(jí)結(jié)構(gòu)及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測(cè)，建立蛋白質(zhì)三級(jí)空間結(jié)構(gòu)模型及構(gòu)建其分子進(jìn)化樹。結(jié)果：Annexin E1編碼354個(gè)氨基酸殘基，理論分子量為40168.0Da，具有4個(gè)完整的保守功能域。位于細(xì)胞內(nèi)，無信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)，存在6個(gè)潛在抗原表位。二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α 螺旋為主，結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)的位點(diǎn)高度保守，具有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)。在進(jìn)化的過程中與絳蟲類親緣較近，而與脊椎類親緣較遠(yuǎn)。結(jié)論：Annexin E1編碼蛋白及潛在的抗原表位與宿主同源性低，可能作為研發(fā)新型免疫診斷方法的理想分子靶標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】 歐猥迭宮絳蟲；膜聯(lián)蛋白；結(jié)構(gòu)；功能；生物信息學(xué)

［ABSTRACT］ Objective: To identify the Annexin E1 gene from cDNA library of Spirometra erinaceieuropaei adult worm and predict its structure and function by applying the bioinformatics. Methods: Nucleic acid sequences of Annexin E1 gene was obtained from cDNA library of Spirometra erinaceieuropaei， and application tools were provided by bioinformatics websites and other bioinformatics software packages such as Vector NTI Advance 10， Geneious Pro etc. The status of encoded proteins were predicted including the basic physical and chemical properties， subcellular localization， conservative functional domains， domains， antigenic epitopes， secondary structure and topology， etc. Besides， tertiary structure of the protein was established based on homology modeling， undertook multisequence homological alignment and phylogenetic analysis. Results: Annexin E1 encoded 354 amino acid residues with a theoretical molecular 40168.0Da. The main secondary structure was αhelix with four complete conservative domains. Structure and function of the highly conserved sites were with multiple phosphorylation sites. It contained no signal peptide and transmembrane helices， six potential antigenic epitopes， locates outside of membrane. In evolution， it was close relative to tapeworm and distant relative to the vertebrate. Conclusions: Homology is low between encoded protein and potential antigen epitopes of Annexin E1 and host′s， it might be a desirable molecular target for immunological tests.

［KEY WORDS］ Spirometra erinaceieuropaei; Annexin; Structure; Function; Bioinformatics

歐猥迭宮絳蟲（Spirometra erinaceieuropaei）又名曼氏迭宮絳蟲（Spirometra mansoni），是迭宮屬寄生蟲研究的重要模式生物，寄生于人體可引起裂頭蚴病［1］。Annexin是一類鈣依賴的磷脂結(jié)合蛋白超家族，廣泛分布于各種真核生物細(xì)胞中，約占細(xì)胞總蛋白質(zhì)的2%左右，具有多種生物學(xué)功能，在細(xì)胞中主要參與膜轉(zhuǎn)運(yùn)及膜表面一系列依賴于鈣調(diào)蛋白的活動(dòng)。Annexin超家族各成員在結(jié)構(gòu)上具有高度保守性，C端均具有由約70個(gè)氨基酸殘基組成的4個(gè)保守重復(fù)序列，而其N末端由于氨基酸序列、長(zhǎng)度不同而功能各異［2］。目前，國(guó)內(nèi)、外關(guān)于寄生蟲Annexin基因家族的研究較少，其具體生物學(xué)功能尚不清楚。本研究在構(gòu)建歐猥迭宮絳蟲成蟲全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)、5′端表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）測(cè)序的基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)方法對(duì)歐猥迭宮絳蟲Annexin E1基因及編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行了理化性質(zhì)、物種進(jìn)化、空間結(jié)構(gòu)等分析及預(yù)測(cè)，為其重組蛋白表達(dá)、純化及作為研發(fā)新型免疫診斷抗原的侯選分子靶標(biāo)等研究提供基礎(chǔ)。

鄔強(qiáng)等.歐猥迭宮絳蟲膜聯(lián)蛋白E1基因的生物信息學(xué)分析

1 材料與方法

1.1 材料

歐猥迭宮絳蟲Annexin E1基因源自歐猥迭宮絳蟲成蟲的cDNA文庫(kù)，通過EST 5′端大規(guī)模隨機(jī)測(cè)序，歸并unigene后進(jìn)行初步生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)基因號(hào)GDTC004_G12的氨基酸水平與Annexin家族高度相似性，且5′端完整，然后進(jìn)行3′端延長(zhǎng)測(cè)序至Poly（A）拼接獲得。其他寄生蟲及模式生物的Annexin核酸序列及蛋白質(zhì)序列均源自美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)，所獲物種及Genbank序列號(hào)為：豬帶絳蟲（Taenia solium， AY998562.1）、日本血吸蟲（Schistosoma japonicum， FN315079.1）、馬來絲蟲（Brugia malayi， XP_001894032）、黑腹果蠅（Drosophila melanogaster， NM_167519.1）、秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans， AAA99775）斑馬魚（Danio rerio， AAI54294）、擬南芥（Arabidopsis thaliana， NP_196584）、非洲爪蟾（Xenopus laevis， NP_001082442.1）、原雞（Gallus gallus， XM_421623.2）、小鼠（Mus musculus， NM_009674.3）、人（Homo sapiens， BT007975.1）。

1.2 方法

將基因的核苷酸、編碼氨基酸序列與Genbank中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，鑒定其來源，判斷與其他物種基因的一致性及是否為全長(zhǎng)；將該蛋白氨基酸序列進(jìn)行多序列同源比對(duì)分析，并與其他物種的Annexin進(jìn)行比對(duì)，用Geneious Pro 4.8.2以NJ法構(gòu)建出分子進(jìn)化樹；采用蛋白質(zhì)專家分析工具ExPASy和Vector NTI Advance 10對(duì)蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)；應(yīng)用TargetP、Tmpred和PredictProtein等程序?qū)Φ鞍踪|(zhì)的亞細(xì)胞定位、跨膜和信號(hào)肽情況進(jìn)行推測(cè)；通過Motif scan、InterproScan、ScanProsite、Pfam及BepiPred等對(duì)模體、功能域、催化位點(diǎn)、抗原表位等進(jìn)行預(yù)測(cè)；運(yùn)用PredictProtein、COILS等工具對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；在SWISSMODEL中尋找空間結(jié)構(gòu)同源模板，優(yōu)化產(chǎn)生該蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型，并用Rastop軟件進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 保守功能域、蛋白質(zhì)功能基序、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

利用Blastn進(jìn)行核酸水平相似性的搜索，沒有得到與該基因序列高度相似的基因。經(jīng)ORF finder程序?qū)ふ议_放閱讀框架，顯示該基因全長(zhǎng)為1250bp，編碼區(qū)為50～1112bp，編碼354個(gè)氨基酸，具Poly（A）尾，具體序列如下。

該氨基酸序列具有4個(gè)完整的保守功能域（3196aa， 103176aa， 208274aa， 284348aa），為全長(zhǎng)基因，確定為Annexin家族成員（已提交Genbank，Accession: HM572242），見圖1。

圖1 Annexin E1保守功能域結(jié)構(gòu)

2.2 Annexin E1與其他物種Annexin氨基酸序列多序列比對(duì)、同源性及分子進(jìn)化分析

海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào) Vol.16 No.9 Sep.2010

Annexin E1氨基酸序列與其他物種Annexin氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，在多個(gè)氨基酸位點(diǎn)上各物種間完全相同，高度保守。Blastp氨基酸序列相似性分析結(jié)果表明，歐猥迭宮絳蟲Annexin E1與豬帶絳蟲、日本血吸蟲的相似性最高，分別為60.4%、42.3%，而與人、小鼠等脊椎動(dòng)物的相似性最低，均低于33.2%。選取了11個(gè)代表性物種的膜聯(lián)蛋白，使用Geneious Pro 4.8.2軟件用NJ算法構(gòu)建出分子進(jìn)化樹，見圖2。結(jié)果表明歐猥迭宮絳蟲Annexin E1與脊椎動(dòng)物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而與其他寄生蟲的親緣關(guān)系接近。

圖2 annexin E1蛋白分子進(jìn)化樹

2.3 蛋白質(zhì)的基本理化性征

通過Expasy的protprom工具及Vector NTI Advance 10軟件可得出以下的預(yù)測(cè)結(jié)果，Annexin E1編碼354個(gè)氨基酸，理論分子質(zhì)量為40168.0 Da，理論等電點(diǎn)為6.28，理論分子式為C1773H2858N486O544S15，天冬氨酸和谷氨酸共51個(gè)，精氨酸和賴氨酸共49個(gè)。280nm處水溶液中消光系數(shù)在35870和36120之間，如果成熟的Annexin E1蛋白N末端為甲硫氨酸時(shí)，在體外的哺乳動(dòng)物網(wǎng)狀細(xì)胞中的半衰期為30h，在酵母菌和大腸桿菌中半衰期分別為20h和10h。不穩(wěn)定系數(shù)為39.95，可認(rèn)為是穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)為90.40，總平均親水性為0.504，說明該蛋白為疏水蛋白。

2.4 細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位、信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)及潛在抗原表位的預(yù)測(cè)

經(jīng)targetP1.1 server分析，Annexin E1蛋白存在于胞內(nèi)，不在線粒體中，無信號(hào)肽序列，為非分泌性蛋白質(zhì)。將Annexin E1蛋白通過TMHMM 2.0分析，該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)。利用TMpred等對(duì)細(xì)胞的親水、疏水性分析，Annexin E1大部分肽段基本上都具有較強(qiáng)的疏水性。經(jīng)BepiPred分析，該蛋白質(zhì)可能存在6個(gè)潛在抗原線性表位（232aa， 149164aa， 179200aa， 246254aa， 260268aa， 333341aa）。與人Annexin家族進(jìn)行同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，位于232aa位點(diǎn)的潛在表位的相似性最低，低于9.4%，故可能是較為理想的特異性診斷抗原表位。

2.5 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

Annexin E1氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示其以α 螺旋為主，占62.15%，β折疊、轉(zhuǎn)角占2.54%，無規(guī)則卷曲占35.31%，見圖3。

注：第一行為編號(hào)，第二行為氨基酸序列，第三行代表預(yù)測(cè)結(jié)果，其中H代表α螺旋，E代表β折疊、轉(zhuǎn)角，···代表無規(guī)則卷曲，L代表環(huán)形loop結(jié)構(gòu)。

圖3 annexin E1二級(jí)結(jié)構(gòu)

2.6 蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

在SWISSMODEL中找到一個(gè)同源性最高的模板1wa3a，其同源性為39%，可根據(jù)其晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模［3］。進(jìn)行再次比對(duì)，保守部位對(duì)齊，調(diào)整主鏈中各原子的位置，進(jìn)行模型優(yōu)化，產(chǎn)生其空間結(jié)構(gòu)模型，見圖4。4個(gè)保守功能域均由α螺旋組成，以黃色螺旋標(biāo)出。232aa段抗原表位在圖中以紅色部分標(biāo)出?？乖砦簧线€包括了一個(gè)依賴蛋白激酶C的磷酸化位點(diǎn)，以藍(lán)球標(biāo)出。

圖4 annexin E1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)

3 討論

Annexin超家族由超過1000種不同基因表達(dá)產(chǎn)物組成，廣泛存在于大多數(shù)真核生物細(xì)胞中，物種間高度保守［4］。目前Annexin超家族可以分為A、B、C、D、E 5個(gè)家族，E族主要存在于各類寄生蟲細(xì)胞，故本研究中將新發(fā)現(xiàn)的歐猥迭宮絳蟲Annexin命名為Annexin E1。近年來國(guó)內(nèi)、外研究發(fā)現(xiàn)Annexin具有多種生物學(xué)功能，包括胞吐作用中的膜融合、囊泡運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、鈣離子通道的形成、調(diào)控炎性反應(yīng)、參與凝血過程、參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化和細(xì)胞骨架蛋白間的相互作用等［5］。采用基因抑制、基因敲除及RNA干擾等技術(shù)提示了不同Annexin的生物功能的新見解。目前，對(duì)Annexin家族的研究主要集中在A家族，即脊椎動(dòng)物的Annexin，其與心血管疾病、腫瘤、炎癥、糖尿病及自身免疫病等密切相關(guān)，而對(duì)其他4個(gè)家族的Annexin研究甚少［6］。Zhang等［7］從豬帶絳蟲續(xù)絳期cDNA文庫(kù)中克隆出Annexin B1，證明其為研發(fā)預(yù)防囊尾蚴病疫苗的有效保護(hù)性抗原，并參與類似脊椎動(dòng)物Annexin的炎癥、細(xì)胞凋亡過程。后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)Annexin B1可被分泌到細(xì)胞外，與人嗜酸性細(xì)胞膜結(jié)合致使鈣離子流入并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，很可能是豬帶絳蟲抵制宿主防御的新機(jī)制［8］。

本研究通過對(duì)歐猥迭宮絳蟲Annexin E1基因進(jìn)行生物學(xué)信息學(xué)分析和預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該蛋白屬于Annexin家族的一員，具有很高的種屬特異性。與該家族的其他成員一樣，具有位于C端由4個(gè)功能域組成的中心結(jié)構(gòu)域，呈圓盤狀，具有凸面和凹面。其中凸面包含膜磷脂結(jié)合位點(diǎn)及鈣離子結(jié)合位點(diǎn)，面向細(xì)胞膜。N端位于圓盤結(jié)構(gòu)的凹面，包括蛋白水解位點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)及細(xì)胞質(zhì)蛋白結(jié)合位點(diǎn)，為膜聯(lián)蛋白的調(diào)節(jié)區(qū)［9］。該蛋白不存在于細(xì)胞膜上，不含信號(hào)肽，不是分泌蛋白，這也其他Annexin家族一致。其是否可發(fā)生類似Annexin A族及豬帶絳蟲Annexin B1不依賴信號(hào)肽而轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞的現(xiàn)象，尚待其他研究來證實(shí)。

人體裂頭蚴病主要依靠從局部檢查出蟲體作出診斷，應(yīng)用裂頭蚴粗抗原作為免疫輔助診斷，臨床誤診率較高，若有特異的診斷性抗原，就能及早診斷、治療。歐猥迭宮絳蟲Annexin E1的二級(jí)結(jié)構(gòu)含有無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，說明其有成為抗原的潛力。本研究發(fā)現(xiàn)Annexin E1與人Annexin家族各成員的同源性均低于25%，其潛在的主要抗原表位（232aa段）與同區(qū)域宿主蛋白的同源性更低，故可以利用基因重組技術(shù)，將其制成重組抗原，或是合成含有特征抗原決定簇的多肽抗原，相對(duì)于傳統(tǒng)的抗原物質(zhì)，其特異性、敏感性很可能更高，繼而可研制出合適的新型診斷性抗原。

參考文獻(xiàn)

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第5篇：生物信息學(xué)分析范文

【關(guān)鍵詞】 sla?dr基因; 湖南大圍子豬; 基因克隆; 異種移植

cloning and bioinformatics analysis of sla?dr genes in hunan daweizi pigs

wang yan1, xing xiao?wei1, xue li?qun2, huang sheng?qiang2, wu xiao?li1, wang wei1*

1cell transplantation & gene therapy center, third xiangya hospital of central south university, changsha 410013; 2department of animal science and technology, hunan agriculture university, changsha 410128, china

[abstract] aim: to evaluate the potential of daweizi pigs as xenotransplantation dnors from pigs to humans by analyzing the characteristics of sla?dr genes in hunan daweizi pigs. methods: sla?dra and sla?drb genes were amplified by rt?pcr, cloned into pucm?t vectors, sequenced and analyzed through blast in ncbi and related software in expasy. results: the sla?dra and sla?drb genes were 1 177 bp and 909 bp nucleotides in length, which contain opening reading frame (orf) and encode 252 and 266 amino acids respectively. comparing the sla?dra and sla?drb genes with their counterpart sequences of human, the homologies of amino acid sequences were 82% and 73% respectively. the amino acids in sla dr α chain of daweizi pigs from position 124 to 136, which bind to human cd4, showed only two differences with hla dra: a lleval change at position 127 and a serthr change at position 136. the amino acids in sla dr β chain of daweizi pigs from position 134 to 148, which bind to human cd4, were identical with hla?drb. further comparison with sla sequences published in genbank indicated that sla?drb gene found in daweizi pigs has polymorphism while the homology of sla?dra gene is up to 100%. conclusion: the cloned sla?dra and sla?drb in hunan daweizi pigs has high polymorphism with hla?dra and hla?drb in human, indicates that daweizi pigs have some advantages as xenotransplantation dnors from pigs to humans.

[keywords]swine leukocyte antigen dr allele (sla?dr); daweizi pigs; gene cloning; xenotransplantation

同種異體器官移植已成為治療終末期器官衰竭的一種有效手段, 豬被認(rèn)為是異種移植最理想的供體來源[1]。然而, 如何解決免疫排斥問題仍是阻礙臨床大規(guī)模應(yīng)用的主要問題之一[2]。豬的主要組織相容性復(fù)合體(majorhistocompatibility complex, mhc), 又稱作豬白細(xì)胞抗原(swine leukocte antigen, sla), 是由緊密連鎖的高度多態(tài)基因座所組成的染色體的一個(gè)遺傳區(qū)域, 它作為主要組織抗原, 參與移植排斥反應(yīng), 是引起異種移植急性細(xì)胞性排斥的主要遺傳因素[3]。通過對(duì)供體豬種進(jìn)行篩查, 盡可能選擇與人類mhc同源性較高的豬種將有助于提高異種移植物在人體內(nèi)的存活時(shí)間, 為臨床大規(guī)模開展將豬器官或細(xì)胞異種移植到人提供理想的供體豬種來源。

中國(guó)具有豐富的豬種種質(zhì)資源, 不同的地域分布形成了豬種的多樣性和遺傳的相對(duì)穩(wěn)定性, 為異種移植提供了可貴的研究和利用資源[4]。湖南大圍子豬是我國(guó)特有的地方豬種之一, 亦是湖南省著名地方優(yōu)良豬種, 具有繁殖力強(qiáng)、 抗逆性強(qiáng)、 耐粗飼、 肉質(zhì)好、 生長(zhǎng)慢、 飼料效率高等種質(zhì)性狀。但是, 大圍子豬能否作為異種移植的供體, 尤其是該豬種細(xì)胞表面sla特性如何, 目前尚不清楚。本研究將克隆湖南大圍子豬sla?dr基因, 分析其sla?dra和sla?drb基因特性, 比較與人cd4 分子結(jié)合部位大圍子豬sla?dr編碼氨基酸與人類相應(yīng)dra、 drb的同源性, 為評(píng)價(jià)湖南大圍子豬在異種移植中的應(yīng)用前景, 提供免疫學(xué)方面的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 總rna抽提試劑盒購(gòu)自美國(guó)gentra公司; cdna第一鏈合成試劑盒購(gòu)自fermentas 公司; pucm?t載體、 引物、 電泳試劑等購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司; pcr高保真克隆酶easy?a購(gòu)自stratagene公司; dna marker(100 bp ladder)購(gòu)自晶美生物工程公司; 湖南大圍子豬來自湖南望城大圍子豬保種基地。

1.2 方法

1.2.1 湖南大圍子豬sla?dra和sla?drb基因引物設(shè)計(jì) 根據(jù)genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中已登錄的明尼蘇達(dá)小型豬(minnesota miniature swine)的sla?dr序列(登錄號(hào)為m93028, ab205163), 采用pcrdesn軟件設(shè)計(jì)以下引物。sla?dra: 上游引物 : 5′?ggc atc taa gga gaa aat gac?3′; 下游引物: 5′?cca ctc aaa gtt tat tgt att cag?3′, 預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為1 177 bp; sla?drb: 上游引物: 5′?ttg tcc tct cct gtt ctc cag?3′; 下游引物: 5′?tag gac gca gag cat agc agg?3′, 預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為909 bp。

1.2.2 rt?pcr擴(kuò)增湖南大圍子豬sla?dra和sla?drb基因 在湖南大圍子豬保種群中隨機(jī)挑選兩頭個(gè)體, 以700 ml/l乙醇消毒耳尖取耳樣組織, 按rna抽提試劑盒(gentra公司)說明書方法提取總rna。測(cè)定每一樣品總rna的濃度, 模板定量為1 μg rna, 按revertaidtm first strand cdna synthesis kit說明書方法逆轉(zhuǎn)錄合成cdna第一鏈。以合成的cdna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增, 20 μl pcr反應(yīng)體系中, 分別加入下列物質(zhì): depc處理水13.5 μl, pcr緩沖液2 μl, 25 mmol/l mgcl2 1.6 μl, 10 mmol/l dntp混合物0.5 μl, 50 mmol/l上、 下游引物各0.2 μl, 模板1.6 μl, easy?a 高保真酶0.4 μl。在pe9700 型pcr 擴(kuò)增儀上完成pcr擴(kuò)增, 擴(kuò)增條件如下: 先95℃預(yù)變性2 min 30 s, 94℃變性40 s, 58℃～59℃退火40 s, 72℃延伸40 s, 完成35個(gè)循環(huán), 最后72℃延伸5 min, 置 4℃保溫。取3.5 μl pcr擴(kuò)增產(chǎn)物, 1.5 g/l瓊脂糖凝膠電泳, 以鑒定pcr擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.3 湖南大圍子豬sla?dra和sla?drb基因克隆與鑒定 連接反應(yīng)在10 μl體系中進(jìn)行: 雙蒸水3 μl、 pcr產(chǎn)物1 μl、 pucm?t載體1 μl混勻后加入5 μl solutionⅰ, 16℃水浴連接過夜, 轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌jm109(采用cacl2法制備), 4℃靜置30 min后放入42℃水浴中熱休克90 s, 加入300 μl預(yù)熱的lb培養(yǎng)基, 37℃下振蕩培養(yǎng)(200 r/min) 45 min, 將菌液平鋪于含氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上, 37℃恒溫箱中培養(yǎng)過夜。挑取單克隆, 在含氨芐青霉素200 mg/l的液體lb培養(yǎng)基中培養(yǎng), 以菌液為模板, pcr鑒定為陽(yáng)性克隆, 抽提質(zhì)粒, 送上海英駿生物技術(shù)有限公司雙向測(cè)序。

1.2.4 湖南大圍子豬sla?dra和sla?drb基因生物信息學(xué)分析 用ncbi homepage中的orf對(duì)湖南大圍子豬sla?dra和sla?drb基因的開放閱讀框進(jìn)行識(shí)別; 用expasy服務(wù)器中的prosite scan軟件對(duì)sla?dra和sla?drb基因的功能域進(jìn)行預(yù)測(cè); 用ncbi中的blast及expasy服務(wù)器中的clustalw等軟件對(duì)獲得的sla?dra和sla?drb基因的序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果

2.1 湖南大圍子豬sla?dra和sla?drb基因rt?pcr擴(kuò)增結(jié)果 rt?pcr擴(kuò)增結(jié)果顯示, 兩頭湖南大圍子豬sla?dra和sla?drb均有特異性擴(kuò)增條帶, 大小分別為1 177 bp和909 bp, 與預(yù)期擴(kuò)增片段大小一致(圖1)。

2.2 湖南大圍子豬sla?dra基因測(cè)序結(jié)果 測(cè)序大圍子豬sla?dra基因, 結(jié)果表明: 來源于兩個(gè)不同個(gè)體的sla?dra基因序列是一致的, 其cdna全長(zhǎng)均為1 177 bp, 包含一個(gè)759 bp的完整的開放閱讀框, 推測(cè)編碼252個(gè)氨基酸。生物信息分析發(fā)現(xiàn), sla?dra第1～23 位氨基酸為信號(hào)肽, 第24～107位氨基酸為α1 功能區(qū), 第108～202位氨基酸為α2 功能區(qū), 第203～252位氨基酸為穿膜和胞漿功能區(qū)。推測(cè)sla?dra蛋白中有1個(gè)camp和cgmp依賴的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn), 6個(gè)n?肉蔻?；稽c(diǎn), 2個(gè)n?糖基化位點(diǎn), 2個(gè)蛋白激酶c磷酸化位點(diǎn), 1個(gè)酪蛋白激酶ⅱ磷酸化位點(diǎn)。

2.3 湖南大圍子豬sla?drb測(cè)序結(jié)果 測(cè)序大圍子豬sla?drb基因, 結(jié)果表明: 來源于兩個(gè)不同個(gè)體的sla?drb基因序列是一致的, 其cdna 全長(zhǎng)為909 bp, 包含一個(gè)完整的開放閱讀框, 大小為801 bp, 推測(cè)編碼266個(gè)氨基酸。生物信息分析發(fā)現(xiàn), sla?drb蛋白序列第1～29 位氨基酸為信號(hào)肽, 第30～123 位氨基酸為α1 功能區(qū), 第124～217 位氨基酸為α2 功能區(qū), 第218～266位氨基酸為穿膜和胞質(zhì)功能區(qū)。推測(cè)sla?drb蛋白包括3個(gè)n?肉蔻?；稽c(diǎn), 1個(gè)n?糖基化位點(diǎn), 3個(gè)蛋白激酶c磷酸化位點(diǎn), 1個(gè)酪蛋白激酶ⅱ磷酸化位點(diǎn)。

2.4 湖南大圍子豬sla?dr與人類相應(yīng)hla?dr同源性比較 大圍子豬sla?dra與人類的hla? dra(bc071659)相比較, 在核苷酸水平同源性為88%, 編碼的氨基酸序列同源性為82%。sla dr α鏈與人cd4 分子結(jié)合部位介于第124至136位氨基酸, 大圍子豬sla?dra在此結(jié)合區(qū)域與人類相應(yīng)的dra存在兩個(gè)氨基酸差異, 即: 第127 位(vallle), 第136位(thrser)(圖2)。

大圍子豬sla?drb與人類的hla?drb*09012(ay622551)相比較, 在核苷酸水平同源性為82%, 編碼的氨基酸序列同源性為73%。sla dr β 鏈與人cd4 分子結(jié)合部位位于第134至148位氨基酸, 大圍子豬sla?drb在此結(jié)合區(qū)域與人類相應(yīng)的drb相比氨基酸序列源性為100%(圖3)。

2.5 湖南大圍子豬sla?dr基因與genbank里其它豬種序列同源性比較 大圍子豬與nih小型豬d單倍型(m93028)、 湖南沙子嶺豬(ef143987) sla?dra編碼的氨基酸同源性為100%, 與genbank里已發(fā)表的其它豬種的相應(yīng)基因比較, 同源性高達(dá)99%以上。大圍子豬sla?drb基因與genbank登錄的許多豬種核苷酸和氨基酸序列同源性分別是93%～95%, 89%～95%, 并根據(jù)氨基酸比較結(jié)果建立種系進(jìn)化樹(圖4)。

3 討論

免疫排斥反應(yīng)仍是目前異種移植面臨的最大難題, 其中供受體組織相容性是研究異種移植排斥反應(yīng)的關(guān)鍵問題。因此, 組織相容性復(fù)合物即白細(xì)胞抗原是篩選供體時(shí)必須考慮的因素。異種豬抗原(主要是豬白細(xì)胞抗原sla)是引起異種移植t淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性細(xì)胞性排斥反應(yīng)的主要遺傳因素[2]。sla被人t淋巴細(xì)胞識(shí)別存在直接識(shí)別和間接識(shí)別途徑[3]。在直接識(shí)別途徑中, 豬sla?ⅱ類抗原經(jīng)自身抗原提呈細(xì)胞(apc)處理, 提呈給人cd4+t輔助細(xì)胞參與免疫排斥反應(yīng)。人t細(xì)胞對(duì)豬異種抗原的間接識(shí)別是指豬的異種抗原以外源性蛋白質(zhì)抗原的方式為人apc攝取、 加工后, 引起人特異性cd4+ t細(xì)胞的激活與效應(yīng)。在異種移植細(xì)胞性排斥反應(yīng)中, 異種抗原被人t細(xì)胞識(shí)別到底哪種識(shí)別途徑占優(yōu)勢(shì)目前尚不清楚。andres等[5]認(rèn)為在異種胰島移植中, 種系差異越小直接識(shí)別途徑占優(yōu)勢(shì), 種系差異越大、 間接識(shí)別途徑占優(yōu)勢(shì)。因此, 對(duì)sla?ⅱ類基因的深入研究將有助于豬人異種器官移植的供受體配型選擇, 有助于攻克異種移植排斥反應(yīng), 篩選異種移植供體。

目前, 國(guó)內(nèi)外都積極致力于研究各豬種的sla, 篩選異種移植供體, 更好的為異種移植應(yīng)用于臨床服務(wù)。國(guó)外對(duì)yucatan小型豬[6]、 westran豬[7]等, 國(guó)內(nèi)對(duì)中國(guó)西雙版納微型豬[8]、 湖南沙子嶺豬[9]、 廣西豬、 貴州香豬、 云南小耳豬[10, 11]等豬種作為研究模型, 通過克隆、 測(cè)序分析sla基因, 研究sla在異種移植排斥反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制中的作用。吳群等[12]對(duì)中國(guó)海南五指山豬進(jìn)行研究, 指出五指山豬種在與人類mhc遺傳基因水平相似性方面有一定優(yōu)勢(shì); 在與人cd4相結(jié)合部位, 五指山豬sla?drb參與結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基與人類完全相同, 并且通過基因工程對(duì)五指山豬sla?dra分子兩個(gè)不同的氨基酸殘基進(jìn)行必要的修飾和改造, 使其成為理想的異種移植供體。

湖南大圍子豬是湖南省著名的地方優(yōu)良豬種, 具有繁殖力強(qiáng)、 抗逆性強(qiáng)、 耐粗飼、 肉質(zhì)好、 生長(zhǎng)慢、 飼料效率高等種質(zhì)性狀。本研究首次克隆湖南大圍子豬的sla?dra和sla?drb序列。sla位于豬的第七號(hào)染色體, 由i類、 ⅱ類和ⅲ類3個(gè)基因簇組成。sla?i類基因和sla?ⅲ類基位于7號(hào)染色體的短臂, sla?ⅱ類基因則位于染色體長(zhǎng)臂上。研究表明: sla?ⅱ類抗原的基因主要有β鏈基因和α鏈基因兩種, 分別編碼sla?i類抗原的β肽鏈和α肽鏈。編碼sla?ⅱ類抗原β鏈的基因座sla?dr和sla?dq已被證明存在顯著的等位基因多態(tài)性, 而這種多態(tài)性與sla?ⅱ類抗原的生物學(xué)特性又是密切相關(guān)。生物信息分析發(fā)現(xiàn), sla?dra基因?yàn)楦叨缺Ｊ匦蛄? 各豬種間dra基因同源性高達(dá)99%以上, 而sla?drb基因在各豬種間具有豐富的多態(tài)性, 這一結(jié)論與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

大圍子豬sla?dra 和sla?drb 與人類相應(yīng)的dra、 drb相比, 氨基酸同源性分別為82%和73%。人cd4分子在排斥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用, sla dr α鏈與人cd4 分子結(jié)合部位介于第124～136 位氨基酸, 大圍子豬sla?dra在該結(jié)合區(qū)域與人類相應(yīng)的dra存在兩個(gè)氨基酸差異, 即: 第127 位(lleval), 第136 位(serthr); sla dr β鏈與人cd4 分子結(jié)合部位位于第134至148位氨基酸, 大圍子豬sla?drb在該結(jié)合區(qū)域與人類相應(yīng)的drb相比氨基酸序列同源性為100%。該結(jié)果說明, 湖南大圍子豬sla?dr基因與人的相應(yīng)基因組織相容性較好, 可在異種移植排斥反應(yīng)中以直接識(shí)別途徑即人cd4+t細(xì)胞直接識(shí)別豬細(xì)胞表面的sla?ⅱ分子。

總之, 通過本研究首次成功克隆了湖南大圍子豬sla?dra 和sla?drb基因序列, 發(fā)現(xiàn)該豬種與人類相應(yīng)的dra和drb有高度同源性, 在免疫學(xué)特性方面具有一定的優(yōu)勢(shì), 提示該豬種可作為異種移植侯選供體。

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第6篇：生物信息學(xué)分析范文

[關(guān)鍵詞] 基因芯片；子宮內(nèi)膜異位癥；生物信息學(xué)分析；靶基因；microRNA

[中圖分類號(hào)] R711.710.46 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）04（a）-0012-05

[Abstract] Objective To analyze and predict the expression of endometriosis （EMs） genes by bioinformatics methods， in order to provide a new basis for revealing the essence of EMs at the gene level and developing new treatment drugs. Methods Download gene dates which were related to EMs in Gene Expression Omnibus（GEO）， were mined and analyzed by a series of bioinformatics tools， such as protparam， MotiScan， SignalP 4.0， NetPhos 2.0， TMHMM， GO， KEGG， STRING， BRB-Array Tools. Results 91 EMs related genes and 54 microRNA had been found in this study. These genes mainly involved in the process of cell proliferation regulation， cell apoptosis regulation and chemotaxis. Protein interaction network predicted 19 important EMs-related protein targets. Combined with target gene data mining， 134 EMs-related target genes were found. Conclusion Using bioinformatics method to analyze gene microarray data can acquire inner information of organisms， and provide new diagnostic markers and diagnostic thoughts for the early diagnosis of EMs.

[Key words] Microarray； Endometriosis； Bioinformatics； Target gene； MicroRNA

子m內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs）是一種常見的慢性婦科疾病，在女性人群中，發(fā)病率為10%～15%[1]，其臨床表現(xiàn)為不孕、痛經(jīng)、慢性盆腔痛、痛等[2]，給年輕的女性帶來巨大的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。EMs是在子宮腔外部出現(xiàn)經(jīng)過增殖、出血和再生的子宮內(nèi)膜樣組織，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚[3-4]。由于EMs病因復(fù)雜，目前主要治療手段是手術(shù)和激素治療，但該病的復(fù)發(fā)率高，達(dá)40%～50%[5]。因此，亟需新的有效的EMs治療方法。

基因調(diào)控在EMs的發(fā)展中起重要作用[6]。研究EMs患者的基因特征是開發(fā)新療法的有效步驟[7-8]，基因芯片數(shù)據(jù)能夠大規(guī)模地揭示基因遺傳背景。根據(jù)基因芯片數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，免疫內(nèi)分泌的功能障礙是影響子宮內(nèi)膜異位的重要因素[9]。生物信息學(xué)被應(yīng)用于整理基因表達(dá)、基因功能、基因產(chǎn)物以及細(xì)胞功能相關(guān)的大量信息，來鑒定發(fā)病過程中的關(guān)鍵因子，預(yù)測(cè)合適的治療靶標(biāo)[10]。目前這種方法已被用于改進(jìn)肝細(xì)胞癌[11]、淋巴瘤[12]和口腔癌的診斷[13]?；蛐酒夹g(shù)與生物信息學(xué)分析的結(jié)合能夠?yàn)榧膊〉姆肿由飳W(xué)研究提供新的研究視角。

本研究應(yīng)用基因芯片分析軟件BRB-Array Tools對(duì)基因芯片公共數(shù)據(jù)庫(kù)的EMs相關(guān)基因和microRNA進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，并進(jìn)行microRNA的靶基因預(yù)測(cè)。用生物信息學(xué)的方法對(duì)EMs的相關(guān)基因進(jìn)行通路和功能的分析，找出EMs相關(guān)蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的關(guān)鍵靶標(biāo)，研究EMs的發(fā)病機(jī)制，為進(jìn)一步在基因水平上揭示EMs的本質(zhì)和發(fā)現(xiàn)藥物治療靶點(diǎn)、開發(fā)治療新藥提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

從美國(guó)國(guó)立生物信息技術(shù)中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的公共基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus，GEO）[14]下載與EMs相關(guān)的基因和microRNA。

1.2 方法

①把EMs相關(guān)基因上傳到String（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes）數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析工具（http：//）[15-16]可獲得EMs相關(guān)基因蛋白-蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)，篩選節(jié)點(diǎn)（Hub）蛋白。

②把EMs相關(guān)基因上傳到DAVID（Database for Annotation，Visualization，and Integrated Discovery）[17]，用功能注釋工具（Functional Annotation Tool），研究EMs相關(guān)基因參與FOTERM_MF_5以及GOTERM_BP_5基因本體數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Ontology，GO）[18]的分子功能和生物過程，分析EMs相關(guān)基因參與的PANTHER-PATHWAY和KEGG-PATHWAY數(shù)據(jù)庫(kù)中的生物學(xué)通路。

③應(yīng)用PicTar2005[19]、TargetScan 5.1[20]、miRanda V5[21]3種軟件預(yù)測(cè)靶基因，有兩種或兩種以上的軟件同時(shí)預(yù)測(cè)到的結(jié)果則認(rèn)為可靠。

2 結(jié)果

2.1 EMs相關(guān)基因的篩選

從公共基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus，GEO）下載與EMs相關(guān)的基因，共得到91個(gè)相關(guān)基因，結(jié)果見表1。

2.2 EMs相關(guān)基因的分析

對(duì)91個(gè)EMs相關(guān)基因編碼的蛋白進(jìn)行蛋白-蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)分析顯示，處于網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的蛋白質(zhì)有19個(gè)基因與之對(duì)應(yīng)，分別是EGF、RELA、VEGFA、PCNA、PTEN、PIKCA、MDM2、MMP9、MMP1、NGF、PGR、PTGS2、IL11B、IL6、IL10、CD44、TP53、TNF、FOXO1，f明它們可能在致病中發(fā)揮著重要作用。GO富集分析結(jié)果顯示，EMs相關(guān)基因主要涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、趨化作用等反應(yīng)過程（圖1）。生物學(xué)通路分析表明，EMs相關(guān)基因主要參與細(xì)胞因子受體互作、腫瘤通路、造血細(xì)胞系、Jak-STAT信號(hào)等生物學(xué)的通路（圖2）。

2.3 microRNA的靶基因預(yù)測(cè)

在PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)中檢測(cè)到54個(gè)EMs相關(guān)的microRNA，聯(lián)合靶基因的數(shù)據(jù)挖掘和預(yù)測(cè)，共得到134個(gè)EMs的相關(guān)基因。

3 討論

EMs給社會(huì)和婦女帶來了嚴(yán)重的臨床上和經(jīng)濟(jì)上的負(fù)擔(dān)，因此，需要將研究和資源的效用最大化來提高對(duì)疾病的了解，以便發(fā)展新的有效的治療方法。隨著近幾年生物信息學(xué)技術(shù)的興起，基因芯片技術(shù)已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)研究的基本方法。基因芯片是一種大規(guī)模高效率獲取生物信息的新型技術(shù)，能夠檢測(cè)分析各個(gè)組織內(nèi)的表達(dá)基因的差異，隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的快速提高和生物數(shù)據(jù)的急劇增長(zhǎng)，生物信息學(xué)這一剛剛興起的學(xué)科得到了前所未有的迅速發(fā)展[22]，尤其是應(yīng)用生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)新基因和基因芯片，利用已知的核酸序列作為探針，與互補(bǔ)的靶核苷酸序列相互雜交，再進(jìn)行信號(hào)的監(jiān)測(cè)，最終完成定量或者定性的分析，在預(yù)防和新藥開發(fā)、輔助診斷疾病方面有廣闊的前景。生物信息學(xué)是涉及應(yīng)用物理學(xué)、數(shù)學(xué)、生物學(xué)、化學(xué)、計(jì)算機(jī)等交叉學(xué)科的一門新興學(xué)科，應(yīng)用現(xiàn)有的分析軟件和公共數(shù)據(jù)庫(kù)，可以探索生物分子結(jié)構(gòu)和功能特性，為后續(xù)研究提供新的研究思路和方向。EMs的生物學(xué)過程復(fù)雜，決定了從基因組水平篩選與轉(zhuǎn)移相關(guān)表型的功能基因成為EMs治療研究的重要方向[23]。

本研究發(fā)現(xiàn)，EGF、RELA、VEGFA、PCNA、PTEN、PRKCA、MDM2、MMP9、MMP1、NGF、PGR、PTGS2、IL11B、IL6、IL10、CD44、TP53、TNF、FOXO1在EMs相關(guān)基因編碼蛋白-蛋白的作用網(wǎng)絡(luò)中起到節(jié)點(diǎn)蛋白的作用，推測(cè)這些基因?qū)Ms的發(fā)病起重要作用。本研究通過GO富集分析和通路分析發(fā)現(xiàn)，EMs相關(guān)基因主要與細(xì)胞增殖調(diào)控、細(xì)胞凋亡調(diào)控、趨化作用有關(guān)。

綜上所述，本文應(yīng)用生物信息學(xué)的方法對(duì)基于基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘的EMs基因及蛋白進(jìn)行分析，為揭示EMs相關(guān)基因及microRNA的結(jié)構(gòu)、功能、蛋白的相互作用提供了重要依據(jù)，發(fā)現(xiàn)了關(guān)鍵基因在EMs發(fā)生發(fā)展過程中可能起到重要的作用，為日后進(jìn)一步研究EMs的發(fā)病機(jī)制、發(fā)現(xiàn)藥物治療的靶點(diǎn)，及為臨床治療和預(yù)防提供了新的切入點(diǎn)。

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第7篇：生物信息學(xué)分析范文

【摘要】

目的 應(yīng)用生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測(cè)細(xì)粒棘球蚴中國(guó)大陸株鐵蛋白（Eg. ferritin）氨基酸序列的結(jié)構(gòu)與功能。方法 利用DNAman、NCBI/BLAST公共數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)目的基因的同源性進(jìn)行比較分析。應(yīng)用DNAstar、Biosun 等生物分析軟件對(duì)鐵蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，應(yīng)用SWISSMODEL對(duì)蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬。結(jié)果 檢索Eg. ferritin氨基酸序列在其功能區(qū)的130AA內(nèi)同源性為97.7%。不同生物間的同源性平均達(dá)40.79%。生物軟件預(yù)測(cè)：Eg. ferritin的分子量約16.7 kD，含非極性氨基酸68個(gè)，預(yù)測(cè)其抗原表位肽段為7N-12E，36H -43V， 55S-62H， 69Q-76R， 82A-89E， 102I-107E， 117A -124S，129L-136T。結(jié)論 Eg. ferritin的結(jié)構(gòu)和功能及其抗原表位的預(yù)測(cè)對(duì)選取有價(jià)值的抗原肽段提供了依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 細(xì)粒棘球蚴中國(guó)大陸株；鐵蛋白；生物信息學(xué)；預(yù)測(cè)分析

Abstract: Objective To predict the structure and function of Eg.ferritin using bioinformatics method. Methods Homology of ferritin gene was analyzed Using DNAman and NCBI/BLAST database and second structure and antigen peptide of Eg.ferritin and imitate 3D structure of Eg.ferritin was predicted using DNAstar， Biosun et.al. biological softwares to. Results Deduced ferritin amino acid sequence homology was 97.7% in the 130AA and average homology of different species was 40.79% with the published ferritin gene. And it had 68 nonpolar amino acids and had 9 antigen peptide such as 7N-12E， 36H -43V， 55S-62H， 69Q-76R， 82A-89E， 102I-107E， 117A-124S， 129L-136T. Conclusions Using softwares to predict Eg.ferritin structure and antigen peptide can provide some theoretical bases for selecting some valuable antigen peptides.

Key words： echinococcus granulosus；ferritin；bioinformatics；predicting analysis

鐵蛋白（ferritin) 是普遍存在于生物體內(nèi)的一種保守性較高的多功能多亞基蛋白，它不僅調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵的含量，而且在抵抗氧化損害、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及機(jī)體的免疫反應(yīng)等方面發(fā)揮了重要作用［1-4］。據(jù)此推斷鐵蛋白在寄生蟲的生理代謝活動(dòng)中擔(dān)負(fù)著十分重要的作用，因此，它也成為各種寄生蟲疫苗研究中備受關(guān)注的候選分子。本文通過生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)細(xì)粒棘球蚴中國(guó)大陸株鐵蛋白（Eg. ferritin）氨基酸序列的結(jié)構(gòu)與功能，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能提供線索，為其在肝包蟲的診斷、藥物研發(fā)和疫苗篩選方面提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

Eg. ferritin基因由本實(shí)驗(yàn)室通過RT-PCR成功擴(kuò)增，其它寄生蟲ferritin氨基酸序列源自GenBank。

1.2 方法

通過DNAman、DNAstar對(duì)重組基因序列進(jìn)行分析并推算出其編碼的氨基酸序列。通過NCBI、BLAST在線軟件將Eg. ferritin cDNA序列與同源性較高的其它動(dòng)物ferritin基因序列進(jìn)行同源性分析。通過蛋白質(zhì)分析軟件Biosun和DNAStar將肽鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)（secondary structure）、親水性參數(shù)（hydrophilicity）、抗原性參數(shù)（antigenicity）、可塑性參數(shù)（flexibility）、表面可能性（Surface Probability）等5種參數(shù)綜合進(jìn)行抗原表位的預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 Eg. ferritin基因開放閱讀框基因序列

DNAman 軟件對(duì)測(cè)序后的鐵蛋白基因序列進(jìn)行分析，測(cè)序結(jié)果表明該基因開放閱讀框?yàn)?35bp，基因序列，見圖1。

2.2 Eg. ferritin氨基酸序列的同源性分析

NCBI/Genbank/BLAST進(jìn)行氨基酸序列的比較分析結(jié)果表明，推導(dǎo)的鐵蛋白氨基酸序列是由145個(gè)氨基酸殘基組成，與已知Genbank中ferritin氨基酸序列比較，并且在其功能區(qū)內(nèi)的130AA同源性達(dá)97.7%。有三處氨基酸殘基 (陰影加黑標(biāo)記) 與發(fā)表序列存在差異，見圖2。

用DNAman 對(duì)不同生物的鐵蛋白氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，其中與牛帶絳蟲(Taenia saginata)、日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)、人鐵蛋白H鏈、曼氏血吸蟲(Schistosoma mansion)和肝片蟲(Fasciola hepatica)的ferritin平均同源性達(dá)40.79%。圖3（見封2）中黑色標(biāo)記區(qū)域同源性達(dá)100%，粉色為75%，綠色為50%，黃色為33%。

2.3 Eg. ferritin二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和蛋白三維結(jié)構(gòu)的模擬

Biosun軟件對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋水平較高，而且該Eg. ferritin在真核及原核生物中未發(fā)現(xiàn)信號(hào)序列酶切位點(diǎn)，也未發(fā)現(xiàn)穿膜結(jié)構(gòu)域（圖4）。DANstar 對(duì)Eg. ferritin的氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，見表1。表1 Eg.ferritin所含氨基酸種類（略）

DNAstar和Biosun軟件對(duì)Eg. ferritin親水性參數(shù)、可塑性參數(shù)以及抗原表位肽段進(jìn)行預(yù)測(cè)，兩種軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果基本符合，見表2、3。表2 Eg. ferritin中20種氨基酸可塑性參數(shù)（略）表3 Eg.ferriti抗原肽段的預(yù)測(cè)（略）

3 討論

隨著基因組和功能基因組研究的深入，生物信息學(xué)理論和方法也得到了迅猛發(fā)展和廣泛應(yīng)用。利用生物信息學(xué)方法對(duì)蛋白的二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析和模擬是一種快捷有效的方法［5-6］。本實(shí)驗(yàn)室于2006年成功克隆出細(xì)粒棘球蚴中國(guó)大陸株Eg. ferritin［7］并注冊(cè)到GenBank。經(jīng)DNAman軟件對(duì)本室擴(kuò)增的Eg. ferritin基因序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該序列與互聯(lián)網(wǎng)上檢索序列(肯尼亞株)有所不同：檢索的基因序列為522bp，而我們得到的基因序列長(zhǎng)度為562bp，并推導(dǎo)出其包含145AA。在NCBI/BLAST公共數(shù)據(jù)庫(kù)中氨基酸序列在130AA內(nèi)同源性達(dá)97.7%。Thompson研究認(rèn)為細(xì)粒棘球絳蟲在長(zhǎng)期的演化過程中會(huì)引起遺傳基因的改變［8］，據(jù)此我們考慮該基因可能是我國(guó)細(xì)粒棘球蚴蟲株特有的，有望作為預(yù)防當(dāng)?shù)匕x病疫苗的候選基因，可能在蟲株的鑒別診斷上也有一定的應(yīng)用價(jià)值。

利用DNAman等生物學(xué)軟件推導(dǎo)鐵蛋白的氨基酸序列，預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和抗原表位，以及模擬其三級(jí)結(jié)構(gòu)。經(jīng)軟件分析的結(jié)果來看，鐵蛋白是生物體中的一個(gè)保守性很高的蛋白，并在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中被保留下來，其具有的相同氨基酸序列，可能是影響整個(gè)鐵蛋白功能的核心區(qū)即功能域；DNAstar，Biosun對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)構(gòu)顯示在Eg.ferritin中α螺旋水平較高，說明該蛋白的柔韌性和彈性較好，具有較好的穩(wěn)定性，在真核及原核生物中未發(fā)現(xiàn)信號(hào)序列的酶切位點(diǎn)和跨膜結(jié)構(gòu)域，并且兩軟件對(duì)鐵蛋白抗原肽段的預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致，提高了預(yù)測(cè)的可靠性。這些區(qū)域和結(jié)構(gòu)的確認(rèn)為鐵蛋白功能的進(jìn)一步探索提供了一定的參考資料，并且為后續(xù)選取Eg. ferritin中有抗原價(jià)值的肽段，制備多肽段聯(lián)合疫苗提供了一種可借鑒的手段。

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第8篇：生物信息學(xué)分析范文

一、創(chuàng)設(shè)和諧的課堂氣氛，制造快樂

贊可夫認(rèn)為，扎實(shí)地掌握知識(shí)，與其說是靠多次的重復(fù)，不如說是靠理解，靠?jī)?nèi)部的誘因，靠學(xué)生的情緒狀態(tài)而達(dá)到的.學(xué)生學(xué)習(xí)物理的主要心理障礙是畏難思想，或者說是缺乏學(xué)好物理的自信心，因此教師在教學(xué)中應(yīng)該盡量消除學(xué)生心理上的緊張情緒和壓抑感，創(chuàng)造一個(gè)輕松和諧的教學(xué)環(huán)境.

古人云“親其師，才能信其道.”物理教師直接影響學(xué)生的物理學(xué)習(xí)興趣.所以教師在工作中要投入極高的熱情，認(rèn)真負(fù)責(zé)，時(shí)時(shí)觀察學(xué)生的喜怒哀樂，隨時(shí)表達(dá)教師的關(guān)愛之心，在無形中接近師生之間的關(guān)系，增強(qiáng)了教師的親和力.學(xué)生對(duì)教師的喜歡，對(duì)教師的崇拜會(huì)很快轉(zhuǎn)移到物理課的學(xué)習(xí)中，從而很快地接受教師的教誨.

二、創(chuàng)設(shè)自主空間，引導(dǎo)學(xué)生樂于探究

長(zhǎng)久以來，初中學(xué)生對(duì)物理的興趣在于做實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)不僅能鍛煉學(xué)生的實(shí)踐能力，更能激發(fā)學(xué)生的探索興趣和創(chuàng)新精神，是學(xué)生獲得物理知識(shí)的重要途徑.而課改前大部分實(shí)驗(yàn)形式老套，學(xué)生大多被教師牽著鼻子做實(shí)驗(yàn)，失去了自主性和探究好奇性，不利于創(chuàng)新，更易形成學(xué)生心理疲勞.新教材將實(shí)驗(yàn)作為探究活動(dòng)來設(shè)計(jì)，讓學(xué)生通過自主探究，得出結(jié)論，獲得相關(guān)知識(shí)的理解.而且探究活動(dòng)的形式多樣，探究過程和方法由學(xué)生一手掌握，充滿挑戰(zhàn)性.這種改變有利于創(chuàng)新精神的培養(yǎng)，有利于形成實(shí)事求是的科學(xué)態(tài)度，更有利于克服學(xué)生的心理疲勞.

克服學(xué)生心理疲勞，就要使學(xué)生樂于探究.首先要激發(fā)起他們主動(dòng)探究的欲望，強(qiáng)化學(xué)生的探究動(dòng)機(jī).因此在教學(xué)設(shè)計(jì)中，教師要盡可能地給學(xué)生創(chuàng)設(shè)自主空間，給學(xué)生更多的自和選擇權(quán)，使學(xué)生的潛力得到充分發(fā)揮.學(xué)生在課題的研究中涌現(xiàn)出很多奇思妙想，用科學(xué)創(chuàng)新的精神去學(xué)習(xí)、探索成了學(xué)生最大的樂趣.

三、把生活引進(jìn)課堂，讓物理教學(xué)生活化

陶行知先生說過：“教育只有通過生活才能產(chǎn)生作用并真正成為教育”.但是現(xiàn)實(shí)的學(xué)校教育與學(xué)生的生活存在一定的距離，在許多教師和學(xué)生的心目中，知識(shí)都蘊(yùn)涵在教材中，教和學(xué)的基本任務(wù)就是學(xué)習(xí)教材知識(shí)，這樣就忽視學(xué)生的生活經(jīng)驗(yàn)，忽視了學(xué)生觀察世界的真實(shí)的感受，教與學(xué)都變成了游離于教師和學(xué)生真實(shí)生活之外的“虛擬世界”，學(xué)生感到厭煩甚至恐懼，造成學(xué)生嚴(yán)重的心理疲勞.而事實(shí)上學(xué)生在生活中面對(duì)著多種多樣的物理現(xiàn)象，從幼年起，就懷有好奇心和神秘感，總想把它們解開，學(xué)習(xí)物理正是解開這些迷的途徑.“回歸生活”正體現(xiàn)了教育基本理念的變革，讓教育回歸生活，讓教育成為生活，是教育自身發(fā)展的需要，也是生活對(duì)教育發(fā)出深切呼喚.

四、轉(zhuǎn)變學(xué)習(xí)方式，嘗試合作學(xué)習(xí)，做學(xué)習(xí)的主人

第9篇：生物信息學(xué)分析范文

[關(guān)鍵詞]新生；適應(yīng)大學(xué)；案例分析；學(xué)生工作

高校生活的適應(yīng)過程是每一位剛剛邁入大學(xué)的大學(xué)生需要經(jīng)歷的重要環(huán)節(jié)，是大學(xué)生涯的起點(diǎn)。那些曾經(jīng)父母眼中的寶貝們，高中同學(xué)眼中的佼佼者，在步入大學(xué)這座活力四射而又壓力重重的象牙塔，由于種種原因，或迷失，或跌倒。作為高校的輔導(dǎo)員，幫助和引導(dǎo)學(xué)生們盡快正確的適應(yīng)大學(xué)生活是義不容辭的任務(wù)。感觸較深的是一名新生因獨(dú)立性差和人際關(guān)系處理差等原因?qū)е麓髮W(xué)生活嚴(yán)重?zé)o法適應(yīng)的案例。

一、案例簡(jiǎn)介

王某，男，17歲，某高校測(cè)繪工程專業(yè)大一新生，來自江西省撫州市城區(qū)，父母均為下崗工人，靠父親打零工維持家用，家庭條件比較貧困。該生目前主要問題表現(xiàn)在以下三個(gè)方面：在生活中，他從入學(xué)后就經(jīng)常獨(dú)來獨(dú)往，學(xué)生普遍認(rèn)為他性格較為孤僻，他在與老師交談中稱無法與寢室同學(xué)、同班同學(xué)正常交流和生活，甚至有在寢室生活會(huì)嘔吐的感覺；在學(xué)習(xí)上，他厭學(xué)，學(xué)習(xí)目的極不明確，對(duì)各類學(xué)習(xí)科目缺乏興趣和求知欲，上課時(shí)總一個(gè)人坐最后一排，經(jīng)常聽課精力不集中，甚至上課有心慌的感覺；在思想方面，該生思想較為端正，但進(jìn)入大學(xué)新環(huán)境后學(xué)習(xí)目的不明確，導(dǎo)致思想上缺乏進(jìn)取心，對(duì)自己放任自流。種種跡象表明，他對(duì)大學(xué)生活失去了興趣，無法適應(yīng)大學(xué)生活，甚至產(chǎn)生了自暴自棄的消極心態(tài)。

二、案例分析

通過多方面、深入地了解該生的情況，結(jié)合心理學(xué)的專業(yè)知識(shí)來進(jìn)行判定，該生目前是屬于心理學(xué)中的人際關(guān)系障礙。導(dǎo)致他出現(xiàn)這一狀況的主要原因有以下幾個(gè)方面。

（一）自身內(nèi)在因素：該生學(xué)習(xí)和接受教學(xué)的能力并不弱，但從高中到大學(xué)，學(xué)習(xí)方式的180度轉(zhuǎn)變導(dǎo)致了其學(xué)習(xí)動(dòng)力不足和態(tài)度不端，進(jìn)取心缺乏，對(duì)學(xué)習(xí)也逐漸失去了興趣，和其他同學(xué)之間的學(xué)習(xí)差距越來越大，進(jìn)而產(chǎn)生了獨(dú)來獨(dú)往的習(xí)慣，無法與同學(xué)正常交流與生活。由于自身自卑等性格導(dǎo)致了心理弱勢(shì)，他總愛把自己身上的弱點(diǎn)、缺點(diǎn)來對(duì)比其它同學(xué)的優(yōu)點(diǎn)，這樣心里更加失去了平衡和心態(tài)更加消極，在學(xué)習(xí)方面、為人處世方面也都不能放開自我。其學(xué)習(xí)成績(jī)和個(gè)人行為也相應(yīng)地得不到老師和同學(xué)的認(rèn)可與重視，又導(dǎo)致他的學(xué)習(xí)積極性與學(xué)習(xí)興趣都受到挫敗，進(jìn)而產(chǎn)生了惡性循環(huán)。

（二）外部環(huán)境因素：從未離開家庭住校，新進(jìn)大學(xué)環(huán)境，學(xué)習(xí)方式由高中時(shí)期的灌輸式轉(zhuǎn)變?yōu)榇髮W(xué)主導(dǎo)的自學(xué)形式，種種外部原因?qū)е滤缕?、自卑、消極。通過與其父親電話聯(lián)系和當(dāng)面交談，了解到該生從小學(xué)到高中學(xué)習(xí)成績(jī)一直不錯(cuò)，學(xué)習(xí)勁頭足，但從未離開家庭住?；蚺c同學(xué)同寢生活，基本上生活范圍就在學(xué)校和家庭。他還與父母交流時(shí)透露，真正的大學(xué)生活與高中老師常說的大學(xué)生活是那么的不一樣，現(xiàn)今的學(xué)習(xí)任務(wù)和其他壓力很大，和自己心理預(yù)期有很大的落差。

（三）個(gè)人心理因素：該生由于本人性格特征及其家庭方面的原因，人際交往能力缺乏，不會(huì)與陌生人交往。當(dāng)他遇到了人際交往方面的問題時(shí)，其表現(xiàn)為束手無策或想嘔吐，根本不能較好地去化解人際矛盾。由于習(xí)慣不同，他感覺同寢甚至同班學(xué)生“懶散、不講衛(wèi)生”，進(jìn)而心懷抱怨，當(dāng)看到同學(xué)在玩時(shí)，就認(rèn)為同學(xué)是不好好學(xué)習(xí)，讓自身感覺到是身處被孤立的環(huán)境和氛圍之中，久而久之自卑心理更為嚴(yán)重。進(jìn)而，對(duì)自己的未來產(chǎn)生了迷茫和自暴自棄的感受，對(duì)老師的教育和管理也產(chǎn)生了一定的抵觸情緒。

三、方法舉措分析

在充分了解和分析了王某的情況后，筆者從以下三個(gè)方面進(jìn)行教育引導(dǎo)工作：

（一）用尊重與信任來引導(dǎo)他。尊重與信任是引導(dǎo)此類問題學(xué)生的前提。在教育引導(dǎo)該生的過程中，筆者始終堅(jiān)信“人是能夠改變的”。與他耐心交談，讓他自己說出自己的困惑與想法，尊重他，用平等和關(guān)心的方式來對(duì)待他；忌當(dāng)眾揭丑、粗暴訓(xùn)斥、冷嘲熱諷、變相體罰等手段。通過尊重與信任，用人格的魅力來啟迪他，利用愛心與關(guān)心去融化他的“抵觸心理”，架起了一條能夠情感交流的紐帶。通過不定期的“動(dòng)之以情，曉之以理”談心談話、因勢(shì)利導(dǎo)，讓他充分感受到老師的尊重、信任、關(guān)愛，從而使他逐漸地恢復(fù)了一些自信心，也消除了部分自卑情緒，從內(nèi)心深處接納他人的幫助。進(jìn)而引導(dǎo)他對(duì)自筆者價(jià)值的分析，建議他改進(jìn)學(xué)習(xí)和為人處世的方法，讓他自己去感受自身的進(jìn)步帶來的個(gè)人成就感，逐漸引導(dǎo)他由消極狀態(tài)變?yōu)榱酥鲃?dòng)狀態(tài)。

（二）為其創(chuàng)造個(gè)人表現(xiàn)的契機(jī)，讓他重塑信心。讓學(xué)生樹立起信心，是賞識(shí)教育此類問題的重要方式。首先要去挖掘他自身的潛能，來尋求他身上的“閃光點(diǎn)”，當(dāng)他參加了一項(xiàng)活動(dòng)、獲得了一項(xiàng)獎(jiǎng)勵(lì)或在學(xué)習(xí)中有了點(diǎn)滴進(jìn)步之時(shí)，都需要恰如其分的肯定他。為了及時(shí)了解、掌握他的內(nèi)心世界和行為表現(xiàn)，進(jìn)行有針對(duì)性的教育，筆者通過個(gè)別談話、家長(zhǎng)溝通、及時(shí)鼓勵(lì)、正面引導(dǎo)等多方面、多方式來發(fā)現(xiàn)他的閃光點(diǎn)。積極鼓勵(lì)他參加學(xué)院足球隊(duì)、參加英語(yǔ)演講比賽等，取得了一些榮譽(yù)，在班級(jí)群及時(shí)宣傳他取得的榮譽(yù)，讓他品嘗到受贊許、表?yè)P(yáng)的歡樂，使其樹立起自信心。這樣逐漸激起他內(nèi)心深處的潛在能量，也在教育引導(dǎo)中取得一定的效果。在他在努力后取得了一定的成績(jī)時(shí)，先及時(shí)進(jìn)行肯定，然后及時(shí)提出新的目標(biāo)，循序漸進(jìn)。逐漸使其看到了學(xué)習(xí)和生活的希望，進(jìn)一步激發(fā)了自身內(nèi)在潛力，從而確立起了一種不斷進(jìn)步的自信心。

（三）多方協(xié)調(diào)合作，持久持續(xù)引導(dǎo)教育。根據(jù)他的問題成因分析，實(shí)現(xiàn)引導(dǎo)和轉(zhuǎn)化顯然不是的朝夕之事，找到該生學(xué)習(xí)習(xí)慣、生活性格的轉(zhuǎn)化過程中的反復(fù)點(diǎn)尤為重要，通過對(duì)其耐心地對(duì)待和引導(dǎo)，以及與該生家長(zhǎng)、班委一起長(zhǎng)期的、系統(tǒng)的打算和計(jì)劃，不斷地調(diào)整與其溝通交流方式、方法來進(jìn)行教育和引導(dǎo)，與家長(zhǎng)、班委、寢室室友密切配合，全方位地對(duì)他進(jìn)行思想追蹤；并加強(qiáng)該生日常生活與學(xué)習(xí)上的引導(dǎo)與督促，進(jìn)一步使其在融入大學(xué)生活的同時(shí)養(yǎng)成良好的生活和學(xué)習(xí)的習(xí)慣。

經(jīng)過近4個(gè)多月的溝通和引導(dǎo)教育，該生現(xiàn)在已經(jīng)能與同學(xué)、老師正常交流，能夠在寢室正常生活，與同寢同學(xué)也建立了一定的友誼。上課從倒數(shù)第一排，一步步往前挪，現(xiàn)在已經(jīng)可以在前三排正常學(xué)習(xí)，且能主動(dòng)找成績(jī)好的同學(xué)補(bǔ)習(xí)和學(xué)習(xí)前三個(gè)月落下的科目，期末考試學(xué)習(xí)成績(jī)無掛科現(xiàn)象。

四、案例啟示