脂肪干細(xì)胞在泌尿系統(tǒng)疾病中的研究
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摘要：脂肪干細(xì)胞（adipose-derivedstemcells,ADSCs）是一類從脂肪分離出來的具有自我更新及多向分化潛能的成體干細(xì)胞，AD-SCs具有高度的可塑性，可分化成多種類型的細(xì)胞。與其他干細(xì)胞相比，ADSCs具有來源充足，取材方便，供體易接受等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，已成為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)及臨床治療的研究熱點(diǎn)。ADSCs誘導(dǎo)分化和移植可有效治療多種組織損傷性疾病，改善或修復(fù)器官功能，近年來ADSCs作為細(xì)胞療法及組織工程的新型種子細(xì)胞在泌尿系統(tǒng)疾病治療中取得了重大進(jìn)展。本文重點(diǎn)討論ADSCs的生物學(xué)特性及其在泌尿系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用前景。
關(guān)鍵詞：脂肪干細(xì)胞；泌尿系統(tǒng)疾??；組織工程
前言
脂肪干細(xì)胞（adipose-derivedstemcells，ADSCs）是從脂肪分離獲得、屬于中胚層來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。ADSCs最初是由Zuk等[1]人利用負(fù)壓抽脂術(shù)從脂肪組織懸液中分離培養(yǎng)出的類成纖維樣細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)它們?cè)谔囟ㄕT導(dǎo)條件下，可定向分化成脂肪細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，成肌細(xì)胞和成骨細(xì)胞，并首次證實(shí)其為多功能干細(xì)胞。近年來，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bonemarrowderivedstemcells,BMSCs）一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)，但由于其提取困難，來源較少，患者因疼痛較難接受等缺點(diǎn)，使其在臨床應(yīng)用過程中受到極大的限制。2003年，DeUgarte實(shí)驗(yàn)室首次從同一患者體內(nèi)提取培養(yǎng)ADSCs和BMSCs，對(duì)其比較發(fā)現(xiàn)，兩者在細(xì)胞形態(tài)，生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，細(xì)胞衰老，多向分化能力及基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率五個(gè)方面均無顯著性差異[2]。而與BMSCs相比，ADSCs具有來源充足，提取簡(jiǎn)單，易自體取材，對(duì)供體傷害小等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，使其有望成為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究和臨床治療的新型種子細(xì)胞。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道，ADSCs可誘導(dǎo)分化成腎臟上皮細(xì)胞，并在膀胱及輸尿管修復(fù)中取得了初步進(jìn)展，在很大程度上解決了腎臟和尿路器官的修復(fù)與重建及免疫排斥等諸多棘手難題[3-6]。本文主要就ADSCs的生物學(xué)特性及其在泌尿系統(tǒng)疾病中的作用和機(jī)制作以簡(jiǎn)要綜述。
1ADSCs的生物學(xué)特性
1.1ADSCs的細(xì)胞形態(tài)
ADSCs為貼壁細(xì)胞，原代接種后5-7d為生長(zhǎng)滯后期，細(xì)胞呈梭形或圓形，核多居中，部分細(xì)胞可見雙核或多核，核漿比較大。經(jīng)傳代后，細(xì)胞增殖迅速，體積增大，細(xì)胞逐漸趨向成纖維樣生長(zhǎng)，呈渦旋狀緊密排列。ADSCs穩(wěn)定性相對(duì)較好，經(jīng)多次傳代后細(xì)胞形態(tài)無明顯改變[1]。
1.2ADSCs的分離培養(yǎng)與鑒定
目前為止，ADSCs主要的分離培養(yǎng)方式是將手術(shù)中取得的脂肪組織進(jìn)行反復(fù)沖洗和剪碎，制成脂肪組織懸液，用胰酶或膠原酶消化、離心后，棄去上層液體和殘余脂肪，培養(yǎng)液重懸沉淀后進(jìn)行培養(yǎng)，大多選用的培養(yǎng)液為經(jīng)典的10%的胎牛血清成纖維培養(yǎng)液，最后經(jīng)0.25%胰酶消化，逐次傳至第三代后可獲得大量的脂肪干細(xì)胞系[7-9]。另外，目前尚未研究出鑒定ADSCs的特異性表面標(biāo)記，主要參照相關(guān)的基質(zhì)細(xì)胞及干細(xì)胞的特異性標(biāo)記物進(jìn)行鑒別。綜合以往研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADSCs主要表達(dá)CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49d、CD49e、CD54、CD55、CD58、CD59、CD90、CD105、CD146、CD166、SH-3等，不表達(dá)CD31、CD34、CD45、HLA-DR，其中對(duì)于CD34的表達(dá)尚存在爭(zhēng)議[10-13]。然而，有研究表明以上這些標(biāo)記物的表達(dá)會(huì)因ADSCs獲取的部位，供體種類，手術(shù)類型，細(xì)胞密度及傳代次數(shù)的不同而具有差異性[14,15]。因此，只憑某些CD分子的表達(dá)來鑒定ADSCs是無可信性的，鑒定ADSCs最可行性的方法是進(jìn)行多系定向誘導(dǎo)分化，檢測(cè)分化細(xì)胞的相應(yīng)指標(biāo)，若誘導(dǎo)成功則可間接證實(shí)ADSCs具有干細(xì)胞特性。如ADSCs向平滑肌分化的潛能可以根據(jù)誘導(dǎo)后細(xì)胞的形態(tài)及特異性標(biāo)記物來鑒定。若細(xì)胞形態(tài)由成纖維樣變成紡錘狀肌束，且α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白及肌球蛋白重鏈表達(dá)呈陽性，表明ADSCs已成功誘導(dǎo)分化為向平滑肌細(xì)胞[16]。
2ADSCs在泌尿系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用
2.1急性腎損傷
急性腎損傷(acutekidneyinjury,AKI)是一類發(fā)病率和死亡率都很高的腎臟疾病，目前臨床上最主要的治療手段是血液透析和腎移植，而前者只能短暫的代替腎臟的一部分功能，后者最大的挑戰(zhàn)是腎源短缺。干細(xì)胞移植的研究為腎臟疾病的治療提供了全新的思路和方法。Li等人[3]將人的脂肪干細(xì)胞（humanadipose-derivedstemcells，hADSCs）經(jīng)尾靜脈注入至缺血再灌注腎損傷模型的C57BL/6小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)在損傷早期hADSCs即可遷徙至小鼠腎臟，并分化成腎小管上皮細(xì)胞，這些分化的細(xì)胞逐漸增殖取代死亡的腎臟細(xì)胞，這說明，hADSCs有效維持了腎臟結(jié)構(gòu)的完整性和后續(xù)的組織修復(fù)過程。然而，另有研究表明，經(jīng)小鼠尾靜脈注射后，ADSCs進(jìn)入血液循環(huán)后主要?dú)w巢至肺臟，并非受損的腎臟，并且，在手術(shù)當(dāng)天和術(shù)后前兩天持續(xù)尾靜脈注射，可有效減輕腎小管上皮細(xì)胞壞死及間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的程度[17]。為提高干細(xì)胞在腎臟內(nèi)的歸巢效率，Lee等人[18]采用腎內(nèi)動(dòng)脈直接注射法，使誘導(dǎo)的干細(xì)胞直接進(jìn)入受損腎臟，結(jié)果顯示，臨近干細(xì)胞周圍的腎小管上皮細(xì)胞凋亡率明顯減少，這意味著腎內(nèi)動(dòng)脈直接注射可有效增加移植細(xì)胞的數(shù)目。但該注射法必須借助導(dǎo)尿術(shù)和血管造影術(shù)或X線才能順利操作。綜上所述，靜脈注射雖操作簡(jiǎn)單、創(chuàng)傷性小，但干細(xì)胞向腎臟的歸巢數(shù)目較少；而腎內(nèi)動(dòng)脈直接注射雖能提高干細(xì)胞歸巢量，但操作較難，創(chuàng)傷性大，并且兩種方法中干細(xì)胞存活率都很低。針對(duì)這一難題，Gao等人[4]首次將ADSCs與組織工程材料--溫敏性氯化殼聚糖（chitosanchloride，CSCI）水凝膠相結(jié)合，以CSCI水凝膠為載體，直接將ADSCs注射至AKI腎臟皮質(zhì)之內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADSCs復(fù)合CSCI水凝膠共同注射移植不僅能夠改善ADSCs在腎臟內(nèi)的滯留和存活，還可以顯著增加微血管密度，進(jìn)而促進(jìn)腎小管的修復(fù)和再生，而且4周后注射部位CSCI水凝膠為HE染色陰性，這說明CSCI水凝膠具有良好的組織相容性和生物降解性。因此，利用組織工程材料作為ADSCs的細(xì)胞載體在很大程度上解決了移植細(xì)胞低滯留低存活的難題，在AKI疾病治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。
2.2輸尿管損傷
輸尿管損傷最常見的誘因?yàn)獒t(yī)源性和外傷性，損傷所致的并發(fā)癥主要表現(xiàn)為輸尿管狹窄、缺損，尿外滲及尿路梗阻等。若輸尿管缺損程度較小，可采用輸尿管斷端吻合術(shù)或輸尿管膀胱吻合術(shù)等手術(shù)方法進(jìn)行治療和修復(fù)。而輸尿管缺損程度較大或伴隨嚴(yán)重并發(fā)癥者，通常需要進(jìn)行輸尿管代替。目前最常用的輸尿管代替物為胃腸道，腸代輸尿管法雖然解決了輸尿管缺損和尿外滲，但容易引起腸粘連，慢性感染及尿結(jié)石等并發(fā)癥[19]。對(duì)此，輸尿管組織工程學(xué)逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。Zhao等人[20]首次將ADSCs與生物材料相結(jié)合用于輸尿管組織重建，他們首先將兔來源的ADSCs誘導(dǎo)分化成平滑肌細(xì)胞（smoothmusclecells,SMCs），然后將SMCs接種至血管細(xì)胞外基質(zhì)（Vesselextracellularmatrix,VECM）支架的表面，共培養(yǎng)1周后，將攜帶SMCs的VECM移植到尿路缺損的新西蘭白兔動(dòng)物模型中，16周后取材發(fā)現(xiàn)移植處形成復(fù)層上皮組織肌束，并且靜脈尿路造影未發(fā)現(xiàn)輸尿管狹窄和腎積水并發(fā)癥。而后有研究相繼報(bào)道了一種新型的人工-天然復(fù)合型支架材料，該研究以聚乳酸（polylactideacid，PLA）為原料制作輸尿管螺旋形支架的內(nèi)層，以PLA/I型膠原為混合材料制作支架的外層，利用Transwell間接共培養(yǎng)系統(tǒng)誘導(dǎo)hADSCs定向分化為尿路上皮細(xì)胞并將其種植于PLA/I型膠原支架的外層后一并植入裸鼠背部皮下組織內(nèi)，成功構(gòu)建了輸尿管支架皮下植入的動(dòng)物模型。種植兩周后取材，結(jié)果顯示植入后無動(dòng)物死亡、無炎癥及感染發(fā)生，誘導(dǎo)后的hADSCs能浸潤(rùn)至支架的內(nèi)部并能表達(dá)尿路上皮細(xì)胞的標(biāo)志物[5]。以上研究給我們兩點(diǎn)提示：第一，ADSCs可作為理想的種子細(xì)胞應(yīng)用于組織工程學(xué)；第二，PLA/I型膠原混合型三維新型支架具有良好的生物相容性。相關(guān)研究初步證實(shí)了ADSCs復(fù)合新型支架材料構(gòu)建的組織工程化輸尿管用以體內(nèi)原位替代的方法是可行的。
2.3下尿路疾病
近年來，各種原因（年齡，糖尿病，肥胖，外傷等）導(dǎo)致的下尿路疾病的發(fā)病率越來越高。下尿路功能障礙雖然不能構(gòu)成生命威脅，但嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量，傳統(tǒng)的治療方法依舊會(huì)存在不同程度的缺陷和并發(fā)癥[21]。干細(xì)胞結(jié)合組織工程技術(shù)在下尿路修復(fù)重建中的應(yīng)用逐漸成為臨床治療的新策略。近些年，許多研究顯示ADSCs在膀胱及尿道重建的研究中已取得了初步性的進(jìn)展，主要以膀胱缺損，神經(jīng)源性膀胱，壓力性尿失禁及尿道缺損等下尿路疾病為研究熱點(diǎn)。ADSCs誘導(dǎo)分化成平滑肌細(xì)胞和尿路上皮細(xì)胞的潛能已被證實(shí)[6,22]，這些證據(jù)為其在下尿路重建中的應(yīng)用提供了可行性。Huang等人[23]將ADSCs直接注入至高脂血癥大鼠動(dòng)物模型的膀胱體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADSCs注射組血清總膽固醇和低密度脂蛋白水平顯著降低，并伴有血管和神經(jīng)密度的增加及排尿頻率的減少。這說明，ADSCs可用于改善高脂血癥引起的膀胱過度綜合征尿急尿頻的癥狀。此外，ADSCs的這種作用在糖尿病膀胱功能障礙的2型糖尿病大鼠模型中也得到證實(shí)[24]。近年來，隨著干細(xì)胞和組織工程技術(shù)的發(fā)展，ADSCs復(fù)合組織工程支架材料在膀胱及尿道修復(fù)重建中的應(yīng)用已陸續(xù)被報(bào)道，而且，相比之下發(fā)現(xiàn)支架材料TEPS（Tissue-engineeredprepucescaffold）可增強(qiáng)ADSCs的抗纖維化作用，減少組織化器官纖維瘢痕的形成[25-29]。另外，Yamamoto實(shí)驗(yàn)室首次對(duì)兩例壓力尿失禁患者進(jìn)行自體ADSCs移植注射治療，他們將處理過的患者自體ADSCs經(jīng)尿道注射至尿道括約肌和黏膜下層，經(jīng)過12周的術(shù)后觀察發(fā)現(xiàn)患者尿失禁的次數(shù)明顯減少，超聲波顯示尿道血流量顯著增加，并且患者術(shù)后未出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)[30]。這一結(jié)果初步表明，經(jīng)尿道注射自體ADSCs可成為臨床上治療壓力性尿失禁安全可行的手術(shù)方法，實(shí)現(xiàn)了自體ADSCs移植從動(dòng)物模型到臨床治療的成功過渡。
3ADSCs治療泌尿系統(tǒng)疾病的可能機(jī)制
盡管ADSCs的相關(guān)報(bào)道越來越多，但仍然不能確定AD-SCs在泌尿系統(tǒng)疾病中的具體修復(fù)機(jī)制。ADSCs發(fā)揮修復(fù)作用的機(jī)制既可能為ADSCs多潛能分化，也可能是其自身的旁分泌作用，目前為止兩方面都有證據(jù)支持。當(dāng)前普遍認(rèn)為ADSCs可誘導(dǎo)分化與泌尿性器官相關(guān)的多種細(xì)胞，如平滑肌細(xì)胞及尿路上皮細(xì)胞等密切聯(lián)系，這些來源于ADSCs的細(xì)胞逐漸增殖取代死細(xì)胞留下的空隙而達(dá)到器官修復(fù)的作用[3,31-32]。然而，Rehman等人用不含生長(zhǎng)因子的5%FBS基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)hAD-SCs，72h后發(fā)現(xiàn)hADSCs自身能夠分泌大量的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocytegrowthfactor，HGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、少量的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocytemacrophagecolonystimulatingfactor,GM-CSF）及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）。在低氧環(huán)境刺激下，這些生物活性因子的含量明顯增加，其中VEGF增加五倍之多，VEGF含量的增加可明顯改善hADSCs移植后血管生成的狀態(tài)。這意味著，hADSCs可通過調(diào)控自身旁分泌效應(yīng)來應(yīng)對(duì)外界刺激[33]。另有研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs移植后可通過抗氧化及抗炎性反應(yīng)特性發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用，并能促進(jìn)腎小管細(xì)胞的增殖，從而緩解大鼠急性缺血性腎損傷的癥狀[34]。以上結(jié)果提示我們：將ADSCs或其它干細(xì)胞過表達(dá)某些生物活性因子后是否能提高干細(xì)胞移植后的治療效果。Song等人建立了HGF過表達(dá)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞系，并將其種植到膀胱出口梗阻（Bladderoutletob-struction,BOO）模型的大鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HGF后可顯著減少膀胱內(nèi)膠原沉積[35]，這說明，干細(xì)胞過表達(dá)HGF后移植可成為膀胱纖維化疾病治療的新策略。雖然體外過表達(dá)在一定程度上能提高干細(xì)胞的移植效果，但是需要我們考慮的問題還很多，比如選擇的載體是否具有較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率；怎樣確保載體能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定的在體內(nèi)表達(dá)以及移植后的載體是否會(huì)影響宿主細(xì)胞的活力等。這些問題的探索和解決將有助于ADSCs在泌尿系統(tǒng)疾病中的臨床應(yīng)用。
4結(jié)語
綜上所述，ADSCs具有來源廣，易獲得，誘導(dǎo)分化能力強(qiáng)，病人痛苦小、易接受等諸多優(yōu)點(diǎn)，已成為組織工程中理想的種子來源，并在腎臟修復(fù)、輸尿管及下尿路重建中取得了初步性進(jìn)展，而ADSCs復(fù)合支架材料共移植進(jìn)一步解決了單純支架移植后導(dǎo)致的支架吸收和攣縮。雖然ADSCs在泌尿系統(tǒng)疾病基礎(chǔ)研究中取得了很大的進(jìn)展，但ADSCs誘導(dǎo)分化及移植最終要過渡到人體內(nèi)進(jìn)行研究，而目前對(duì)ADSCs的研究仍處于動(dòng)物試驗(yàn)階段，并且ADSCs向泌尿系統(tǒng)靶器官的分化機(jī)制及其復(fù)雜的旁分泌效應(yīng)依舊處在探索階段，距臨床應(yīng)用還存在一定的差距，這些問題的解決將有助于我們對(duì)ADSCs的研究更加清晰和完整，為泌尿系統(tǒng)組織工程技術(shù)在臨床應(yīng)用中帶來新的思路和突破。
作者：董孜璞 修有成 趙維明 劉贊 金承俊 夏舜堯 單位：哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科