植物線蟲病害防治研究

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幾丁質(zhì)是一種由N－乙酰－D－氨基葡萄糖以β－1，4鍵連接而成的多聚糖，是僅次于纖維素的第二大多糖類資源，也是甲殼類動物以及許多昆蟲、真菌、線蟲等病原物體壁結(jié)構(gòu)的重要組成部分。幾丁質(zhì)酶是具有生物催化活性的水解酶，化學(xué)名稱為（1，4）－β－乙?；璑－聚葡糖胺酶，能特異性地將幾丁質(zhì)水解為寡聚糖和N－乙酰氨基葡萄糖，其水解產(chǎn)物具有抗菌、抗腫瘤等生物活性，在食品，藥物以及植物病害防治等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。幾丁質(zhì)酶廣泛存在于自然界中的動物、植物、微生物等體內(nèi)，是一類具有重要作用的酶類。許多微生物包括幾乎所有的昆蟲及線蟲病原細(xì)菌、真菌均可產(chǎn)生胞內(nèi)或胞外幾丁質(zhì)酶，在有害昆蟲及線蟲等的生物防治中發(fā)揮著重要的作用，因而引起人們越來越多的關(guān)注。本文對微生物幾丁質(zhì)酶研究概況及今后的工作展望進行了綜述。

1微生物幾丁質(zhì)酶的研究現(xiàn)狀

目前，國內(nèi)外的研究主要側(cè)重于不同來源的幾丁質(zhì)酶對不同底物的作用機理、遺傳工程學(xué)和生態(tài)學(xué)意義等。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，人們展開了對幾丁質(zhì)酶的分子結(jié)構(gòu)、同源性等研究，以解釋其抑制真菌生長及殺蟲的分子機理。其中研究較多的有：蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis，Bt），其產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶對探討該酶在Bt殺蟲中的作用、提高殺蟲活性和擴大殺蟲譜的研究具有重要意義；球孢白僵菌（Beauveriabassiana）在以幾丁質(zhì)為基質(zhì)的條件下，可被誘導(dǎo)產(chǎn)生大量胞外幾丁質(zhì)酶，其殺蟲機理是其芽管新梢分泌的幾丁質(zhì)酶能將昆蟲體表的幾丁質(zhì)分解，侵入昆蟲體內(nèi)后菌絲四處穿透并充滿個體腔，最終昆蟲新陳代謝紊亂、死亡呈現(xiàn)白色僵硬狀；哈茨木霉（Trichodermaharzianum）產(chǎn)生的胞外酶中，幾丁質(zhì)酶不僅出現(xiàn)時間早、生物活性高，在重寄生過程中具有重要的作用，可以用于防治植物病原體，而且其在消除甲殼類廢料中具有工業(yè)價值。研究表明木霉G蛋白參與了幾丁質(zhì)酶的形成，并進行了不同抗真菌次生代謝產(chǎn)物分子機制的研究。

2微生物幾丁質(zhì)酶在植物線蟲病害生物防治中的應(yīng)用

幾丁質(zhì)酶能酶解許多病原微生物細(xì)胞壁的重要結(jié)構(gòu)成分幾丁質(zhì)，從而使病原微生物死亡。根據(jù)這一特性，其在植物病害的防治中有著極其廣泛的用途和巨大的潛力。近年來，由于植物寄生線蟲的危害日益嚴(yán)重，尋找高效低毒的線蟲生物防治因子越來越引起人們的重視，而幾丁質(zhì)酶由于被證實可有效地作用于線蟲，在線蟲的生防中將發(fā)揮越來越重要的作用。如食線蟲真菌所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶等胞外酶，可作用于線蟲體表角質(zhì)層和卵殼的幾丁質(zhì)層，在侵染線蟲的過程中起到關(guān)鍵作用；同時還發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶本身也可作為侵染宿主的毒性因子發(fā)揮作用，它在侵染過程中作為水解酶的其它潛在功能也在研究中。用蠟蚧輪枝胞屬的食線蟲真菌培養(yǎng)濾液所產(chǎn)的幾丁質(zhì)酶處理Globoderapallida線蟲卵，掃描電鏡觀察顯示可破壞卵表面的結(jié)構(gòu)組成。另外，木霉菌、蠟蚧輪枝菌均可用來防治大豆胞囊線蟲等植物寄生線蟲。先接種AM真菌后再接種SCN的大豆根內(nèi)幾丁質(zhì)酶和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性顯著提高，證明Chibl和PAL5基因表達可能是AM真菌誘導(dǎo)植物抗大豆胞囊線蟲病害防御反應(yīng)的一種表現(xiàn)，推測這2個基因直接參與了AM真菌誘導(dǎo)大豆抗胞囊線蟲病害的防御反應(yīng)。曾有報道2001年，在印度的喀拉啦省從香蕉病株的根部發(fā)現(xiàn)的線蟲胞囊中分離出11種真菌，其中包括總狀共頭霉（Syncephalastrumracemosum，Sr．）菌株，這些真菌能夠侵染胞囊線蟲的卵及幼蟲，從而破壞卵的孵化，對香蕉和水稻胞囊線蟲來說，這些真菌具有潛在的生防能力。其侵染過程是否與產(chǎn)幾丁質(zhì)酶有關(guān)有待證實。線蟲生防菌株Sr18的代謝產(chǎn)物可以安全高效地防治植物寄生線蟲，在研究其代謝產(chǎn)物殺線蟲活性過程中，發(fā)現(xiàn)有線蟲被消解的現(xiàn)象，這可能與產(chǎn)水解酶如幾丁質(zhì)酶有關(guān)。

3微生物幾丁質(zhì)酶在其它植物病害防治中的應(yīng)用

3．1真菌病害的生物防治

大多數(shù)植物病害是由真菌引起的，產(chǎn)幾丁質(zhì)酶微生物分解真菌細(xì)胞壁的多數(shù)植物病原真菌細(xì)胞壁的重要成分幾丁質(zhì)。幾丁質(zhì)酶可殺死病原真菌，用于農(nóng)作物的生物防治中。Horikoshi等研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生毒素的黃曲霉菌能被環(huán)狀芽孢桿菌裂解，并且隨著加入的幾丁質(zhì)酶濃度的提高，裂解效率也隨之提高。Mitchell等研究表明，只要能裂解真菌細(xì)胞壁的微生物菌株都含有幾丁質(zhì)酶。植物生長促生根際細(xì)菌熒光假單胞菌可在不同的基質(zhì)上產(chǎn)胞外幾丁質(zhì)酶，可抑制菌絲生長，被用于抗真菌病害，其抑制真菌生長可能的機制：絲狀真菌的菌絲頂端暴露的幾丁質(zhì)鏈會被幾丁質(zhì)酶所水解，細(xì)胞壁變薄，原生質(zhì)膜破裂；同時菌絲末端新合成的幾丁質(zhì)也能被幾丁質(zhì)酶降解，使真菌孢子萌發(fā)，芽管伸長受阻，破壞菌絲端部生長。已有研究發(fā)現(xiàn)，幾丁質(zhì)酶對真菌孢子萌發(fā)的抑制作用有一定的特異性。哈茨木霉菌被廣泛用于植物病害生物防治中，其可分泌產(chǎn)生細(xì)胞降解酶類，其中以幾丁質(zhì)酶尤為重要，幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)生在木霉防治病原菌的機制中占重要地位。

3．2在害蟲防治中的增效作用

內(nèi)寄生真菌可產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，防治牛豆象甲，包括哈茨木霉可產(chǎn)生水解酶用于害蟲生防。在害蟲防治方面，微生物幾丁質(zhì)酶還具有增效作用。許多昆蟲的中腸具有圍食膜，主要成分是幾丁質(zhì)。圍食膜是昆蟲防止病原細(xì)菌或病毒傳染的一道天然屏障，少量的昆蟲病原真菌產(chǎn)幾丁質(zhì)酶可破壞角質(zhì)層及幾丁質(zhì)屏障，利用蠟蚧輪枝菌孢子作為生物防治昆蟲和害蟲的手段受到極大的關(guān)注。微生物幾丁質(zhì)酶對蘇云金芽孢桿菌制劑也有增效作用。對有些害蟲，微生物幾丁質(zhì)酶不是水解圍食膜的幾丁質(zhì)，而是提高殺蟲制劑的殺蛋白活性，如果單獨使用微生物幾丁質(zhì)酶無殺蟲效果，因此其可作為殺蟲制劑的增效劑。

3．3在基因工程中的應(yīng)用

基于幾丁質(zhì)酶的特性，可將其應(yīng)用于基因工程中。20世紀(jì)80年代以來，許多科學(xué)家致力于將外源微生物的幾丁質(zhì)酶基因?qū)胫参镆蕴岣咧参锏目共∠x性和生防效果。煙草、馬鈴薯、水稻、番茄、蘋果、葡萄等植物已經(jīng)成功獲得了轉(zhuǎn)基因植株，表達了幾丁質(zhì)酶生物活性。與對照相比，轉(zhuǎn)基因植物不僅可抗真菌，對線蟲、昆蟲和其它一些病原微生物也有一定的抗性。

4微生物幾丁質(zhì)酶降解產(chǎn)物的應(yīng)用

許多細(xì)胞壁含幾丁質(zhì)的微生物能被微生物幾丁質(zhì)酶分解，可用于真菌原生質(zhì)體的釋放，產(chǎn)生菌體蛋白；幾丁質(zhì)部分水解產(chǎn)生的氨基糖寡糖素，在調(diào)節(jié)動植物細(xì)胞生命代謝活動中起著非常重要的作用；幾丁質(zhì)酶的降解產(chǎn)物可用于制藥、食品、化妝品及動物飼料等行業(yè)，特別是對甲殼類水生動物廢棄物的生物轉(zhuǎn)換，對于環(huán)境保護和資源的再利用方面起到非常重要的作用，因此有著廣闊的應(yīng)用開發(fā)前景。

5展望

對于開發(fā)新的種質(zhì)資源，發(fā)現(xiàn)新的幾丁質(zhì)酶高產(chǎn)菌的報道也開始增多，如從極端環(huán)境分離的熱穩(wěn)定性幾丁質(zhì)酶等；另外，由于海水的特殊環(huán)境，海洋微生物多數(shù)具有產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶的能力，因此人們越來越把關(guān)注的目光投向產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的海洋微生物的篩選；另外，有關(guān)酸性、中性幾丁質(zhì)酶的研究較多，而對堿性幾丁質(zhì)酶的研究較少，而海灘、鹽堿地又是堿性幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌的生長場所，因此，今后會有更多的工作要做，通過改善培養(yǎng)條件，尋找合適的發(fā)酵工藝，來提高產(chǎn)酶量。總之，微生物幾丁質(zhì)酶作為一種生物活性物質(zhì)，在防治由真菌、昆蟲及線蟲等低等生物引起的植物病蟲害中發(fā)揮著重要的作用。目前，微生物幾丁質(zhì)酶在分子生物學(xué)方面的研究不斷深入，已克隆了多種微生物的幾丁質(zhì)酶基因。幾丁質(zhì)酶無論從幾丁質(zhì)資源的開發(fā)利用減輕污染、保護環(huán)境，還是發(fā)揮幾丁質(zhì)原料及幾丁質(zhì)酶系統(tǒng)在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、食品乃至藥物中的作用，都展現(xiàn)出廣闊的良好前景。因此，在未來的農(nóng)業(yè)中，對微生物幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)修飾、作用機理及轉(zhuǎn)基因研究將會更加深入，其將在人類生產(chǎn)生活中發(fā)揮更大的作用。

作者：侯金麗 單位：河南工業(yè)貿(mào)易職業(yè)學(xué)院