皮革與膠原等電點(diǎn)的測(cè)定方式

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本文作者：程海明、陳敏、李志強(qiáng) 單位：四川大學(xué)制革清潔技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室

等電點(diǎn)(IsoelectricPoint，PI)是兩性電解質(zhì)的特征物理參數(shù)。兩性電解質(zhì)在電場(chǎng)中不發(fā)生遷移時(shí)其溶液或懸浮液所處的pH值為該兩性電解質(zhì)的等電點(diǎn)［1］。此外還有另外一些對(duì)等電點(diǎn)的定義，如Michaelis［2］將等電點(diǎn)定義為溶液中兩性電解質(zhì)的正離子與負(fù)離子的數(shù)量相等時(shí)氫離子的濃度。Sorens-en等［3］對(duì)等電點(diǎn)的定義則是溶液中兩性電解質(zhì)的平均價(jià)態(tài)為零時(shí)的氫離子濃度。這些定義都與電泳時(shí)兩性電解質(zhì)的零位移相一致。對(duì)于固體材料，如陶瓷或皮革，其表面有不同的極性基團(tuán)，這類材料的等電點(diǎn)被規(guī)定為當(dāng)物體表面不帶有凈電荷時(shí)的pH值［4］。

蛋白質(zhì)是一種典型的聚兩性電解質(zhì)。蛋白質(zhì)肽鏈的兩端有游離的氨基和羧基，側(cè)鏈上更帶有若干酸性基團(tuán)和堿性基團(tuán)，這些基團(tuán)都具有放出或接受質(zhì)子的性質(zhì)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液的pH值達(dá)到某一特定值時(shí)，蛋白質(zhì)分子不帶凈電荷，此時(shí)的pH值即為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。不同的蛋白質(zhì)由于所帶酸性和堿性基團(tuán)不等，而等電點(diǎn)不同［5，6］。等電點(diǎn)特性是蛋白質(zhì)極其重要的性質(zhì)，對(duì)蛋白的分離、純化和分析等都具有重要的實(shí)用價(jià)值［7］。

1膠原及皮革等電點(diǎn)及其與制革的關(guān)系

作為動(dòng)物皮制革的對(duì)象，是由膠原蛋白聚集而成的膠原纖維束編織而成，膠原蛋白和由其聚集而成的膠原纖維皆具有一定的等電點(diǎn)。對(duì)天然膠原等電點(diǎn)的認(rèn)識(shí)經(jīng)歷了較長(zhǎng)的一段時(shí)間，這是因?yàn)樵谧畛醯难芯窟^程中所使用的樣品為經(jīng)過堿處理之后的皮粉，現(xiàn)在我們知道天然膠原的等電點(diǎn)在6．5～7．8［8］。制革過程中由于酸、堿、鹽以及鞣劑的作用，天然膠原的等電點(diǎn)會(huì)隨著處理?xiàng)l件的不同而發(fā)生不同的改變。如，用堿法制得的明膠其等電點(diǎn)為4．7～5．2，酸法制得的明膠等電點(diǎn)在7～9左右［8］。在浸灰過程中，堿能促使膠原主鏈或支鏈上酰胺鍵水解，產(chǎn)生游離的羧基而氮原子以氨氣的形式揮發(fā)出來，從而導(dǎo)致膠原分子中的羧基數(shù)量相對(duì)增大，進(jìn)而使得膠原和裸皮表面的等電點(diǎn)向低pH值的區(qū)域偏移［9］。膠原蛋白的等電點(diǎn)及其在制革過程中發(fā)生的變化對(duì)制革工藝的制定很重要。制革的很多工序的工藝是根據(jù)皮膠原所處的等電點(diǎn)來進(jìn)行設(shè)計(jì)的。

制革操作過程中的特定pH值使得皮膠原帶有正、負(fù)或不帶電荷，從而實(shí)現(xiàn)皮膠原與相應(yīng)的皮革化學(xué)品發(fā)生反應(yīng)，達(dá)到制革的目的。例如，脫灰、軟化后裸皮的pH值約在7．5～8．5之間，而裸皮的等電點(diǎn)在pH值5左右，此時(shí)裸皮仍處于堿性狀態(tài)。如果脫灰、軟化后進(jìn)行鉻鞣，裸皮的pH值顯得高了，鉻鞣劑將在裸皮表面富集，難以滲透至皮纖維內(nèi)部，有產(chǎn)生過鞣的危險(xiǎn)。裸皮的浸酸就可以脫去軟化后的裸皮中剩余的堿，以實(shí)現(xiàn)裸皮pH值的繼續(xù)下降，保證鉻鞣的需要［10］。

鞣劑與膠原纖維作用前后，皮革的等電點(diǎn)將發(fā)生較大的變化。如浸酸裸皮的等電點(diǎn)為5．5左右，而鉻鞣后皮革的等電點(diǎn)變?yōu)?．0左右，植鞣后皮革的等電點(diǎn)變?yōu)?．2～4．0［11］。鞣劑鞣制后皮革的等電點(diǎn)發(fā)生變化，可能是因?yàn)轺穭┡c皮膠原分子某些帶電荷的基團(tuán)發(fā)生了結(jié)合，而使這些基團(tuán)封閉不能離解。因此，可以根據(jù)等電點(diǎn)的變化情況了解膠原分子上有多少這樣的基團(tuán)與鞣劑發(fā)生了反應(yīng)，這些基團(tuán)的性質(zhì)如何等等信息，為揭示制革化學(xué)中關(guān)鍵的鞣制機(jī)理問題提供重要線索。

目前關(guān)于皮革及膠原等電點(diǎn)這一基礎(chǔ)數(shù)據(jù)仍較混亂，不同等電點(diǎn)的表征方法所得數(shù)據(jù)相互之間缺乏可比性，下文將對(duì)目前表征膠原及皮革等電點(diǎn)的方法進(jìn)行綜述。

2可溶性膠原及其降解物的等電點(diǎn)表征方法

蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)可以通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定，也可以根據(jù)其氨基酸組成進(jìn)行理論計(jì)算得出?？扇苄阅z原及其降解物等電點(diǎn)的表征方法進(jìn)行總結(jié)如下。

2．1實(shí)驗(yàn)測(cè)定

根據(jù)等電點(diǎn)的定義，可以用電泳方法來直接表征可溶性蛋白的等電點(diǎn)，但大多數(shù)研究的膠原及明膠的等電狀態(tài)是利用其物理性能和化學(xué)活性在等電點(diǎn)時(shí)發(fā)生巨大的改變而獲得。如:黏度最小、膨脹度最小、滲透壓最低、電導(dǎo)率最小、濁度最大等。當(dāng)用這些測(cè)定的數(shù)據(jù)對(duì)pH值作圖，在鄰近或等電點(diǎn)處曲線都有一個(gè)劇烈的下降或傾斜。以下對(duì)一些常用的測(cè)定等電點(diǎn)的方法分別進(jìn)行介紹。

黏度法［12］:明膠稀溶液的黏度隨溶液pH值改變而發(fā)生變化，是由于明膠分子帶電而使其產(chǎn)生變形的結(jié)果。在等電點(diǎn)附近時(shí)，明膠分子為電中性，分子收縮，所以黏度最低;當(dāng)偏離等電點(diǎn)使pH升高或降低時(shí)，黏度都增加，這是由于明膠分子的凈電荷隨pH變化而增加，靜電排斥力使得明膠分子鏈展開的緣故。例如配制一定濃度的明膠溶液，在不同pH值條件下用毛細(xì)管黏度計(jì)，通常為奧氏黏度計(jì)測(cè)定其相對(duì)黏度，將所得的各pH值條件下的相對(duì)黏度對(duì)pH作圖，找到最低相對(duì)黏度時(shí)的pH值，此pH值即為明膠的等電點(diǎn)。乙醇

沉淀法［13］:明膠易溶于水，即使處于等電點(diǎn)附近仍能溶解成為均勻的明膠水溶液，但當(dāng)加入沉淀劑無水乙醇時(shí)，即產(chǎn)生明顯易見的白色沉淀。乙醇沉淀法的原理是明膠溶液產(chǎn)生白色沉淀所需的無水乙醇耗用量，在處于等電點(diǎn)時(shí)出現(xiàn)極小值，以此來確定明膠的等電點(diǎn)。不同pH值的明膠溶液各取5mL置于比色管中，加水5mL，搖勻，向試樣溶液中逐滴加入無水乙醇直至出現(xiàn)可見的白色沉液為止。記錄膠液的pH與所耗用的無水乙醇毫升數(shù)，繪制乙醇消耗毫升數(shù)－pH值關(guān)系曲線，取最低點(diǎn)對(duì)應(yīng)的pH值即為明膠等電點(diǎn)。

乳光法［13］:在較低溫度時(shí)，溶液濃度不低于0．5%的情況下，若介質(zhì)pH在等電點(diǎn)附近，明膠大分子會(huì)發(fā)生暫時(shí)的絮凝。這是因?yàn)?，等電點(diǎn)時(shí)明膠大分子中正、負(fù)離子數(shù)相等，分子鏈構(gòu)象呈最卷曲狀態(tài)，形成具有定向排列的復(fù)合膠團(tuán)點(diǎn)陣，通過膠團(tuán)表面間的側(cè)基及氫鍵相互連接、聚集，而處于準(zhǔn)絮凝狀態(tài)．當(dāng)光線入射時(shí)出現(xiàn)乳白色散射光。配制一組濃度相同而pH范圍在3～7之間，相鄰兩試樣的pH差為0．2～0．3的明膠溶液，等體積吸取各試樣溶液于比色管中，放于冰水浴中冷卻使其凝凍，取乳白光最強(qiáng)者的pH值為試樣的等電點(diǎn)。

滴定法:劉白玲等［14］將酶法提取的豬皮膠原重新溶解在0．5mol/L的醋酸中，得澄清溶液，以6mol/LNaOH滴定，直至膠原溶液出現(xiàn)沉淀，且沉淀不再溶解，測(cè)定此時(shí)的pH，重復(fù)測(cè)定3次，取平均值，即為該膠原的等電點(diǎn)。用該方法測(cè)得胃蛋白酶提取的豬皮膠原其等電點(diǎn)為4．98。王碧等［15］配制一定濃度的不同膠原蛋白及多肽溶液，分別用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定，繪制電位滴定曲線，并做一次微商曲線，確定各膠原蛋白及多肽溶液的滴定終點(diǎn)。進(jìn)而確定氨基(NH2－)和羧基(－COOH)的表觀平衡常數(shù)K1和K2，據(jù)此求得各樣品的等電點(diǎn)pI=(pKl+pK2)/2。

熒光法［16］:有實(shí)驗(yàn)表明，在一定的pH值范圍內(nèi)，明膠的熒光強(qiáng)度與其黏度之間應(yīng)呈現(xiàn)相反的變化趨勢(shì)，所以測(cè)出不同pH值下一定濃度的明膠溶液的熒光強(qiáng)度，并測(cè)出對(duì)應(yīng)的黏度值，熒光強(qiáng)度最大處和黏度最小處應(yīng)對(duì)應(yīng)于同一pH值，此pH值即為該明膠的等電點(diǎn)。

等電聚焦法［17］:等電聚焦(IEF)是一種高分辨率的蛋白質(zhì)分離分析技術(shù)，它是利用蛋白質(zhì)分子或其它兩性分子的等電點(diǎn)的不同，在一個(gè)穩(wěn)定連續(xù)的、線性pH梯度中進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離。氨基酸側(cè)鏈在不同的pH環(huán)境中所帶電荷不同，在蛋白質(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí)，它的凈電荷為零，在電場(chǎng)中也就停止了泳動(dòng)。因此可通過測(cè)定其凈電荷為零時(shí)所處的環(huán)境pH值而測(cè)定出該蛋白的等電點(diǎn)。等電聚焦的實(shí)施方法可以是園盤電泳，平板電泳以及毛細(xì)管電泳，其關(guān)鍵點(diǎn)是需要在凝膠中形成連續(xù)穩(wěn)定的線性pH梯度，這需要在凝膠中添加一定的載體兩性電解質(zhì)實(shí)現(xiàn)。

其它鞣劑鞣制研究方面，郭文宇等［18］使用等電聚焦法測(cè)定了不同鞣劑鞣制明膠溶液的等電點(diǎn)。各鞣劑對(duì)明膠處理后等電點(diǎn)的變化可以看出，膦鹽鞣制體系不同于鉻鞣以及單獨(dú)的醛鞣體系。采用膦鹽鞣制后皮膠原的等電點(diǎn)先下降后升高，而甲醛作用后明膠的等電點(diǎn)隨著甲醛的用量的增大而逐漸降低，鉻鞣過后明膠的等電點(diǎn)逐漸升高至6．5左右。

從等電點(diǎn)的定義出發(fā)，可知采用等電聚焦法進(jìn)行等電點(diǎn)的測(cè)定，所得結(jié)果精確性較高，但等電聚焦方法過程復(fù)雜，需要標(biāo)準(zhǔn)的pI兩性電解質(zhì)，實(shí)驗(yàn)過程中需要防止對(duì)流擴(kuò)散，而且對(duì)樣品有一些特殊要求。其它實(shí)驗(yàn)方法實(shí)施起來相對(duì)簡(jiǎn)單，但存在誤差較大的問題。由于蛋白質(zhì)各種物理性質(zhì)的不同，使得不同方法測(cè)定的等電點(diǎn)在數(shù)值上存在差異，可能也是膠原等電點(diǎn)這一基本數(shù)據(jù)一直以來眾說紛紜的根源所在。

2．2理論計(jì)算

蛋白質(zhì)都具有特定的氨基酸組成和排列?？疾斓鞍踪|(zhì)等電點(diǎn)可以根據(jù)其氨基酸組成，將堿性氨基酸和酸性氨基酸殘基的pKb和pKa值分別找出，然后進(jìn)行理論計(jì)算，可以得到該蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)。將理論計(jì)算得出的等電點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)測(cè)定得數(shù)值進(jìn)行比較可以揭示蛋白質(zhì)分子間的相互作用和構(gòu)象特征等信息［19］。最近有很多這一方面的文獻(xiàn)報(bào)到［19－23］。蛋白質(zhì)等電點(diǎn)理論計(jì)算的理論基礎(chǔ)是計(jì)算pH梯度的Henderson-Hasselbalch方程［20］。pH=pKa+log(［A－］/［HA］)(1)蛋白質(zhì)處在等電點(diǎn)時(shí)，其分子中帶正電荷的基團(tuán)總數(shù)與帶負(fù)電荷的基團(tuán)總數(shù)相等，方程可以表示為:ΣiAi/［1+10(pKAi–pI)］=ΣiBi/［1+10(pI–pKBi)］(2)等式的左邊為酸性基團(tuán)的加和，右邊為堿性基團(tuán)的加和。

組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸中，其中有7種是酸性或堿性氨基酸，再加上蛋白質(zhì)兩端未參與成鍵的氨基和羧基，使得需要用9個(gè)電離常數(shù)來描述蛋白質(zhì)氫離子的電離平衡。即便這9個(gè)電離常數(shù)不受介質(zhì)環(huán)境的影響，計(jì)算過程也已相當(dāng)復(fù)雜，從而有了各種近似和模擬計(jì)算方法［20－23］。

根據(jù)其中主要的酸性基團(tuán)和堿性基團(tuán)，離解常數(shù)可減少到2個(gè)即一個(gè)酸性離解常數(shù)，一個(gè)堿性離解常數(shù)。簡(jiǎn)化之后就可以推導(dǎo)出等電點(diǎn)與這兩個(gè)離解常數(shù)以及酸性基團(tuán)和堿性基團(tuán)摩爾比之間的表達(dá)式。Sillero等［20－21］采用擺動(dòng)方法(oscillatingmethod)，Patrick-ios和Yamasaki［23］利用非線性回歸方法，對(duì)多肽和蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的計(jì)算進(jìn)行簡(jiǎn)化。他們根據(jù)蛋白質(zhì)酸性基團(tuán)與堿性基團(tuán)的比例，分成三種情況，一種是酸性基團(tuán)遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于堿性基團(tuán)(R1)，一種是堿性基團(tuán)遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于酸性基團(tuán)(R1)，還有一種即為兩者數(shù)量相近(R→1)。pI=pKa－logR當(dāng)R1時(shí);pI=pKb－logR當(dāng)R1時(shí);pI=(pKa+pKb)/2+10［(pKb–pKa)/2］×(1－R)/(2ln10)當(dāng)R→1時(shí);(3)對(duì)這些數(shù)值進(jìn)行非線性回歸分析。通過對(duì)58種已知氨基酸組成的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的計(jì)算，發(fā)現(xiàn)當(dāng)取pKa=4．9、pKb=10．0時(shí)，所得等電點(diǎn)的值與電泳方法測(cè)定的值其平均絕對(duì)偏差為0．7個(gè)pH單位，這一結(jié)果與采用不簡(jiǎn)化方程的計(jì)算結(jié)果相當(dāng)吻合。根據(jù)氨基酸組成來進(jìn)行理論預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)沒有普遍適用的方法，因?yàn)榈入婞c(diǎn)與氨基酸組成之間的關(guān)系復(fù)雜，帶電基團(tuán)在微環(huán)境中電離行為也有很大影響。各電離常數(shù)的值對(duì)蛋白所處微環(huán)境的依賴性使得問題相當(dāng)復(fù)雜。這些微環(huán)境的影響由相鄰或較遠(yuǎn)的氨基酸殘基間存在的分子內(nèi)靜電引力和疏水作用力導(dǎo)致。對(duì)這些作用力進(jìn)行估算的困難被加重除了與蛋白質(zhì)肽鏈氨基酸殘基序列有關(guān)而外，還與氨基酸殘基在三維空間內(nèi)的折疊蛋白質(zhì)構(gòu)象的相對(duì)位置有關(guān)。

膠原蛋白由于其特征的三螺旋結(jié)構(gòu)，筆者認(rèn)為要對(duì)膠原及其降解物等電點(diǎn)進(jìn)行相對(duì)精確的理論預(yù)測(cè)，需要考慮膠原特殊的空間螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)各基團(tuán)電離常數(shù)的影響。

3不溶于水的膠原纖維、皮及皮革等電點(diǎn)表征方法

以上等電點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)測(cè)定方法均要求所測(cè)試樣在水中能夠溶解，對(duì)難溶于水的一類蛋白及其他兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)的測(cè)定，實(shí)施起來難度就大得多。天然膠原蛋白在水中的溶解性能很差，從動(dòng)物組織制得的固相膠原纖維要再次溶于水中，溶解度更低。制革過程中的裸皮及半成品均是不溶于水的塊狀固體，為了制革工藝的科學(xué)設(shè)計(jì)和順利實(shí)施，需要測(cè)定這些處于固態(tài)的裸皮或半成品的等電點(diǎn)。

前人對(duì)皮革等電點(diǎn)的表征采用的方法有染色法、滴定曲線法以及等電聚焦法等［1］。對(duì)于不溶于水的膠原纖維而言，采用等電聚焦法實(shí)施起來有一定的困難，需要以懸浮液來進(jìn)行電泳，并要求電泳過程中懸浮液中的顆粒不沉降。

Kelly將染料染色方法引入來測(cè)定膠原的等電點(diǎn)［24］。該方法的原理是，膠原在偏酸性時(shí)與酸性染料結(jié)合，而堿性染料與膠原具有親和力僅在偏堿性條件下。如當(dāng)皮粉(浸灰、脫灰處理膠原)的pH值低于5時(shí)，發(fā)現(xiàn)黃色的酸性染料與其結(jié)合，當(dāng)皮粉的pH值高于5時(shí)，紅色的堿性染料與其結(jié)合。所以得出皮粉的等電點(diǎn)為5。用于這一方法的染料需要選擇相對(duì)簡(jiǎn)單的化合物，與皮膠原只用染料分子中簡(jiǎn)單的離子基團(tuán)相結(jié)合。而對(duì)較復(fù)雜組分的染料，含有配位活性的基團(tuán)，離子反應(yīng)不具備相對(duì)的選擇性。

Staverman用測(cè)量電解電動(dòng)勢(shì)來表征由豆蛋白、壓緊的皮粉所制成的膜的等電點(diǎn)，或剖層皮的等電點(diǎn)［8］。在原電池中，剖層皮作為膜，將濃度分別為0．1mol/L和0．01mol/L兩種濃度的KCl溶液隔開，用甘汞電極測(cè)量?jī)蓚€(gè)半電池的電勢(shì)差。為表征膜的等電點(diǎn)，原電池中注滿已知pH值的適量的緩沖溶液，使緩沖體系的pH值在該膜的等電點(diǎn)附近，以電勢(shì)差對(duì)pH作圖，曲線在X軸上的交點(diǎn)即為其等電點(diǎn)。

在鉻鞣機(jī)理的研究過程當(dāng)中，用染色技術(shù)測(cè)定膠原分別經(jīng)陽離子鉻配合物和陰離子鉻配合物作用后等電點(diǎn)的變化［25］。結(jié)果顯示，鉻鞣前的皮粉的等電點(diǎn)在pH值5．5處，經(jīng)陽離子鉻配合物鞣制后等電點(diǎn)升高到6．5～7．5，經(jīng)陰離子鉻配合物鞣制后等電點(diǎn)降低到4．0～4．5。這一結(jié)果揭示陽離子鉻配合物主要與膠原的酸性基團(tuán)反應(yīng)，而陰離子鉻配合物與膠原的堿性基團(tuán)反應(yīng)。充分研究陽離子和陰離子鉻配合物與膠原等電點(diǎn)的關(guān)系之后，結(jié)果指出陽離子鉻配合物降低了膠原陰離子基團(tuán)的活性，主要是膠原上的羧基與其反應(yīng);膠原的陽離子基團(tuán)與陰離子鉻配合物反應(yīng)而使其活性降低。

4展望

至今，可溶性膠原及其降解物等電點(diǎn)的精確測(cè)量仍是以等電聚焦電泳方法最佳，如何改進(jìn)等電聚焦電泳方法的精確性是一個(gè)發(fā)展方向。毛細(xì)管等電聚焦［26］、固相pH梯度等電聚焦［27］等對(duì)提高等電聚焦方法的精確性至關(guān)重要。固相pH梯度等電聚焦比傳統(tǒng)的等電聚焦具有更高的分辨率，其分辨率可達(dá)0．001pH。

對(duì)膠體溶液中粒子的等電點(diǎn)，有人通過測(cè)定其zeta電位的變化來表征［28］，在zeta電位為零時(shí)膠體溶液的pH值，即為膠質(zhì)的等電點(diǎn)，而膠原蛋白溶液即是典型的膠體溶液，從而可以用此方法來表征膠原蛋白的等電點(diǎn)。程海明等［29］用zeta點(diǎn)位滴定法對(duì)膠原及明膠溶液的等電點(diǎn)進(jìn)行了測(cè)定，當(dāng)zeta點(diǎn)位值為0時(shí)的pH為膠原的等電點(diǎn)，并將該方法與等點(diǎn)聚焦法進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，用zeta電位滴定法所得膠原等電點(diǎn)值在7．5左右，該值與等電聚焦法所得結(jié)果非常接近。另外對(duì)金屬氧化物膜表面的等電點(diǎn)，有人采用了測(cè)定其不同pH值條件下的接觸角來表征［30］，其原理是當(dāng)該膜處在等電點(diǎn)的pH值時(shí)，其接觸角最大。通過測(cè)定不同pH值條件下的接觸角，找到最大值時(shí)的pH值，即為該金屬氧化物表面的等電點(diǎn)。此方法有望作為皮革或其他兩性織物表面等電點(diǎn)的測(cè)定方法。

總之，對(duì)膠原及皮革等電點(diǎn)的表征方法仍然需要進(jìn)行深入的研究，以獲得更為精確的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。膠原及皮革等電點(diǎn)的研究對(duì)制革工藝的制定有重要的指導(dǎo)意義;此外，也對(duì)了解膠原分子與鞣劑的相互作用有重要作用，對(duì)揭示各種鞣劑的鞣革機(jī)理有一定的貢獻(xiàn)。