生物工程角膜應(yīng)用的研究

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0引言

角膜盲是我國(guó)第2位致盲性眼病。因受到同種異體角膜供體缺乏的制約，面對(duì)這樣龐大的角膜盲患者群體的需求，我國(guó)每年開(kāi)展的角膜移植手術(shù)卻不到10000例。因此構(gòu)建人工生物角膜成為了眼科界討論的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。現(xiàn)有生物工程角膜是使用生物材料作為載體，通過(guò)細(xì)胞工程和組織工程技術(shù)，在體外重建的與正常角膜功能等效、形態(tài)與結(jié)構(gòu)相仿的生物角膜組織。

1生物工程角膜的制備

取新鮮或保存后的同種異體或異種角膜基質(zhì)，去除角膜內(nèi)皮、上皮細(xì)胞后，在其表面分別種植相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞，構(gòu)建成為正常角膜結(jié)構(gòu)的人工組織工程化生物角膜。在角膜基質(zhì)表面種植的細(xì)胞可以是同種異體角膜緣干細(xì)胞、誘導(dǎo)分化的胚胎干細(xì)胞源性角膜細(xì)胞，也可以是角膜內(nèi)皮細(xì)胞。前期大量的研究已表明，采用異種角膜或轉(zhuǎn)基因豬的細(xì)胞可能成為解決角膜供體材料的方案之一，可用于大量生產(chǎn)角膜重建的生物材料[1]。角膜基質(zhì)與角膜上皮、角膜內(nèi)皮三層結(jié)構(gòu)相比較，免疫原性是最低的。角膜基質(zhì)層占細(xì)胞總免疫原性的1.62％，而內(nèi)皮細(xì)胞層和上皮細(xì)胞層則分別占細(xì)胞總免疫原性的70.75％和27.63％[2]。吳靜等[3]分別利用新鮮豬角膜基質(zhì)植片和脫水豬角膜植片制備異種角膜基質(zhì)，在大鼠眼球上施行角膜移植，證實(shí)了豬角膜基質(zhì)免疫原性低，移植于大鼠角膜后不會(huì)引起體內(nèi)強(qiáng)烈的免疫排斥反應(yīng)，是進(jìn)行體外重建異種生物角膜很好的載體。

2生物角膜基質(zhì)在臨床的應(yīng)用

經(jīng)過(guò)前期的開(kāi)發(fā)和臨床試驗(yàn)，由我國(guó)科學(xué)家自主研發(fā)的脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)(APCS)，全球首個(gè)生物工程角膜于2015年通過(guò)了我國(guó)食品藥品管理局的上市批準(zhǔn)。APCS取材于豬眼角膜，經(jīng)病毒滅活與脫細(xì)胞等工藝制備而成，在脫細(xì)胞處理、去除細(xì)胞成分的同時(shí)，完好地保留了細(xì)胞外基質(zhì)的成分和結(jié)構(gòu)。其主要成分為膠原纖維骨架結(jié)構(gòu)，保留了天然角膜的前彈力層和部分基質(zhì)層，移植于受體角膜植床以后，由受體的角膜細(xì)胞附著、移行、增生到生物角膜基質(zhì)中，促進(jìn)組織再生和修復(fù)?？芍饾u被機(jī)體細(xì)胞所改建，形成與正常角膜相似的結(jié)構(gòu)，恢復(fù)角膜的透明性，在臨床上替代角膜供體施行板層角膜移植手術(shù)[4]。豬與人在解剖生理方面有很多相似性，倫理上豬作為人體器官的替代來(lái)源也是可以接受的。角膜是相對(duì)免疫赦免的器官，脫細(xì)胞處理后的豬角膜基質(zhì)不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫排斥反應(yīng)。在制備脫細(xì)胞豬角膜基質(zhì)的時(shí)候，經(jīng)過(guò)冷凍脫水、酶學(xué)消化、紫外線照射等處理，既去除了含抗原的細(xì)胞成份，又保留了天然的膠原纖維和基底膜骨架，是一種比較理想的人工生物角膜載體材料。APCS具有完整的細(xì)胞外基質(zhì)、膠原纖維和前后彈力膜，適合角膜細(xì)胞。膠原纖維排列整齊規(guī)則，具有人角膜的天然形態(tài)，這是目前人工合成材料無(wú)法達(dá)到的。自生物角膜基質(zhì)材料問(wèn)世以來(lái)，我國(guó)已在多家大型醫(yī)院開(kāi)展了使用生物工程角膜進(jìn)行板層角膜移植手術(shù)，并做出了相關(guān)的報(bào)道，對(duì)其臨床效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。Zhang等[5]使用APCS移植，治療了47例真菌性角膜炎患者。通過(guò)最少6mo的隨訪，證實(shí)了APCS應(yīng)用在人角膜移植中的安全性和有效性。在其隨訪期間，沒(méi)有觀察到感染復(fù)發(fā)的情況，同時(shí)也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的排斥反應(yīng)。說(shuō)明APCS在臨床應(yīng)用中提供了良好的組織相容性和低免疫原性。生物角膜與人角膜相似，在施行板層移植手術(shù)后的3~7d左右，植片完全上皮化。之后角膜植片水腫逐漸消退，1mo左右呈現(xiàn)正常角膜的透明形態(tài)。故治療感染性角膜炎時(shí)，在控制感染的同時(shí)，使患者在視功能上也得到恢復(fù)[6]。王素娟等利用激光共焦顯微鏡對(duì)APCS移植術(shù)后的角膜進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的上皮細(xì)胞密度值穩(wěn)定[7]。術(shù)后6mo左右，可見(jiàn)到植片上皮下有神經(jīng)纖維長(zhǎng)入。在觀察中還發(fā)現(xiàn)，移植的APCS內(nèi)未見(jiàn)有基質(zhì)細(xì)胞的長(zhǎng)入。由此推測(cè)豬角膜基質(zhì)可能不適合人角膜基質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)也不排除是因?yàn)锳PCS本身的缺陷問(wèn)題，需要臨床上的進(jìn)一步觀察和探討。目前APCS在臨床上應(yīng)用的主要適應(yīng)證是治療感染性角膜病。但也有使用生物工程角膜材料施行板層角膜移植治療角膜白斑[7]和角鞏膜皮樣瘤的報(bào)道。另外，還有學(xué)者想到使用生物角膜來(lái)治療老視[8]。利用角膜層間植入術(shù)在角膜上做加法(植入透鏡)，生物工程角膜材料打破了人角膜供體材料相對(duì)不足的局限，隨著人類老齡化的加劇，使用生物角膜治療老視有很大的前景。APCS在臨床上使用的時(shí)間不長(zhǎng)，累計(jì)報(bào)道的病例有限，術(shù)后排斥反應(yīng)和遠(yuǎn)期的并發(fā)癥，植片與人角膜植片相比的形態(tài)學(xué)差異，以及在除感染性角膜病之外的臨床應(yīng)用均需要進(jìn)一步的研究與觀察。

3生物角膜內(nèi)皮的研究前景

角膜病的患病率高，致盲性強(qiáng)，依靠生物角膜基質(zhì)施行板層角膜移植手術(shù)僅能解決部分角膜供體匱乏的問(wèn)題，故目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)是在體外構(gòu)建有功能的生物角膜內(nèi)皮細(xì)胞，為施行穿透性角膜移植提供新的細(xì)胞材料來(lái)源，使足量的角膜內(nèi)皮可以用來(lái)彌補(bǔ)角膜供體的不足。角膜內(nèi)皮通過(guò)調(diào)節(jié)角膜基質(zhì)含水量來(lái)維持角膜透明度，當(dāng)角膜內(nèi)皮功能失代償時(shí)，角膜失去其原有的透明性，只有通過(guò)角膜內(nèi)皮移植或穿透性角膜移植手術(shù)才能使患者復(fù)明。而目前使用捐獻(xiàn)的人角膜供體實(shí)施角膜移植手術(shù)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足角膜盲患者的需求。由于角膜內(nèi)皮細(xì)胞幾乎沒(méi)有增殖能力，尋找新的細(xì)胞來(lái)源構(gòu)建生物工程角膜內(nèi)皮是目前研究的一大難點(diǎn)。通過(guò)體外培養(yǎng)和擴(kuò)增獲得的人類供體來(lái)源的角膜內(nèi)皮細(xì)胞(HCEC)，被認(rèn)為是修復(fù)受損角膜內(nèi)皮的優(yōu)質(zhì)來(lái)源。理想的模型是，HCEC成功在體外培養(yǎng)后，放置在細(xì)胞載體或生物合成材料上，移植到前房?jī)?nèi)，替代人角膜內(nèi)皮細(xì)胞，并長(zhǎng)期維持角膜的透明性。已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)在體外成功地?cái)U(kuò)增了人角膜內(nèi)皮細(xì)胞，前期大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為角膜內(nèi)皮移植和全層組織工程人工角膜的構(gòu)建提供了理論的依據(jù)。Jin等利用可擴(kuò)增的HCEC，并通過(guò)將細(xì)胞接種到脫細(xì)胞人角膜基質(zhì)上，研究生物工程角膜組織構(gòu)建的可行性。其使用角膜移植手術(shù)后廢棄的人角膜緣干細(xì)胞進(jìn)行體外分離和培養(yǎng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)不同年齡供體均可以作為角膜內(nèi)皮細(xì)胞的來(lái)源，但從年輕供體中可以收獲更多[9]。最終證實(shí)HCEC可以在體外的脫細(xì)胞角膜基質(zhì)上保持活性，使用HCEC構(gòu)建新生角膜可能成為高質(zhì)量角膜移植材料的新來(lái)源。原始HCEC、人HCEC系和干細(xì)胞已被用于角膜內(nèi)皮組織工程。在角膜移植手術(shù)后，通過(guò)角膜環(huán)鉆鉆取保留下來(lái)的供者角膜緣和不適合角膜移植的尸眼角膜為原始HCEC提供了來(lái)源。不同年齡階段的捐獻(xiàn)者均可以作為原始HCEC的培養(yǎng)基，但使用老齡供體進(jìn)行體外培養(yǎng)HCEC，其增殖能力明顯減少[10－12]。干細(xì)胞是包括角膜內(nèi)皮在內(nèi)的許多器官工程的潛在來(lái)源，它們是器官特異性成人干細(xì)胞、定向分化能力強(qiáng)的胚胎干細(xì)胞，以及誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。成人干細(xì)胞被認(rèn)為是位于角膜內(nèi)皮和前部小梁網(wǎng)的連接處[13]。胚胎干細(xì)胞具有多能性和無(wú)限增殖能力的特點(diǎn)，然而由于倫理問(wèn)題、免疫排斥和畸胎瘤形成的風(fēng)險(xiǎn)限制了胚胎干細(xì)胞在臨床試驗(yàn)中的應(yīng)用。同時(shí)生物安全問(wèn)題、體細(xì)胞表觀遺傳記憶、非預(yù)期的基因組改變以及使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)載體加劇的相關(guān)腫瘤發(fā)生，臨床試驗(yàn)中使用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(IPS)也受到限制。球形HCEC和人類角膜基質(zhì)前體可能是角膜內(nèi)皮細(xì)胞的潛在來(lái)源[14－16]。在體外實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于承載HCEC的生物底物可有多種選擇。使用去除角膜內(nèi)皮的脫細(xì)胞角膜材料作為HCEC基質(zhì)[17－18]的好處在于它們提供了角膜所需的形狀、機(jī)械支撐和透明度，無(wú)需大量重新設(shè)計(jì)。羊膜(AM)在眼表疾病中的應(yīng)用非常廣泛，其抗炎和非免疫原性特性使其成為承載HCEC的生物底物的重要因素。樊廷俊等以去上皮層的羊膜為載體，以非轉(zhuǎn)染人角膜內(nèi)皮單克隆細(xì)胞為種子細(xì)胞，在體外構(gòu)建組織工程人角膜內(nèi)皮，并通過(guò)穿透性角膜移植手術(shù)將組織工程角膜移植到獼猴右眼。其發(fā)現(xiàn)移植眼的角膜沒(méi)有出現(xiàn)明顯的炎癥和免疫排斥反應(yīng)，角膜維持透明，證明了體外構(gòu)建的組織工程人角膜內(nèi)皮具有與正常人角膜相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)，具有正常的角膜內(nèi)皮功能[19]。人晶狀體囊膜也可以作為組織工程化角膜內(nèi)皮的潛在基質(zhì)，Bert等將HCEC接種在去上皮化的晶狀體囊膜上，結(jié)果表明晶狀體囊膜可維持透明性，適合體外HCEC的培育，是組織工程角膜生物底物合適的替代品[20]。同時(shí)，天然聚合物，其中包括層黏連蛋白和硫酸軟骨素的混合物、纖維連接蛋白、明膠、膠原、層黏連蛋白、來(lái)自培養(yǎng)牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)都可作為HCEC的載體[19，21－27]。目前不同基質(zhì)在角膜內(nèi)皮組織工程中的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用進(jìn)展緩慢，研究合適基質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和衍生、HCEC培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)化顯得非常有價(jià)值，需要對(duì)人體角膜內(nèi)皮的微環(huán)境進(jìn)行深入的分析和洞察，并將這些特性應(yīng)用到HCEC移植中，最終通過(guò)生物工程角膜滿足供體角膜日益有限的需求。角膜移植是治療角膜盲的主要手術(shù)方法，面對(duì)日益增長(zhǎng)的角膜盲患者的需求與短缺的角膜供體材料之間的矛盾，尋找新的角膜材料來(lái)源是目前解決這一問(wèn)題的重要手段。組織工程學(xué)是一門應(yīng)用工程學(xué)與生命科學(xué)原理相結(jié)合的方法，通過(guò)不同的組織構(gòu)建，使細(xì)胞與載體相結(jié)合，形成特定的具有生物活性的人工器官或組織。它標(biāo)志著醫(yī)學(xué)將超越組織和器官移植僅能依靠人體捐獻(xiàn)的舊模式進(jìn)入人工制造的時(shí)代。隨著生物工程角膜基質(zhì)在臨床上的應(yīng)用，其標(biāo)準(zhǔn)化的生產(chǎn)，干燥保存，且有不同厚度，可以滿足臨床上各類板層角膜移植的需求，為急需手術(shù)控制感染、保住眼球的患者帶來(lái)復(fù)明的希望。與此同時(shí)，還需要提高手術(shù)醫(yī)師的技巧、規(guī)范手術(shù)流程和術(shù)后管理，以提高生物角膜的移植成功率。但是，由于角膜內(nèi)皮和上皮細(xì)胞，尤其是內(nèi)皮細(xì)胞的體外增殖能力有限，使用生物工程角膜內(nèi)皮移植和全層組織工程人工角膜的構(gòu)建仍在一個(gè)探索的階段，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的觀察時(shí)間尚短，應(yīng)用于臨床還有一段距離。需要應(yīng)用我們所獲得的有關(guān)角膜的知識(shí)，更充分地了解角膜內(nèi)皮細(xì)胞周期，尋找是否確實(shí)存在內(nèi)皮周圍的干細(xì)胞群，為未來(lái)的發(fā)展提供幫助，為穿透性角膜移植提供新的具有可行性的組織工程材料來(lái)源。

作者：林莉