白芷質(zhì)量控制按對(duì)照提取物定量研究

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摘要:目的評(píng)價(jià)用對(duì)照提取物定性和一測(cè)多評(píng)定量相結(jié)合的方法對(duì)白芷藥材進(jìn)行質(zhì)量控制。方法用高效液相色譜法，色譜柱:ACEUltraCoreC18(50mm×2.1mm，2.5μm)，流動(dòng)相:乙腈－水梯度洗脫，流速:0.5mL•min－1，柱溫:30℃，檢測(cè)波長(zhǎng):310nm，進(jìn)樣量:5μL?？疾煸摲椒ǖ膶傩浴?biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限、精密度與回收率、穩(wěn)定性以及重現(xiàn)性。結(jié)果高效液相色譜法對(duì)白芷中的5種主要香豆素類成分，佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、cinidilin和異歐前胡素進(jìn)行了快速分離，線性關(guān)系良好(r≥0.9994)，回收率較高，均在96.4%～100.0%內(nèi)。對(duì)照提取物能快速對(duì)白芷中的5種主要成分進(jìn)行定性。單標(biāo)定量方法測(cè)得成分含量與標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量的結(jié)果一致。結(jié)論對(duì)照提取物定性和單標(biāo)定量相結(jié)合的質(zhì)量控制方法是簡(jiǎn)單、可行的，能有效地對(duì)白芷藥材進(jìn)行質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞:白芷;質(zhì)量控制;對(duì)照提取物;單標(biāo)定量

白芷為傘形科植物白芷或杭白芷的干燥根，其主要活性成分為香豆素類化合物［1］。白芷作為中國(guó)傳統(tǒng)中藥，在河北省均有廣泛種植與分布，為河北省道地中藥材。然而由于不同的加工工藝以及不同的來源，市售的白芷質(zhì)量存在一定的差異，為了保證用藥的安全有效，本研究將對(duì)照提取物鑒定和一測(cè)多評(píng)定量方法有機(jī)結(jié)合，建立中藥質(zhì)控的方法，并將其應(yīng)用于河北道地藥材白芷的質(zhì)量控制研究，為中藥對(duì)照品缺乏下的中藥質(zhì)量控制提供現(xiàn)實(shí)可行的方案。

材料和方法

1儀器與試藥

佛手柑內(nèi)酯對(duì)照品，規(guī)格:每瓶20mg，批號(hào):07111221，上海同田生物技術(shù)有限公司提供;歐前胡素、異歐前胡素、cinidilin和氧化前胡素，河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院自制，經(jīng)HPLC－DAD分析純度不少于98%;白芷樣品1～6(自然晾干的切片)，采自河北安國(guó);白芷樣品7～10(硫熏樣品)，購(gòu)自河北石家莊當(dāng)?shù)厮幍?。?biāo)準(zhǔn)白芷香豆素提取物由白芷總提取物經(jīng)大孔樹脂分離和硅膠柱分離所得。包含了主要的5種香豆素成分:佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、cinidilin和異歐前胡素，其色譜峰面積比例為0.2∶1.9∶1.0∶0.7∶0.8，與其在原藥材中的比例相似。1200高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品。

2色譜條件

色譜柱:ACEUltraCoreC18(50mm×2.1mm，2.5μm);流速:0.5mL•min－1;柱溫:30℃;檢測(cè)波長(zhǎng):310nm;流動(dòng)相:乙腈－水梯度洗脫;進(jìn)樣量:5μL。梯度洗脫程序?yàn)?～5min，45%～45%乙腈;5～15min，45%～80%乙腈。

3溶液的制備

對(duì)照品溶液制備分別稱取佛手柑內(nèi)酯、氧化前胡素、歐前胡素、cinidilin和異歐前胡素對(duì)照品適量，用75%甲醇溶解、稀釋配制成質(zhì)量濃度為1.0mg•mL－1對(duì)照品溶液。供試品溶液制備白芷藥材粉碎，過3號(hào)篩，稱取0.5g，置于50mL量瓶中，加入75%甲醇20mL，搖勻，稱定質(zhì)量，超聲提取30min，取出，放冷，用75%甲醇補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻，取上清液過0.45μm微孔濾膜，即得。

4方法學(xué)考察

專屬性分別吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液5μL，用上述色譜條件進(jìn)行分析，考察待測(cè)組分與樣品中其他物質(zhì)的分離情況。標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，稀釋成系列濃度，進(jìn)樣并測(cè)定峰面積，以對(duì)照品溶液的濃度為縱坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸。各分析化合物根據(jù)各自標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量(Method1)。將合適量的對(duì)照提取物溶解于75%甲醇中，配制成系列濃度的溶液，按上述方法對(duì)其中的主要成分歐前胡素進(jìn)行線性回歸，用得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)5種香豆素類成分進(jìn)行定量計(jì)算(Method2)。將混合對(duì)照品溶液逐步稀釋并進(jìn)行測(cè)定，以信噪比S/N≥3時(shí)確定為檢測(cè)限，以信噪比S/N≥10時(shí)確定為定量限。精密度與回收率配制低、中、高3種不同的濃度，日內(nèi)精密度是在同一天內(nèi)對(duì)同一份樣品連續(xù)測(cè)定6次，日間精密度則是在連續(xù)3d內(nèi)對(duì)同一份樣品進(jìn)行測(cè)定，通過計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來實(shí)現(xiàn)。取含量已知的白芷樣品0.25g，分別加入一定濃度的對(duì)照品溶液，按“供試品溶液制備”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣，測(cè)定樣品溶液中有效成分的含量并計(jì)算平均回收率。穩(wěn)定性取白芷藥材粉碎，按“供試品溶液制備”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0，4，8，12，24h取供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定峰面積。同時(shí)考察對(duì)照提取物溶液放置24h的穩(wěn)定性。

結(jié)果

1方法學(xué)評(píng)價(jià)

專屬性在上述色譜條件下，待測(cè)成分各色譜峰與其他成分分離良好，其他成分不干擾待測(cè)成分的測(cè)定。典型色譜圖見圖1。標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限5種成分的線性關(guān)系方程和線性范圍見表1，相關(guān)系數(shù)r≥0.9994，表明在線性范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。精密度與回收率5個(gè)分析物的日內(nèi)、日間變異分別小于1.3%和2.3%，回收率均大于96.4%，重復(fù)性良好(RSD≤1.3%)。結(jié)果見表2。穩(wěn)定性樣品及對(duì)照提取物在室溫下放置24h是穩(wěn)定的。結(jié)果見表2。

2方法學(xué)應(yīng)用

按“供試品溶液制備”方法制備10個(gè)批次白芷供品溶液，按色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定5個(gè)成分的峰面積值。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法和單標(biāo)定量法對(duì)白芷樣品中的5種測(cè)定成分含量進(jìn)行了計(jì)算，結(jié)果見表3。為了評(píng)價(jià)單標(biāo)定量的可行性(以歐前胡素為內(nèi)參，對(duì)其余4種成分進(jìn)行定量估算)，用不同百分?jǐn)?shù)(PD)和向量余弦相似度［Cos()］對(duì)兩種方法得計(jì)算結(jié)果進(jìn)行了評(píng)估。PD%=100×|X－Y|X+Y2，Cos()=∑ni=1XiYi∑ni(Xi)2∑ni(Yi)槡2其中，X，Y分別代表由標(biāo)準(zhǔn)曲線法和單標(biāo)定量法計(jì)算所得成分含量，n代表樣品個(gè)數(shù)。可知，5種成分的平均PD均小于5%，兩種方法計(jì)算所得濃度具有一定的一致性。所有測(cè)定向量得Cos()＞0.9999，表明兩種方法具有較高的相似度。

討論

藥典規(guī)定白芷含量測(cè)定的質(zhì)量控制成分為歐前胡素，且該成分在白芷中含量較高，對(duì)照品易得，故選擇歐前胡素為內(nèi)參物。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用單標(biāo)定量法所測(cè)得白芷中5種香豆素類成分含量與標(biāo)準(zhǔn)曲線法所測(cè)得的含量無明顯差異，說明在缺少對(duì)照品的情況下可以通過測(cè)定白芷中一種香豆素的含量來計(jì)算其他4種同類成分含量，進(jìn)而更全面地評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)一測(cè)多評(píng)。樣品測(cè)定結(jié)果表明，河北道地白芷藥材中氧化前胡素含量最高，5種主要香豆素類活性成分含量基本符合氧化前胡素﹥歐前胡素﹥異歐前胡素﹥cinidilin﹥佛手柑內(nèi)酯的順序。熏硫后(樣品7－10)多種香豆素類成分的含量有較大損失，此前也有文獻(xiàn)報(bào)道此類現(xiàn)象［2－3］，可見熏硫是白芷樣中香豆素類成分含量下降的主要因素。中藥成分復(fù)雜，多成分、多指標(biāo)的質(zhì)量控制模式得到越來越多的認(rèn)可和應(yīng)用。然而，多指標(biāo)定量的中藥質(zhì)量控制模式需要足夠量的具有足夠高純度的對(duì)照品，這已成為制約中藥質(zhì)量控制的一個(gè)瓶頸。《中國(guó)藥典》2010年版提出一測(cè)多評(píng)的分析方法［4－5］，該方法實(shí)現(xiàn)了中藥多成分定量，解決了中藥化學(xué)對(duì)照品匱乏的瓶頸問題。然而，一測(cè)多評(píng)在實(shí)際應(yīng)用于定量測(cè)定時(shí)，由于只有內(nèi)參物用到了對(duì)照品，其他待測(cè)成分無對(duì)照品，無法準(zhǔn)確地確定待測(cè)組分峰(即目標(biāo)峰)的位置。針對(duì)此問題，《中國(guó)藥典》2005年版引入了對(duì)照提取物，將其作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)收載。對(duì)照提取物不但具有相對(duì)固定的定的化學(xué)組成，含有定量指標(biāo)的主要效應(yīng)成分，與原藥材量化關(guān)系明確，專屬性強(qiáng)，而且具有安全、穩(wěn)定的理化特性，尤其適用于中藥的鑒別。對(duì)照提取物鑒定和一測(cè)多評(píng)定量相結(jié)合將有助于更加有效地對(duì)藥材質(zhì)量進(jìn)行控制。

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作者：李德強(qiáng) 段立廣 鄭旭光 戴榮源 張志清 單位：河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部  河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院 藥劑科 石家莊中國(guó)臨床藥理學(xué) 雜 志