巨噬細(xì)胞精選(九篇)
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第1篇：巨噬細(xì)胞范文
細(xì)胞感染模型制作參照預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按感染復(fù)數(shù)（multiplicityofinfection，MOI）為50∶1（細(xì)菌∶細(xì)胞）將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的ST6、ST6－ΔpRST98、ST6－c－pRST98加入細(xì)胞，100g離心10min，繼續(xù)在5％CO2、37℃條件下共培養(yǎng)1h。棄上清液（此時(shí)定為0點(diǎn)），加入含100mg／L的AMK培養(yǎng)液作用2h，以殺死胞外菌，在0h和2h收集細(xì)胞進(jìn)行檢測。1．2．5自噬蛋白LC3和p62的檢測分別在0h和2h收集細(xì)胞，用于檢測自噬相關(guān)蛋白LC3和p62。用預(yù)冷的磷酸緩沖液（phosphatebufferedsaline，PBS）洗1次，100g離心5min，小心吸除上清液。在細(xì)胞中加入裂解液，超聲裂解細(xì)胞，4℃13200g離心20min，吸取上清液后用二羧基二喹啉酸（bicinchoninicacid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒測蛋白濃度。取60μg樣品上樣，進(jìn)行10％十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecylsulfate－polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS－PAGE）（濃縮膠70V，30min；分離膠90V，70min），將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（300mA，70min），5％脫脂奶粉室溫封閉1h；加入鼠抗β－actin（1∶3000稀釋）、兔抗LC3（1∶1000稀釋）和兔抗p62（1∶1000稀釋），4℃孵育過夜。次日室溫孵育1h，用含Tween20的Tris緩沖液（Trisbuff－eredsalineandTween20，TBST）洗3次，每次5min；加入鼠二抗（1∶3000稀釋）、兔二抗（1∶3000稀釋），室溫孵育90min，TBST洗3次，每次5min；化學(xué)發(fā)光法顯影，檢測LC3和p62蛋白的表達(dá)。mRFP－GFP－LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡觀察自噬體和自噬溶酶體變化應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將與單體紅色／綠色熒光蛋白（monomericredfluo－rescentprotein－greenfluorescentprotein，mRFP－GFP）偶聯(lián)的自噬蛋白LC3真核細(xì)胞表達(dá)載體mRFP－GFP－LC3質(zhì)粒導(dǎo)入巨噬細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長期的THP－1細(xì)胞，接種于鋪有小圓玻片的24孔板，2×105個(gè)／孔，PMA誘導(dǎo)分化成熟。轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞融合度為80％～90％。棄去孔內(nèi)含10％胎牛血清的RPMI1640，用無血清RPMI1640洗2次，每孔加500μl無血清RPMI1640，37℃、5％CO2培養(yǎng)1h。用50μl無血清RPMI1640稀釋0．8μg質(zhì)粒DNA，輕輕吹吸3～5次混勻。用50μl無血清RPMI1640稀釋2μlLipofectamineTM2000，輕輕吹吸3～5次混勻，室溫靜置5min?；旌限D(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒DNA稀釋液，輕輕吹吸3～5次混勻，室溫靜置30min。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物緩慢滴加至24孔板中，100μl／孔，前后輕搖細(xì)胞板混勻。1．3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS17．0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理，多個(gè)實(shí)驗(yàn)組均數(shù)間兩兩比較采用LSD－t檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
CQ阻斷THP－1細(xì)胞自噬的濃度確定用WB和MTT法確定CQ工作濃度。p62作為自噬的底物蛋白，主要在自噬溶酶體中降解。CQ可通過破壞溶酶體中酸性水解酶的活性，使p62無法正常降解而累積。WB結(jié)果顯示，30μmol／LCQ作用細(xì)胞6h后，p62已明顯累積；40μmol／LCQ作用細(xì)胞6h后，累積程度達(dá)飽和（圖1A、1B）。結(jié)合MTT法檢測CQ對(duì)細(xì)胞活性的影響，30μmol／LCQ作用24h后，細(xì)胞存活率為58．58％；而40μmol／LCQ作用24h后，細(xì)胞存活率僅為46．03％（圖1C）。細(xì)菌OD值測定結(jié)果表明，30μmol／LCQ對(duì)ST6、ST6－ΔpRST98和ST6－c－pRST98菌量無明顯影響，因此將30μmol／L作為CQ的工作濃度。傷寒沙門菌質(zhì)粒對(duì)THP－1自噬蛋白LC3Ⅱ與p62表達(dá)的影響WB結(jié)果顯示，細(xì)菌與THP－1作用0h，CQ處理組LC3Ⅱ／β－actin值及p62／β－actin值明顯高于對(duì)照組，其中突變株ST6－ΔpRST98LC3Ⅱ／β－actin值及p62／β－actin值的增加量均高于野生株ST6（圖2A、2B、2D）。細(xì)菌與THP－1作用2h，CQ處理組LC3Ⅱ／β－actin值及p62／β－actin值較對(duì)照組明顯上升，但突變株ST6－ΔpRST98的上升量仍顯著高于野生株ST6（圖2A、2C、2E）。mRFP－GFP－LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡觀察自噬體和自噬溶酶體的變化轉(zhuǎn)染mRFP－GFP－LC3質(zhì)粒的細(xì)胞，自噬體為紅綠疊加后形成的黃色點(diǎn)狀聚集物，因溶酶體的酸性環(huán)境會(huì)淬滅綠色熒光而對(duì)紅色熒光無影響，使自噬溶酶體表現(xiàn)為紅色點(diǎn)狀聚集物。若自噬活性上升，可觀察到黃色自噬體和紅色自噬溶酶體的點(diǎn)狀聚集物均增多；若自噬體與溶酶體的融合被阻斷、自噬溶酶體的生成減少，僅表現(xiàn)為黃色自噬體點(diǎn)狀聚集物增多。結(jié)果顯示，0hCQ干預(yù)組突變株ST6－ΔpRST98感染細(xì)胞的點(diǎn)狀聚集物數(shù)量高于對(duì)照組，而野生株ST6和回補(bǔ)株ST6－c－pRST98感染細(xì)胞的點(diǎn)狀聚集物數(shù)量無差異。2hCQ干預(yù)組3株菌感染細(xì)胞的點(diǎn)狀聚集物數(shù)量均高于對(duì)照組，其中突變株ST6－ΔpRST98上升量顯著高于野生株ST6及回補(bǔ)株ST6－c－pRST98（圖3）。
自噬是不同于凋亡的一種細(xì)胞死亡方式，自1962年提出后已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。自噬主要是通過細(xì)胞內(nèi)的雙層膜結(jié)構(gòu)包裹需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)或外來異物形成自噬體，然后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，在自噬體內(nèi)利用溶酶體水解酶降解其所包裹的內(nèi)容物，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞器的更新［8］。在細(xì)胞自噬與感染性疾病關(guān)系的研究中，自噬被視為機(jī)體對(duì)抗病原體入侵的一種方式，不僅可通過自噬溶酶體途徑清除細(xì)菌發(fā)揮天然免疫應(yīng)答效應(yīng)，還參與病原菌的抗原呈遞過程，對(duì)細(xì)胞的生存起至關(guān)重要的保護(hù)作用［9，10］。目前，在酵母和其他真核生物中已發(fā)現(xiàn)許多自噬相關(guān)基因（autophagy－relatedgene，ATG），其中微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule－associatedprotein1lightchain3，MAP1－LC3）是酵母Atg8在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的同源物。在自噬過程中，LC3Ⅰ經(jīng)類泛素化酶催化其C端并與磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）偶聯(lián)后轉(zhuǎn)變?yōu)長C3Ⅱ［8］。一旦自噬體與溶酶體融合，自噬體內(nèi)的LC3Ⅱ即被溶酶體中的水解酶降解。LC3Ⅱ是目前發(fā)現(xiàn)的唯一定位于自噬體膜上的自噬相關(guān)蛋白，其含量多少與自噬泡數(shù)量成正比［11］。因此，WB檢測細(xì)胞內(nèi)LC3Ⅱ含量變化或激光共聚焦法檢測細(xì)胞質(zhì)內(nèi)LC3點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)自噬體形成的檢測［12］。p62能結(jié)合泛素化的蛋白與LC3偶聯(lián)，參與自噬體形成［13］。自噬發(fā)生時(shí)，隨著蛋白質(zhì)不斷降解，p62水平逐漸降低；而在自噬缺陷細(xì)胞中，可觀察到p62累積［14，15］。因此，p62也被作為檢測自噬活性的一個(gè)標(biāo)記蛋白，其表達(dá)水平與自噬活性呈負(fù)相關(guān)。CQ作為一種自噬阻斷劑，通過提高溶酶體中的pH值，使溶酶體中的酸性水解酶失活，導(dǎo)致自噬溶酶體無法分解底物［16］，造成位于自噬體和自噬溶酶體膜上的LC3Ⅱ和p62不能及時(shí)降解，致使蛋白累積。
第2篇：巨噬細(xì)胞范文
目的：建立用流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠腹腔誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞吞噬功能的方法。方法：用貼壁法篩選有活性的巨噬細(xì)胞，再與用碳酸鹽緩沖液制備的熒光素(FITC)標(biāo)記的大腸埃希菌混合，37℃孵育，每10min取少量固定后加EB染巨噬細(xì)胞核，用流式細(xì)胞儀檢測，計(jì)算巨噬細(xì)胞對(duì)大腸埃希菌的吞噬率。結(jié)果：FITC能夠有效標(biāo)記大腸埃希菌；小鼠腹腔誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞能夠吞噬大腸埃希菌，并且在30min時(shí)達(dá)到最大峰值。結(jié)論：用流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠巨噬細(xì)胞吞噬FITC標(biāo)記大腸埃希菌是測定巨噬細(xì)胞吞噬功能簡便、快速和重復(fù)性好的定量方法。
【關(guān)鍵詞】 巨噬細(xì)胞 吞噬作用 大腸埃希菌 流式細(xì)胞儀
Establish a New Method of Detecting Phagocytosis of Macrophage by Flow Cytometry
Abstract Objective: To use a new method of detecting phagocytosis of macrophage induced from the Belly of mouse by flow cytometry. Methods: Firstly， the living macrophages were collect by cultivating and adherencing， and bacterium coli(E. coli) was labeled FITC. Secondly， E. coli was mixed with macrophages， every 10 minute to take out of small amounts of mixed liquor，and add a little of EB dye. Finally， the fluorescent intensity was measured by flow cytometry. Results: The E. coli was labeled well by FITC in carbonate buffer. Macrophage can phagocytize E. coli and the efficient rat of phagocytosis was highest about at 30 minute. Conclusion: The method that detecting phagocytosis of macrophage phagocytizs E. coli is convenient、fast、good repeatability.
Key words macrophage; phagocytosis; bacterium coli; flow cytometry
巨噬細(xì)胞(macrophage，MP)是機(jī)體天然免疫的主要免疫細(xì)胞，吞噬率則直接反映巨噬細(xì)胞的吞噬功能。通常測定吞噬率的方法是對(duì)吞噬細(xì)菌的MP染色后在顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)的方法，也有研究者用流式細(xì)胞儀(Flow Cytometry，F(xiàn)CM)檢測MP的吞噬功能［1，2］。我們?cè)跈z測小鼠MP吞噬細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，小鼠MP的形態(tài)較小，染色后在顯微鏡下觀察計(jì)算吞噬率較為困難。本研究試建立用流式細(xì)胞術(shù)FITCEB法檢測MP的吞噬功能，以求找到一種簡便、客觀和重復(fù)性好的方法。
1 材料和方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
1.1.1 主要試劑
FITC；EB；2%淀粉肉湯；大腸埃希菌DH5A；2%瓊脂LB固體培養(yǎng)基；含血清培養(yǎng)基；流式細(xì)胞儀四色校準(zhǔn)微球(CaliBRITEBeads，美國BD公司)。
1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
BALB/C小鼠，25只，體重(19±2)g，由本院免疫學(xué)教研室保存提供。
1.1.3 主要儀器和軟件
隔水恒溫培養(yǎng)箱，型號(hào)：GNP9270 (上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；自控式CO2細(xì)胞孵育箱，型號(hào)：2300（美國Shellab公司）；分光光度計(jì)，型號(hào)：Jenway 6305 (Barloworld公司)；蔡司熒光顯微鏡，型號(hào)：ZEISS AXIO Imager.A1 (蔡司光學(xué)儀器（上海）國際貿(mào)易有限公司)；流式細(xì)胞儀，型號(hào)：FACSCalibur (美國BD公司)；CellQuest軟件。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 大腸桿菌培養(yǎng)及標(biāo)記熒光素(FITC)
接種大腸桿菌于2%瓊脂LB固體培養(yǎng)基表面皿上，在37℃隔水恒溫培養(yǎng)箱中孵育48h，取少量菌落用PBS洗，革蘭氏（圖1）和GW染色觀察（圖3），并調(diào)節(jié)濃度(OD≈0.40在620nm處）。熒光素標(biāo)記大腸桿菌［3］：離心去上清，加入250ul 1%Triton X100 和1ml FITC（0.01mg FITC/500ul 碳酸鹽緩沖液）37℃避光孵育15min，離心去上清，少量PBS重懸細(xì)菌待用，并用熒光顯微鏡觀察（圖2）。
1.2.2 巨噬細(xì)胞吞噬大腸桿菌
誘導(dǎo)、篩選腹腔巨噬細(xì)胞：腹股溝注入1ml2%淀粉肉湯液，48h后開腹腔收集滲出液，培養(yǎng)基洗一次，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中37℃ CO2孵育箱孵育2h，收集貼壁細(xì)胞（1×107event）于離心管中4ml培養(yǎng)基重懸待用，并GW染色觀察（圖3）。檢測巨噬細(xì)胞吞噬大腸桿菌：加FITC標(biāo)記大腸桿菌于巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中，置于37℃水平搖床上（慢速搖動(dòng)），每10min取搖勻液0.5ml，PBS洗一次，70%乙醇固定10min，離心后加入1ml EB(0.5μg/ml)，37℃避光孵育15min待測。首先使用BD CaliBRITE Beads試劑調(diào)整儀器，設(shè)定儀器基本參數(shù)，上樣后先用FSCH/SSCH圈定MP，再采集紅色熒光強(qiáng)度，并計(jì)算實(shí)際吞噬率（某時(shí)刻實(shí)際吞噬率=某時(shí)刻吞噬率-0min時(shí)的吞噬率），同時(shí)取少量GW染色觀察（圖3）。
1.3 統(tǒng)計(jì)分析
采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 小鼠巨噬細(xì)胞吞噬FITC標(biāo)記大腸埃希菌的定量觀察
由大腸埃希菌的革蘭氏染色圖像（圖1）可以看出：大腸埃希菌為革蘭氏陰性菌，并沒有其他細(xì)菌污染，可以應(yīng)用于吞噬實(shí)驗(yàn)；由大腸埃希菌的熒光顯微鏡觀察（圖2）可以看出：用碳酸鹽緩沖液(pH=9) 制備的熒光素(FITC)能夠有效標(biāo)記大腸埃希菌；在不同時(shí)間段GW染色觀察巨噬細(xì)胞吞噬大腸埃希菌過程的圖像（圖3）中可以看出：在0～20min內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬大腸埃希菌的量逐漸增加（巨噬細(xì)胞吞噬泡中大腸埃希菌的量增加），30min左右時(shí)巨噬細(xì)胞吞噬量最高，40min后巨噬細(xì)胞吞噬量有減少趨勢（吞噬泡中有明顯的溶菌現(xiàn)象，泡內(nèi)大腸桿菌形態(tài)逐漸模糊）。
2.2 小鼠巨噬細(xì)胞吞噬FITC標(biāo)記大腸埃希菌的動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)
小鼠巨噬細(xì)胞與FITC標(biāo)記大腸埃希菌在37℃作用不同時(shí)間后， 巨噬細(xì)胞的實(shí)際吞噬率在0、10、20、30、40、50min時(shí)分別為0%、11.20±2.0%、21.57±2.1%、62.22±5.0%、54.58±3.5%、37.22±4.1%，在30min左右即達(dá)到峰值（表1，圖4）。表1 巨噬細(xì)胞吞噬大腸埃希菌的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)(略)
3 討論
人類細(xì)胞免疫功能一般認(rèn)為應(yīng)包括白細(xì)胞、紅細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等三大系統(tǒng)，其相應(yīng)的檢測指標(biāo)分別為：以CD4和CD8為主的T細(xì)胞亞群檢測，以RBCC3bRR和RBCICR為主的紅細(xì)胞免疫功能檢測和以巨噬細(xì)胞吞噬率為主的巨噬細(xì)胞吞噬功能檢測。但是，在臨床上由于細(xì)胞免疫功能檢測方法較繁瑣，往往作前兩項(xiàng)檢測，對(duì)于某些免疫性疾病以及與免疫功能損傷有關(guān)疾病的診斷與治療中，全面地評(píng)估機(jī)體的免疫狀態(tài)極為重要。
檢測MP功能最常用的方法之一就是檢測其對(duì)細(xì)菌的吞噬率，傳統(tǒng)方法是取外周血與細(xì)菌混合作用后涂片染色，在顯微鏡下觀察MP對(duì)細(xì)菌的吞噬率。該方法一般要尋找200個(gè)以上MP中吞噬細(xì)菌MP數(shù)量，操作較煩瑣，且形態(tài)較小，顯微鏡下觀察其對(duì)細(xì)菌的吞噬率更為困難。因此，已有研究者報(bào)道用流式細(xì)胞術(shù)測定中性粒細(xì)胞對(duì)熒光素標(biāo)記細(xì)菌的吞噬功能［4，5］，但目前有關(guān)巨噬細(xì)胞吞噬功能的檢測報(bào)道不多。
本研究在前人研究基礎(chǔ)上［6］，選擇FITC和EB雙熒光性物質(zhì)標(biāo)記法檢測MP對(duì)大腸埃希菌的吞噬功能。其檢測原理是：首先利用FITC在碳酸鹽緩沖液中標(biāo)記大腸埃希菌，再用MP吞噬標(biāo)記后的大腸埃希菌，吞噬完成后，加入EB染料標(biāo)記MP，在488nm的激光下MP內(nèi)大腸埃希菌上的FITC首先發(fā)出綠色熒光，其熒光又可以激發(fā)MP上的EB染料，使其產(chǎn)生紅色熒光，通過計(jì)算紅色熒光的表達(dá)率反映MP對(duì)大腸埃希菌的吞噬功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：0～20min內(nèi)吞噬率逐漸增加；30min左右吞噬率達(dá)到平臺(tái)，與有關(guān)資料一致；40min以后吞噬率反而減少，有可能通過MP內(nèi)溶菌酶作用把MP內(nèi)細(xì)菌消化、分解，釋放到細(xì)胞外，導(dǎo)致MP內(nèi)細(xì)菌減少，熒光能力減弱。其中，在流式細(xì)胞儀熒光強(qiáng)度直方圖中CV平均值為3.9%，由此可見，自動(dòng)流式細(xì)胞儀用于檢測巨噬細(xì)胞吞噬功能，不但測量數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好、操作簡便、快速，而且保持MP細(xì)胞膜的完整性，能夠直接體現(xiàn)MP對(duì)細(xì)菌的吞噬能力，同時(shí)彌補(bǔ)了FITC熒光性弱難以區(qū)分、檢測的弱點(diǎn)。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分證明通過流式細(xì)胞術(shù)的FITCEB法能夠簡便、快速和重復(fù)性好地定量檢測巨噬細(xì)胞對(duì)大腸埃希菌的吞噬功能。
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第3篇：巨噬細(xì)胞范文
【關(guān)鍵詞】 辛伐他汀; 巨噬細(xì)胞; 基質(zhì)金屬蛋白酶-9; 金屬蛋白酶組織抑制因子-1
Abstract:【Objective】 To investigate the effects of simvastatin drug-serum on the expression and secretion of matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in U937 monocyte-derived macrophages. 【Methods】 Fifteen New Zealand rabbits were randomized to 3 groups, normal control group (NL, n=5), atherosclerotic model group (AS, n=5) and simvastatin drug-serum group (SIM, n =5). The rabbit atherosclerotic model was developed by high cholesterol feeding. Then they were medicated with simvastatin liquor by gavage to prepare simvastatin drug-serum. U937 monocyte-derived macrophages were incubated with different concentrations (5%, 10%, and 20%) of simvastatin drug-serum for 24 hours. The mRNA expression and protein secretion of MMP-9 and TIMP-1 were detected by RT-PCR and ELISA. 【Results】 Compared to same concentration AS group, 5%, 10%, and 20% SIM group significantly inhibited the expression of MMP-9 mRNA in U937 monocyte-derived macrophages (P=0.005, 0.041, and 0.013), and the expression difference of TIMP-1 mRNA were not significant (all P >0.05). Compared to same concentration AS group, 10% and 20% SIM group not only significantly inhibited the secretion of MMP-9 in U937 monocyte-derived macrophages (P=0.009 and 0.001), but also significantly increased the secretion of TIMP-1 ( P = 0.017 and 0.001) . 【Conclusion】 Simvastatin inhibits the expression and secretion of MMP-9 and enhances the secretion of TIMP-1.
Key words: simvastatin; macrophage; matrix metalloproteinase-9; tissue inhibitor of metalloproteinase-1
冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊由穩(wěn)定轉(zhuǎn)為不穩(wěn)定,繼而破裂導(dǎo)致血栓形成是急性冠脈綜合征最主要的發(fā)病機(jī)制[1, 2]。斑塊脂質(zhì)核心大、纖維帽薄、巨噬細(xì)胞多是結(jié)構(gòu)性易損斑塊[3]。斑塊內(nèi)單核巨噬細(xì)胞聚集,基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMP)增多,金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMP)減少,導(dǎo)致斑塊內(nèi)膠原降解,纖維帽變薄,是斑塊穩(wěn)定性下降的重要原因[4, 5]。臨床研究顯示他汀對(duì)急性冠脈綜合征治療有效,可能與改善內(nèi)皮功能、抗炎及穩(wěn)定斑塊等調(diào)脂以外的作用有關(guān)[6],但其具體機(jī)制尚未完全明確。本研究擬觀察辛伐他汀含藥血清對(duì)U937單核細(xì)胞源巨噬細(xì)胞MMP-9及TIMP-1表達(dá)與分泌的影響,以探討辛伐他汀穩(wěn)定斑塊、治療急性冠脈綜合征的機(jī)制。
1 材料與方法
1.1 材料準(zhǔn)備
雄性純種新西蘭大白兔,體質(zhì)量2.0~2.5 kg,購自中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。人單核白血病細(xì)胞株U937細(xì)胞,購自中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞庫。辛伐他汀藥片,購自默沙東公司,實(shí)驗(yàn)時(shí)溶解于蒸餾水灌胃。
RPMI 1640培養(yǎng)基,購自Gibco公司。新生牛血清,購自PAA公司。佛波酯(PMA),購自Sigma公司。Trizol reagent,購自Invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,購自Fermentas公司。Taq酶購自Takara公司。PCR反應(yīng)引物,由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。人MMP-9、TIMP-1細(xì)胞上清ELISA試劑盒,購自RapidBio公司。
1.2 動(dòng)脈粥樣硬化模型建立及含藥血清制備
15只新西蘭大白兔隨機(jī)分為3組:正常對(duì)照組(normal, NL)、粥樣硬化模型組(atherosclerosis group, AS)和辛伐他汀含藥血清組(simvastatin group, SIM),每組5只。正常對(duì)照組予普通飼料喂養(yǎng)12周,其余各組予高脂飼料(1%膽固醇、10%豬油、89%普通飼料)喂養(yǎng)10周后,每組隨機(jī)處死1只,證實(shí)有大動(dòng)脈粥樣硬化形成后,繼續(xù)高脂喂養(yǎng)至12周,其中SIM組于第11周起給予辛伐他汀5 mg/kg,每天1次,灌胃14 d。末次給藥前禁食12 h,給藥后1 h頸動(dòng)脈無菌取血,分離血清,同組動(dòng)物血清混勻,0.22 ?滋m濾膜過濾滅菌,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)
U937細(xì)胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中,置于含5% CO2,37 ℃培養(yǎng)箱中,待細(xì)胞生長至接近融合時(shí)傳代,2~3代后用于實(shí)驗(yàn)。調(diào)整細(xì)胞密度為5×106/mL,接種于6孔培養(yǎng)板,加入PMA使終濃度為50 ng/mL,培養(yǎng)48 h后見懸浮生長的U937細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞,伸出偽足,貼壁生長。棄去舊培養(yǎng)基,PBS液洗滌后,予不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,棄去培養(yǎng)基。分別加入各含5%、10%、20%正常兔血清,5%、10%、20%粥樣硬化兔血清,以及5%、10%、20%辛伐他汀含藥血清的RPMI 1640培養(yǎng)基,每組設(shè)3個(gè)平行組,培養(yǎng)24 h用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)。
1.4 總RNA提取
吸凈培養(yǎng)基,每孔加入1 mL的Trizol液,吹打裂解細(xì)胞,收集于無RNA酶離心管中,室溫靜置5 min。加入0.2 mL氯仿,劇烈顛倒15 s,室溫靜置3 min,4 ℃,12 000 × g離心10 min。轉(zhuǎn)移上層水相液500 ?滋L到新的離心管,加入500 ?滋L異丙醇,室溫靜置10 min,4 ℃,12 000 × g離心7 min。棄上清,加入1 mL無RNA酶水配制的75%酒精,振蕩混勻,4 ℃,7 500 × g離心5 min。重復(fù)酒精洗滌沉淀一遍,棄去酒精,室溫干燥5 min,融解RNA于30 ?滋L無RNA酶水中,瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性,紫外分光光度計(jì)測定RNA含量,計(jì)算出RT-PCR所需樣品量。
1.5 RT-PCR
取總RNA1.5 ?滋g,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以β-actin為內(nèi)參照,進(jìn)行半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng):95 ℃ 5 min預(yù)變性,94 ℃ 45 s變性,56 ℃ 30 s退火,72 ℃ 45 s延伸,共35個(gè)循環(huán),最后一次循環(huán)在72 ℃延伸7 min。RT-PCR產(chǎn)物用含1.5%瓊脂糖凝膠電泳,Labwork成像系統(tǒng)采集圖像及分析。合成引物序列,MMP-9-上游引物:5′- AGGACGGCA ATGCTGAT-3′,下游引物:5′- CGCCACGA GGAACAAACT-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物為362 bp;TIMP-1-上游引物:5′- TTCCGACCTCGTCATCAG-3′,下游引物:5′- GCATTCCTCACAGCCAAC-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物為340 bp;β-actin-上游引物:5′- ATCGTGCGTGA CATTAAGG-3′,下游引物:5′-ACAGGACTCC ATGCCCAGG-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物為195 bp。
1.6 ELISA測定
收集細(xì)胞上清液,4 ℃,3 000 r/min離心10 min,取上清,-80 ℃保存待檢。ELISA采用雙抗體夾心法,按照說明書步驟進(jìn)行,測定細(xì)胞上清MMP-9、TIMP-1濃度。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,三組間比較用單因素方差分析,兩組間比較用LSD-t 檢驗(yàn),應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P< 0.05 為差異有顯著性。
2 結(jié) 果
2.1 辛伐他汀含藥血清對(duì)U937單核源巨噬細(xì)胞MMP-9 mRNA表達(dá)的影響
與相同濃度NL組相比,5%、10%、20%AS組MMP-9 mRNA表達(dá)均顯著性增高(P值均< 0.05)。與相同濃度AS組相比,5%、10%、20%SIM組MMP-9 mRNA表達(dá)均顯著性降低(P值分別為0.005、0.041和0.013)。與相同濃度NL組相比,5%、10%SIM組MMP-9 mRNA表達(dá)均增高(P值分別為0.034和0.029,表1、圖1)。
不同濃度間SIM組MMP-9 mRNA表達(dá)差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.747,P=0.252)。
2.2 辛伐他汀含藥血清對(duì)U937單核源巨噬細(xì)胞TIMP-1 mRNA表達(dá)的影響
NL組、AS組和SIM組不同濃度之間TIMP-1 mRNA表達(dá)無顯著差異(表2、圖2)。5%、10%和20%SIM組之間TIMP-1 mRNA的表達(dá)有顯著性差異(F= 6.498,P=0.032)。與5%SIM組相比,10%、20%SIM組TIMP-1 mRNA的表達(dá)顯著性增加(P=0.039、0.014),而10%與20%SIM組之間無顯著性差異(P=0.446)。
2.3 辛伐他汀含藥血清對(duì)U937單核源巨噬細(xì)胞MMP-9蛋白分泌的影響
與同濃度NL組比較,10%、20%AS組MMP-9分泌均顯著性增加(P=0.007、0.002);5%、10%、20%SIM組MMP-9分泌無顯著性差異(P=0.824、0.857、0.658)。與同濃度AS組比較,5%SIM組MMP-9分泌無顯著性差異(P=0.427),10%、20%SIM組MMP-9分泌顯著性減少(P=0.009、0.001,表3)。
SIM組不同濃度之間MMP-9分泌無顯著性差異(F=0.985,P=0.427)。
2.4 辛伐他汀含藥血清對(duì)U937單核源巨噬細(xì)胞TIMP-1蛋白分泌的影響
與同濃度NL組比較,AS組TIMP-1分泌均顯著性減少(P=0.004、0.044、0.003);與同濃度NL組比較,5%SIM組TIMP-1分泌減少(P=0.038)。與同濃度AS組比較,10%、20%SIM組TIMP-1分泌均顯著性增加(P=0.017、0.001,表4)。
SIM組不同濃度之間TIMP-1分泌有顯著性差異(F=6.555,P=0.031)。與5%SIM組相比,10%、20%SIM組 TIMP-1分泌均顯著性增加(P=0.038和0.014)。而10%和20%含藥血清之間差異無顯著性(P=0.456)。
3 討 論
3. 1 MMP/TIMP與動(dòng)脈粥樣斑塊穩(wěn)定性
急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者是易損病人[1],通常指在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的基礎(chǔ)上,斑塊破裂,繼而血小板粘附聚集和血栓形成,引起完全或不完全的血管阻塞,導(dǎo)致不穩(wěn)定型心絞痛、非ST段抬高心肌梗死、ST段抬高心肌梗死及猝死。有報(bào)道[7-9]冠脈“罪犯”病變處多是軟斑塊、以正性重構(gòu)為主,常伴血栓形成。斑塊內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)過度降解,導(dǎo)致斑塊中膠原含量減少,纖維帽變薄,是影響斑塊穩(wěn)定的重要因素。斑塊破裂常發(fā)生在富含單核巨噬細(xì)胞的斑塊肩部,此處巨噬細(xì)胞可分泌大量MMP,促進(jìn)纖維帽降解[10]。MMP-9,又稱明膠酶B,是巨噬細(xì)胞分泌的主要基質(zhì)金屬蛋白酶。TIMP是MMP的抑制物,目前已發(fā)現(xiàn)有4種:TIMP-1~TIMP-4,它們均可與激活的MMP 呈1 ∶ 1結(jié)合,從而使MMP失活。用免疫組化方法檢測動(dòng)脈粥樣硬化斑塊顯示TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3顯著性增多,且多存在于斑塊肩部的巨噬細(xì)胞、纖維帽和脂核內(nèi),與MMP分布部位一致,部分抑制MMP的活性[11]。急性冠脈綜合征患者存在著由炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的以MMP-9升高為主的MMP-9/ TIMP-1失衡狀態(tài)[2]。因此MMP與TIMP之間的平衡,對(duì)斑塊穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)具有重要意義。研究還表明[12],MMP-9在轉(zhuǎn)錄水平上受多種細(xì)胞因子、生長因子及活性物質(zhì)的調(diào)節(jié),而TIMP的表達(dá)很少受細(xì)胞因子和生長因子的影響。本實(shí)驗(yàn)采用血清藥理學(xué)方法觀察到,與同濃度NL組相比較,5%、10%和20%AS組U937單核源巨噬細(xì)胞MMP-9表達(dá)均顯著性增高(P值均< 0.05)。這可能是因?yàn)橹鄻佑不逯泻休^高的低密度脂蛋白膽固醇,以及大量激活的炎性細(xì)胞因子、生長因子以及其他活性物質(zhì),促進(jìn)MMP -9的表達(dá)。與相同濃度NL組比較,AS組TIMP-1 mRNA表達(dá)無顯著性差異,但TIMP-1的分泌均顯著性減少(P< 0.05),提示動(dòng)脈粥樣硬化血清不但可使巨噬細(xì)胞MMP-9增加,同時(shí)還可使TIMP-1分泌增加(翻譯后水平)而表達(dá)(mRNA水平)并未增加,具體機(jī)制尚不清楚。
3. 2 他汀藥與MMP/TIMP
PROVE IT(TIMI-22)研究[13]顯示強(qiáng)化他汀治療可使ACS患者30 d的臨件減少,在穩(wěn)定的患者,使臨件長期降低,但其具體機(jī)制尚未完全明確。Luan等[14]報(bào)道,西立伐他汀呈劑量依賴性抑制兔平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9,但對(duì)TIMP-1和TIMP-2無影響。本研究顯示,與相同濃度AS組相比,5%、10%和20%SIM組MMP-9 mRNA表達(dá)均顯著性降低(P值< 0.05);10%、20%SIM組MMP-9蛋白的分泌顯著性減少(P值均< 0.01)。與相同濃度AS組相比,SIM組TIMP-1 mRNA表達(dá)無顯著性差異(P >0.05);但10%、20%SIM組TIMP-1分泌均顯著性增加(P值均< 0.01)。與Luan等[14]的報(bào)道有所不同,本研究顯示辛伐他汀不但在一定劑量范圍內(nèi)可抑制巨噬細(xì)胞MMP-9的轉(zhuǎn)錄與分泌,而且增加TIMP-1的分泌。這可能是辛伐他汀穩(wěn)定斑塊、減少臨件的機(jī)制之一。他汀具有多效作用(Pleiotropic effects)[15],除了調(diào)脂作用外,還有抗炎、改善內(nèi)皮功能等作用。辛伐他汀可能通過抑制巨噬細(xì)胞MMP-9的轉(zhuǎn)錄與分泌,同時(shí)還增加TIMP-1的分泌,從而調(diào)節(jié)MMP與TIMP之間的平衡,起到穩(wěn)定斑塊的作用。
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第4篇：巨噬細(xì)胞范文
[關(guān)鍵詞] 重組人粒巨噬細(xì)胞刺激因子；腫瘤化療；白細(xì)胞減少癥；血小板減少癥
[中圖分類號(hào)] R577+.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]C[文章編號(hào)]1674-4721（2011）07（b）-191-02
化療是惡性腫瘤綜合治療的主要手段之一，但化療往往會(huì)引起很多毒副反應(yīng)、并發(fā)癥及后遺癥，其中最常見的毒副反應(yīng)是骨髓抑制，由于紅細(xì)胞壽命較長，受影響相對(duì)較小，因而對(duì)白細(xì)胞和血小板的影響表現(xiàn)顯著，而當(dāng)白細(xì)胞減少或者血小板減少時(shí)，不得不推遲化療時(shí)間或者減少化療藥物劑量，以致中斷治療，影響療效，長時(shí)間粒細(xì)胞缺乏易并發(fā)感染，嚴(yán)重者可導(dǎo)致患者死亡，而血小板的減少則可能導(dǎo)致出血性疾病的發(fā)生。為了防止化療后白細(xì)胞及血小板降低，筆者對(duì)本院2009年5月~2010年12月收治的86例惡性腫瘤化療患者進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下：
1 資料與方法
1.1 一般資料
本院2009年5月～2010年12月收治的86例惡性腫瘤患者，其中，男39例，女47例，年齡26~73歲，平均52歲，胃癌25例，結(jié)直腸癌53例，乳腺癌8例。將86例惡性腫瘤患者隨機(jī)分為兩組，治療組44例，其中胃癌14例，結(jié)直腸癌26例，乳腺癌4例，對(duì)照組42例，其中胃癌11例，結(jié)直腸癌27例，乳腺癌4例。兩組患者的年齡、性別、所患疾病等一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。
1.2 治療方法
治療組在化療結(jié)束后24 h給予皮下注射重組人粒巨噬細(xì)胞刺激因子100 μg/d，以3 d為1個(gè)療程。對(duì)照組化療前1 d開始口服鯊肝醇，50 mg/次，3次/d，7 d為1個(gè)療程。兩組相同的疾病所給予的化療方案、藥物劑量及給藥時(shí)間完全相同，主要化療方案為：胃癌結(jié)直腸癌采用folfox4方案，乳腺癌采用TAC（多西他賽、表阿霉素、環(huán)磷酰胺）?；熃Y(jié)束后7 d查血常規(guī)，比較兩組的白細(xì)胞及血小板降低情況。
1.3 療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)
白細(xì)胞低于4.0×109/L為白細(xì)胞減少、血小板低于100×109/L為血小板減少，比較兩組白細(xì)胞及血小板減少有無差異。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理，對(duì)結(jié)果進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
治療組白細(xì)胞下降5例、血小板減少3例，對(duì)照組白細(xì)胞下降18例、血小板減少11例，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明重組人粒巨噬細(xì)胞刺激因子能有效的防治化療后白細(xì)胞及血小板減少癥。見表1。
3 討論
化療藥物引起的毒副反應(yīng)對(duì)化療的應(yīng)用有一定的影響，常見的毒副反應(yīng)是骨髓抑制，骨髓抑制的發(fā)生主要是由于化療藥物對(duì)骨髓干細(xì)胞的直接損傷和對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞、微循環(huán)結(jié)構(gòu)或功能損傷所致，造成骨髓抑制的程度及持續(xù)時(shí)間與藥物種類和劑量有關(guān)[1]。而骨髓抑制不但影響治療的繼續(xù)進(jìn)行，而且易導(dǎo)致細(xì)菌、真菌等微生物的感染，或者出血性疾病的發(fā)生，加重病情。雖然輸注血小板可以緩解血小板減少，但這種作用是暫時(shí)的，同時(shí)還可能帶來感染、輸血反應(yīng)和抗體產(chǎn)生等其他問題[2]。因此，在臨床上對(duì)促進(jìn)白細(xì)胞及血小板生長因子的需要十分迫切。在尋找血小板因子的過程中，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了促血小板生長素（TPO）、干細(xì)胞因子、白介素1、3、6、11和粒細(xì)胞集落刺激因子（GM）以及巨噬細(xì)胞集落刺激因子等。rhGM-CSF作為生長因子作用于造血干細(xì)胞，促進(jìn)其增殖和分化，刺激粒、單核巨噬細(xì)胞成熟，促進(jìn)成熟細(xì)胞向外周血釋放，并能促進(jìn)巨噬細(xì)胞及噬酸性細(xì)胞的多種功能，還作用于目前已知體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞，以促進(jìn)免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[3-4]。在臨床實(shí)踐中，rhGM-CSF已經(jīng)成功的用于治療對(duì)惡性腫瘤放、化療所致黏膜糜爛、潰瘍[5]。另外，GM-CSF在治療真菌感染中也能夠發(fā)揮良好的作用[6]，Peter BG等[7]對(duì)145例進(jìn)行自體干細(xì)胞移植患者的真菌感染情況進(jìn)行了回顧性分析，發(fā)現(xiàn)采用rhGM-CSF治療的70例患者中有2例存在真菌感染，發(fā)生率為2.9%；而在對(duì)照組，75例患者中有9例發(fā)生真菌感染，發(fā)生率為12%，兩者之間存在明顯差異，另外還發(fā)現(xiàn)有10例死亡患者，其中5例的死亡原因是真菌感染，且這5例中有4例是未用rhGM-CSF治療的。最近研究發(fā)現(xiàn)rhGM-CSF用于治療燒傷創(chuàng)面也有著很好的療效[8]。
本文通過對(duì)44例惡性腫瘤患者化療后應(yīng)用rhGM-CSF制劑進(jìn)行對(duì)照研究，結(jié)果治療組中白細(xì)胞下降5例、血小板減少3例，而在對(duì)照組，42例患者中有18例白細(xì)胞下降、11例血小板減少，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P＜0.05，兩者之間存在明顯差異。因此筆者研究證實(shí)rhGM-CSF能有效的防治化療后白細(xì)胞及血小板減少癥，使得化療能順利進(jìn)行。
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第5篇：巨噬細(xì)胞范文
【摘要】 目的 研究穿心蓮內(nèi)酯對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞氧化亞氮(NO)、腫瘤壞死因子(TNFα)和白細(xì)胞介素6(IL6)生成的影響。方法 培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，分別加入脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，終質(zhì)量濃度1 μg/mL)和不同濃度的穿心蓮內(nèi)酯(終濃度1、10、50 μmol/L)進(jìn)行干預(yù)，并設(shè)空白組和穿心蓮內(nèi)酯單獨(dú)作用組作為對(duì)照。取培養(yǎng)24 h細(xì)胞上清，用Griess法檢測NO產(chǎn)量;用Elisa法檢測TNFα、IL6濃度。結(jié)果 與空白組比較，LPS明顯促進(jìn)了RAW264.7細(xì)胞NO、TNFα、IL6等炎癥因子的生成;穿心蓮內(nèi)酯單獨(dú)作用不影響炎癥因子的表達(dá)，但穿心蓮內(nèi)酯能顯著下調(diào)LPS誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)，與LPS組差異有顯著性。結(jié)論 穿心蓮內(nèi)酯可明顯降低LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】 穿心蓮內(nèi)酯;巨噬細(xì)胞;炎癥因子;內(nèi)毒素
)Abstract:Objective To investigate the inhibitive effects of andrographolide on lipopolysaccharideinduced inflammation factors secretion in macrophage cells.Methods A macrophage cell line RAW264.7 cells were cultured in vitro，and treated with different concentration of andrpgrapholide in the presence or absence of lipopolysaccharide (LPS). The production of inflammatory factor nitric oxide (NO)，tumor necrosis factorα(TNFα) and interleukin6 (IL6) in the supernatant was measured by Griess reagent and Elisa，respectively.Results After stimulated with LPS，the content of NO，TNFα and IL6 were markedly upregulated. Pretreated with andrographolide significantly inhibited LPSinduced inflammation factors expression levels，which was statistically significant compared with LPS group(P
Key words:andrographolide;macrophage cells; inflammation factor; lipopolysaccharide
目前，炎癥在心血管疾病、腫瘤中的促進(jìn)作用日漸受到重視，抑制炎癥反應(yīng)防治心血管疾病及腫瘤成為研究的重點(diǎn)[1-2]。穿心蓮為爵床科植物穿心蓮屬植物穿心蓮干燥地上部分，作為常用中藥，具有清熱解毒、涼血消腫等功效。穿心蓮內(nèi)酯是穿心蓮的主要藥效成分，有研究表明，穿心蓮內(nèi)酯有顯著的抗炎活性，能抑制二甲苯和醋酸所致的小鼠毛細(xì)血管通透性增加，還對(duì)大鼠蛋清蛋白、角叉菜膠足趾注射致炎模型有明顯的抗炎作用[3]。炎癥反應(yīng)時(shí)，巨噬細(xì)胞在細(xì)菌及其內(nèi)毒素的刺激下，分泌大量的炎癥因子，如氧化亞氮(NO)、TNFα和IL1β等，這些炎癥因子又可以進(jìn)一步活化巨噬細(xì)胞，形成惡性循環(huán)，加重炎癥反應(yīng)。本研究通過觀察穿心蓮內(nèi)酯對(duì)NO、TNFα和IL1β等炎癥因子表達(dá)的影響，探討其抗炎活性。
1 材料與方法
1.1 試劑與儀器
穿心蓮內(nèi)酯(四川廣漢市維康植化有限公司);細(xì)菌內(nèi)毒素(LPS，E coli Serotype 055:B5，美國Sigma公司);NO檢測試劑盒(南京建成生物公司);TNFα、IL6 Elisa檢測試劑盒(美國R&D公司);胎牛血清(杭州四季青公司);DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司);酶標(biāo)儀(美國BioRad公司)。
1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及干預(yù)實(shí)驗(yàn)
小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞由本室保存。用完全DMEM培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、質(zhì)量濃度100 U/mL 青霉素和100 μg/mL鏈霉素)，體積分?jǐn)?shù)5%CO2，37 ℃條件下傳代培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的RAW264.7細(xì)胞，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰酶消化，用DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，接種到24 孔培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞生長至80%融合后，加入不同濃度的穿心蓮內(nèi)酯(終濃度分別為1、10、50 μmol/L)孵育1 h，然后加入LPS(終質(zhì)量濃度1 μg/mL)進(jìn)行刺激。實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組、穿心蓮內(nèi)酯單獨(dú)作用組、LPS組和穿心蓮內(nèi)酯加LPS組。
1.3 NO濃度測定
細(xì)胞加入刺激物后培養(yǎng)24 h，收集各處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用硝酸還原酶法檢測炎性介質(zhì)NO的濃度。操作步驟按試劑盒說明書完成。
1.4 細(xì)胞因子濃度測定
細(xì)胞加入刺激物后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集各處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用TNFα和IL6 Elisa試劑盒檢測上清液中細(xì)胞因子的含量。操作步驟按試劑盒說明書完成。
1.5 統(tǒng)計(jì)分析
所有數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行Student’s t檢驗(yàn)，P
2 結(jié)果
2.1 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞NO生成的影響
收集24 h細(xì)胞培養(yǎng)上清，用Griess法測定細(xì)胞上清中NO 的含量。結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，50 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯單獨(dú)作用并不影響巨噬細(xì)胞NO的表達(dá)(與正常對(duì)照組比較，P>0.05);1 μg/mL LPS刺激可以顯著誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW 264.7產(chǎn)生NO，而穿心蓮內(nèi)酯預(yù)干預(yù)能明顯抑制LPS引起的NO的釋放，并在1～50 μmol/L濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性。表1 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)NO分泌的影響
2.2 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞TNFα、IL6生成的影響
結(jié)果見表2。Elisa檢測結(jié)果顯示，在正常情況下巨噬細(xì)胞RAW264.7培養(yǎng)上清中TNFα、IL6含量極低，50 μmol/L濃度的穿心蓮內(nèi)酯單獨(dú)作用對(duì)其表達(dá)也無明顯影響(與正常對(duì)照組比較，P>0.05)。當(dāng)用1 μg/mL LPS刺激后，巨噬細(xì)胞TNFα和IL6的表達(dá)均明顯增高，與正常對(duì)照組比較，P
3 討論
近年來，炎癥在多種疾病中，尤其是心血管疾病和腫瘤中的作用引起了廣泛的關(guān)注。根據(jù)在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊有多種炎性細(xì)胞和炎癥因子存在等證據(jù)，Ross明確提出了動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的“炎癥學(xué)說”，指出慢性炎癥反應(yīng)是AS的主要發(fā)病機(jī)制[4]。隨后的研究證實(shí)，進(jìn)入血管壁的巨噬細(xì)胞可被氧化型低密度脂蛋白、革蘭陰性菌及其LPS活化，通過NFκB、iNOS和COX等途徑產(chǎn)生TNFα、IL6、NO、PGs等多種炎癥介質(zhì)，促進(jìn)AS斑塊的形成和發(fā)展，而抑制炎癥反應(yīng)可改善AS病變程度，進(jìn)一步說明了炎癥在AS中的關(guān)鍵性作用[5]。炎癥與腫瘤的關(guān)系很早就引起了人們的關(guān)注?，F(xiàn)代研究認(rèn)為，炎癥細(xì)胞主要通過分泌IL1、IL6、TNFα、NO、PGs及活性氧等炎癥因子，參與組成腫瘤微環(huán)境，影響腫瘤的進(jìn)程。這些炎癥因子不僅能誘導(dǎo)正常細(xì)胞的惡性病變，還可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)腫瘤血管形成，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中有重要作用[6]。2009年，Mantovani在Nature雜志上提出，與無限制性生長、轉(zhuǎn)移等特征一樣，炎癥性微環(huán)境與腫瘤關(guān)系密切，并認(rèn)為炎癥是腫瘤的7大重要標(biāo)志之一[2]?！”? 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)TNFα和IL6表達(dá)的影響
與正常對(duì)照組比較：**P
參考文獻(xiàn)
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第6篇：巨噬細(xì)胞范文
【關(guān)鍵詞】 白藜蘆醇；微小RNA-146a；肺泡巨噬細(xì)胞；腫瘤壞死因子-α
Effect of ResveRatRol on expRession of lipopolysacchaRide-induced micRoRNA-146a in alveolaR macRophages Zeng Zhenguo，Shao Qiang，Li Yong，Ding Chengzhi， Qing Cheng， Liu Fen， Zhan Yian， Nie Cheng， Jie Kemin， Gong Honghan， Qian Kejian. DepaRtment of CRitical CaRe Medicine， FiRst Affiliated Hospital， Medical College of Nanchang UniveRsity， Nanchang 330006， China
CoRResponding authoR： Qian Kejian，Email：qkj0607@sohu，com
【AbstRact】Objective To obseRve the effect of ResveRatRol on expRession of lipopolysacchaRide （LPS） -induced micRoRNA-146a （miR-146a） in alveolaR macRophages. Methods Rat alveolaR macRophages（NR8383）weRe seeded at 2×106cell/poRe in 6 well plates in vitRo and incubated foR 90 min. NR8383 weRe Randomly divided into fouR gRoups： contRol gRoup， NR8383 stimulated with phosphate buffeR solution （PBS）； LPS-stimulated gRoup， NR8383 stimulated with 1μg/mL of LPS； ResveRatRol-tReated gRoup， NR8383 tReated with diffeRent concentRations of ResveRatRol （1 μg/mL oR 10 μg/mL） foR 30 min， then stimulated with 1 μg/mL of LPS. AfteR incubation foR 6 h， the cells weRe haRvested and the supeRnatant of cell cultuRe medium was collected. The expRession of miR-146a of cells was detected by using fluoRoilluminance Real-time quantitative PCR device， and the levels of TNF-α pRotein in the supeRnatant weRe assayed by using enzyme-linked immunosoRbent assay （ELISA）.Results CompaRed with contRol gRoup， the expRession of miR-146a and the level of TNF-α weRe significantly incReased in LPS stimulated gRoup （miR-146a’ s expRession folds： 5，92±1，57 vs 1，03±0，58，P
【Key woRds】ResveRatRol； MicRoRNA-146a； AlveolaR macRophages； TumoR necRosis factoR-α
大量臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明，白藜蘆醇對(duì)膿毒癥肺損傷具有保護(hù)作用[1-5]。微小RNA-146a（miR-146a）是TLRs/NF-κB炎癥通路中重要的負(fù)反饋調(diào)控介質(zhì)，能夠抑制炎癥反應(yīng)[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a參與了肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，有望成為抑制肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的新途徑[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇與miRNA關(guān)系密切，有可能通過miRNA發(fā)揮其抗炎作用[9-11]。然而，在肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型中，白藜蘆醇是否影響miR-146a的表達(dá)以及是否通過上調(diào)miR-146a的表達(dá)來抑制炎癥介質(zhì)釋放均未見報(bào)道。
1 材料與方法
1，1 實(shí)驗(yàn)材料
大鼠肺泡巨噬細(xì)胞株NR8383（中國科學(xué)院細(xì)胞庫），胎牛血清（美國HyClone），Ham’ s F-12K培養(yǎng)基（美國Sigma-AldRich），LPS（E，coli 0111∶ B4，美國Sigma-AldRich），白藜蘆醇（美國Enzo life sciences），TRIzol Reagent（美國InvitRogen），四甲基偶氮唑鹽（MTT，北京索來寶科技有限公司），TaqMan UniveRsal 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測試劑盒、TaqMan MicRoRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqMan MicRoRNA 檢測試劑盒（美國ABI），十二烷基硫酸鈉（SDS，美國Sigma-AldRich），大鼠TNF-α ELISA試劑盒（上海明睿生物），氯仿、異丙醇、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純。
1，2 細(xì)胞培養(yǎng)
R8383細(xì)胞培養(yǎng)于含15%FBS、1，5 g/L碳酸氫鈉、2 mmol L-谷氨酰胺的Ham’ s F-12K完全培養(yǎng)基中，置于大氣壓下37 ℃、含5%體積分?jǐn)?shù)CO2的溫濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d更換培養(yǎng)液，3～4 d傳代1次。
1，3 MTT比色法檢測白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞活性的影響
取指數(shù)生長期NR8383細(xì)胞，按每孔細(xì)胞0，5×104個(gè)接種至96孔板。細(xì)胞貼壁90 min后，分別加入0，1、1、10、50、100 μg/mL終質(zhì)量濃度的白藜蘆醇，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組（等體積PBS替代白藜蘆醇）和陽性對(duì)照組（等體積10%二甲亞砜替代白藜蘆醇）。加藥后細(xì)胞再培養(yǎng)48 h，加入5 g/L MTT 溶液20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入三聯(lián)溶解液100 μL/孔，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育8 h，用酶標(biāo)儀（波長570 nm）測定各孔的吸光度（OD 570 nm）值。
1，4 細(xì)胞處理及分組
取指數(shù)生長期NR8383細(xì)胞，按每孔細(xì)胞2×106個(gè)接種至6孔板。細(xì)胞培養(yǎng)90 min后，分為以下四組：（1） LPS處理組：培養(yǎng)板中加入LPS溶液（終質(zhì)量濃度1 μg/mL）；（2） PBS對(duì)照組：培養(yǎng)板中加入等體積PBS溶液；（3） 白藜蘆醇+LPS組：培養(yǎng)板中加入不同濃度白藜蘆醇溶液（終質(zhì)量濃度1 μg/mL、10 μg/mL）預(yù)處理30 min后，加入LPS溶液（終質(zhì)量濃度1 μg/mL）。細(xì)胞培養(yǎng)6 h后，離心收集細(xì)胞上清液和細(xì)胞團(tuán)塊，保存于-80 ℃冰箱，分別用于ELISA檢測和細(xì)胞總RNA提取。
1，5 檢測指標(biāo)及方法
1，5，1 TNF-α蛋白測定 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，檢測按照ELISA試劑盒使用說明書進(jìn)行檢測。
1，5，2 miR-146a表達(dá)測定 采用TRIzol法提取細(xì)胞中的總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性及純度，紫外分光光度計(jì)測定總RNA濃度。采用TaqMan MicRoRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。采用TaqMan UniveRsal 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃ 10 Rain；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，在ABI 7500定量PCR儀上擴(kuò)增和檢測。操作均按說明書進(jìn)行，所有操作均在冰上完成。選取U6 snRNA作為內(nèi)參照，miR-146a的相對(duì)表達(dá)量采用2-Ct計(jì)算。
1，6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用SPSS 13，0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P
2 結(jié)果
2，1 MTT比色法檢測白藜蘆醇對(duì)NR8383
細(xì)胞活性的影響
白藜蘆醇在0，1～100 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)NR8383細(xì)胞無毒性作用。見圖1。
2，2 TNF-α蛋白含量及細(xì)胞內(nèi)miR-146a的表達(dá)變化
表1顯示，與PBS對(duì)照組相比，LPS處理組TNF-α蛋白含量及miR-146a表達(dá)均明顯升高（P
3 討論
膿毒癥并發(fā)急性肺損傷是膿毒癥高病死率的主要原因[12，13]，如果發(fā)生膿毒癥時(shí)避免或減輕肺損傷的發(fā)生，將有助于提高膿毒癥患者的成功救治率。肺組織中最多的非實(shí)質(zhì)性細(xì)胞是肺泡巨噬細(xì)胞[14]，膿毒癥發(fā)生時(shí)，肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)TLRs/NF-κB炎癥通路活化，導(dǎo)致大量炎癥基因的轉(zhuǎn)錄活化，失控性釋放大量炎癥因子，形成肺內(nèi)炎癥“瀑布”反應(yīng)，導(dǎo)致ALI的發(fā)生。LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要致病成分，是導(dǎo)致TLRs/NF-κB活化的常見因子。本研究結(jié)果顯示，LPS刺激肺泡巨噬細(xì)胞后，導(dǎo)致TNF-α分泌顯著增加。
白藜蘆醇是一種多酚類化合物，是天然的植物抗菌素。它能夠抑制肺泡巨噬細(xì)胞的活化，減少細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的釋放，避免或減輕膿毒癥時(shí)肺損傷，提高膿毒癥時(shí)肺損傷的治療效果[1-5，15]。本實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)，白藜蘆醇預(yù)處理大鼠肺泡巨噬細(xì)胞后，能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-α 的產(chǎn)生，并且其抑制作用呈劑量依賴性。
miRNAs是一類小的內(nèi)源性非編碼RNA，通過識(shí)別靶基因mRNA的3’ 端非編碼區(qū)來抑制靶蛋白的翻譯或促進(jìn)靶基因的降解[16-17]。miRNAs通過抑制炎癥相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，在炎癥反應(yīng)調(diào)控中具有重要作用。miR-146a在TLRs/NF-κB通路中具有重要調(diào)控作用。它的靶基因是TLRs/NF-κB通路中的兩個(gè)重要接頭蛋白編碼基因IRAK-1和TRAF-6。miR-146a上調(diào)后將負(fù)性調(diào)控TLRs/NF-κB通路，能夠抑制炎癥介質(zhì)的升高[6，18]。并且已證實(shí)miR-146a參與調(diào)節(jié)了LPS誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)[7-8]。在本實(shí)驗(yàn)中，用LPS刺激肺泡巨噬細(xì)胞后，也誘導(dǎo)了miR-146a的表達(dá)上調(diào)，與前者報(bào)道結(jié)果相似。
研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇通過影響miRNA前體的轉(zhuǎn)錄和miRNA的加工成熟，能特異性地引起一些miRNAs改變，包括miR-21、miR-146a、miR-663等，這些miRNAs都參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控[9-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇預(yù)處理大鼠肺泡巨噬細(xì)胞后，能明顯促進(jìn)miR-146a的表達(dá)上調(diào)，并且相比于較低質(zhì)量濃度白藜蘆醇組（1 μg/mL組），較高質(zhì)量濃度白藜蘆醇組（10 μg/mL）更能誘導(dǎo)miR-146a的表達(dá)。
綜上所述，在LPS誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中，白藜蘆醇能夠抑制炎癥因子TNF-α的產(chǎn)生，并上調(diào)miR-146a的表達(dá)，由此筆者可以推測，白藜蘆醇調(diào)控炎癥的機(jī)制之一可能是通過升高細(xì)胞內(nèi)miR-146a的表達(dá)水平來發(fā)揮其抗炎作用。
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（收稿日期：2013-05-07）
DOI：10，3760/cma，j，issn，1671-0282，2014，01，009
基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（81060152）；江西省自然科學(xué)基金（2009GZY0215）
作者單位：330006 南昌，南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（曾振國、邵強(qiáng)、丁成志、卿城、劉芬、詹以安、聶成、錢克儉），腫瘤科（李勇），影像科（龔洪翰）；南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室（揭克敏）
第7篇：巨噬細(xì)胞范文
［摘要］目的:觀察亞硒酸鈉與硫酸鎂單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)染塵肺泡巨噬細(xì)胞丙二醛（MDA）、過氧化氫（H2O2）及過氧化氫酶（CAT）水平變化的影響，尋找二者的最佳劑量組合。方法:采用大鼠肺灌洗法純化獲得肺泡巨噬細(xì)胞（1×109 L-1），同時(shí)加入SiO2及不同濃度的亞硒酸鈉溶液、硫酸鎂溶液、亞硒酸鈉+硫酸鎂溶液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)條件下培養(yǎng)18 h后，檢測MDA、H2O2含量及CAT活性。結(jié)果:亞硒酸鈉與硫酸鎂單獨(dú)以及兩者聯(lián)合應(yīng)用都可以使SiO2染毒的肺泡巨噬細(xì)胞MDA及H2O2含量下降，CAT活性有所增高，且以10μmol?L-1亞硒酸鈉與10μmol?L-1硫酸鎂聯(lián)合作用效果最好。結(jié)論:亞硒酸鈉與硫酸鎂在體外可有效拮抗SiO2粉塵的細(xì)胞毒性作用，二者合用效果更佳。
［關(guān)鍵詞］二氧化硅;亞硒酸鈉;硫酸鎂;肺泡巨噬細(xì)胞;氧化損傷;大鼠
硒與鎂是人體必需的元素，具有許多極為重要的生理生化作用，參與機(jī)體多種酶的構(gòu)成，在體內(nèi)抗氧化過程中發(fā)揮重要作用。已有研究證明，硒在體外有一定拮抗粉塵細(xì)胞毒性的作用［12］。硫酸鎂在拮抗SiO2細(xì)胞毒性的作用與及硒、鎂兩種物質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用的研究尚未見報(bào)道。本研究主要探討硒、鎂兩種元素單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)染塵巨噬細(xì)胞丙二醛（MDA）、過氧化氫（H2O2）含量及過氧化氫酶（CAT）活性的影響，以期為礦物元素應(yīng)用于矽肺的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1 材料與方法
11 材料
111 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量180～220g，由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
112 石英粉塵 采用標(biāo)準(zhǔn)的SiO2粉塵，由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，游離SiO2的含量大于97％，粒徑小于5μm的占95％以上，臨用前新鮮研磨后用生理鹽水配成10g?L-1的懸液待用。
113 RPMI 1640培養(yǎng)液 日本產(chǎn)RPMI 1640培養(yǎng)基干粉，每袋104g，溶于1 000ml去離子水，抽濾除菌并分裝，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。?nèi)含2mmol?L-1的L谷氨酰胺、100U?ml-1青霉素、100μg?ml-1鏈霉素。臨用前加入10%小牛血清。
114 亞硒酸鈉（Na2SeO3） 由上海金山縣興塔化工廠生產(chǎn)，分析純，批號(hào)：940802，臨用前用生理鹽水配成1.0mmol?ml-1的溶液待用。
115 硫酸鎂（MgSO4） 由上海試四赫維化工有限公司生產(chǎn)，分析純，批號(hào)：041107，臨用前用生理鹽水配成05mmol?ml-1的溶液待用。
116 MDA、H2O2、CAT試劑盒 由南京建成生物工程研究所提供。
12 方法
121 肺泡巨噬細(xì)胞（AM）的獲取與培養(yǎng) 大鼠股動(dòng)脈放血處死，在無菌條件下進(jìn)行肺灌洗，收集灌洗液，細(xì)胞純化后調(diào)整濃度為1×109 L-1。按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分成：（1）陰性對(duì)照組（生理鹽水）。（2）SiO2組，含SiO2200μg?ml-1。（3）Na2SeO3組，內(nèi)含SiO2200μg?ml-1外，Na2SeO3設(shè)05、10、20μmol?L-1 3個(gè)濃度。（4）MgSO4組，內(nèi)含SiO2200μg?ml-1外，MgSO4設(shè)05、10、20μmol?L-1 3個(gè)濃度。 （5）Na2SeO3與MgSO4聯(lián)合應(yīng)用組，內(nèi)含SiO2200μg?ml-1外，Na2SeO3與MgSO4各按上述3種劑量采用正交表L9(34)的設(shè)計(jì)，共9個(gè)劑量組。均于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h后檢測各指標(biāo)。
122 檢測指標(biāo) MDA、H2O2、CAT均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，操作方法嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。
13 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SAS82軟件進(jìn)行完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料方差分析及正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析。
2 結(jié)果
21 Na2SeO3單獨(dú)作用對(duì)染塵AM MDA、H2O2和CAT水平的影響
SiO2粉塵組AM中MDA及H2O2含量增加，CAT的活性降低，與陰性對(duì)照組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 005)。不同劑量Na2SeO3單獨(dú)作用后MDA及H2O2含量下降，CAT活性有所增高，其中以加入的20μmol?L-1 Na2SeO3組的效果最明顯。見表1。
表1 Na2SeO3單獨(dú)作用18 h后染塵AM中MDA、H2O2含量和CAT活性的變化（略）
注：A組為200mg?L-1 SiO2;B組為200mg?L-1 SiO2+05μmol?L-1 Na2SeO3;C組為200mg?L-1 SiO2+10μmol?L-1 Na2SeO3;D組為200mg?L-1 SiO2+20μmol?L-1 Na2SeO3
1)與A組比較，P
22 MgSO4單獨(dú)作用對(duì)染塵AM MDA、H2O2和CAT水平的影響SiO2粉塵組AM中MDA及H2O2含量增加，CAT的活性降低，與陰性對(duì)照組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P
表2 MgSO4單獨(dú)作用18 h后染塵AM中MDA、H2O2含量和CAT活性的變化（略）
注：A組為200mg?L-1 SiO2;B組為200mg?L-1 SiO2+ 05μmol?L-1 MgSO4;C組為200mg?L-1 SiO2+ 10μmol?L-1 MgSO4;D組為200mg?L-1 SiO2+ 20μmol?L-1 MgSO4。A組為200mg?L-1 SiO2;B組為200mg?L-1 SiO2+05μmol?L-1 Na2SeO3;C組為200mg?L-1 SiO2+10μmol?L-1 Na2SeO3;D組為200mg?L-1 SiO2+20μmol?L-1 Na2SeO3
1)與A組比較，P
23 Na2SeO3與MgSO4聯(lián)合作用對(duì)染塵AM MDA、H2O2和CAT水平的影響SiO2組AM中MDA及H2O2含量增加，CAT的活性降低，與陰性對(duì)照組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P
表3 Na2SeO3與MgSO4聯(lián)合作用18 h后染塵AM中MDA、H2O2、CAT的變化（略）
1)與200mg?L-1 SiO2組比較，P
3 討論
SiO2致肺泡AM損傷是矽肺發(fā)病的重要環(huán)節(jié)之一，SiO2粉塵進(jìn)入機(jī)體后可引發(fā)肺泡巨噬細(xì)胞的自由基和脂質(zhì)過氧化自由基反應(yīng)。硒、鎂是人體必需的元素， 參與機(jī)體多種酶的組成，涉及生物體內(nèi)的細(xì)胞代謝，具有重要的生理功能。研究證實(shí)，硒、鎂和矽肺之間有密切相關(guān)的聯(lián)系［34］。MDA作為脂質(zhì)過氧化作用的主要產(chǎn)物之一，可通過共價(jià)烷化賴氨酸、組氨酸和半胱氨酸對(duì)蛋白質(zhì)加以修飾，引起蛋白變性［5］。MDA可以與蛋白質(zhì)游離氨基作用，引起蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間交聯(lián)［6］。Hartley等［7］用四氯化碳、鐵/抗壞血酸誘發(fā)肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，采用兔多克隆抗體測定MDA加合物，發(fā)現(xiàn)了13種丙二醛修飾蛋白。MDA 與蛋白結(jié)合后可導(dǎo)致蛋白對(duì)酶解作用的敏感性下降［8］。過多的H2O2和超氧化物反應(yīng)可形成活性更強(qiáng)的?OH，后者參與脂質(zhì)氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，還可直接結(jié)合到DNA上形成羥化反應(yīng)；H2O2可被髓過氧化物酶代謝，產(chǎn)生的衍生物次鹵酸，也有很強(qiáng)的活性［5］。自由基的清除依賴于非酶類抗氧化劑和酶類抗氧化劑。CAT是重要的酶類抗氧化劑，廣泛分布于各種組織細(xì)胞中，在H2O2濃度較高時(shí)，可催化H2O2轉(zhuǎn)變成H2O與O2。硒與硒的化合物在消除自由基、抗脂質(zhì)過氧化方面發(fā)揮重要作用，可清除脂質(zhì)過氧化自由基中間產(chǎn)物，分解脂質(zhì)氫過氧化物，修復(fù)自由基引起的硫化物的分子損傷，在自由基破壞生命物質(zhì)前將其清除或轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定化合物，還能催化巰基化合物作為保護(hù)劑的反應(yīng)。有研究表明，鎂可減少缺血后再灌注心肌乳酸脫氫酶的漏出， 維持谷胱甘肽過氧化物酶的活性，降低心肌組織中的丙二醛含量，從而減少氧自由基的產(chǎn)生，起到抗脂質(zhì)過氧化而保護(hù)心肌細(xì)胞的作用［911］，Mg 2+對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞及培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞羥自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)損傷有保護(hù)作用［1213］，鎂還作為鈣的拮抗劑減少自由基的生成，減輕膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)［14］。
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第8篇：巨噬細(xì)胞范文
學(xué)意義; 甘露糖不能誘導(dǎo)Mφ分泌TNFα與IL4。結(jié)論: RTP引起的Mφ分泌TNFα作用是通過甘露糖受體介導(dǎo)， 而APS的作用不僅僅與甘露糖受體有關(guān)。兩種多糖與甘露糖受體的作用差異可能與其單糖組成密切相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】 巨噬細(xì)胞 甘露糖受體 大黃多糖 當(dāng)歸多糖 腫瘤壞死因子 白細(xì)胞介素4
許多中藥多糖能夠刺激巨噬細(xì)胞（Macrophage， Mφ）釋放前炎癥因子或者某些細(xì)胞因子， 推測其可能機(jī)制與Mφ膜上的模式識(shí)別受體（pathogen recognition， PRR）結(jié)合引起細(xì)胞內(nèi)某些信號(hào)通路的活化有關(guān)。前期研究發(fā)現(xiàn)， 當(dāng)歸多糖（Angelica sinensis Diel polysaccharide， APS）能夠促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的成熟， 增強(qiáng)抗原提呈能力［1， 2］; 促進(jìn)脾細(xì)胞IL2、 IFNγ的分泌［3］; 而RTP（Rheum tanguticum polysaccharide， RTP）能夠?qū)菇Y(jié)腸炎大鼠CD4+T細(xì)胞的擴(kuò)增， 降低克隆氏病大鼠IFNγ的升高， 升高結(jié)腸炎小鼠降低的IL4水平［4， 5］。但是RTP和APS的免疫反應(yīng)作用機(jī)制， 尚不清楚。
Mφ是體內(nèi)特定的吞噬細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞， 是連接先天免疫系統(tǒng)及后天免疫系統(tǒng)的橋梁。其表面眾多膜受體參與完成這些功能， Mφ甘露糖受體(Macrophage Mannose receptor， MMR)為其中之一。研究表明， MR是一種PRR， 可特異性地識(shí)別以甘露糖、 N乙酰葡糖胺或巖藻糖為末
端的配體并與之結(jié)合［6］， 這些配體可來源于內(nèi)源性或外源性分子。推測MR在病原體的識(shí)別、 吞噬與清除， 在結(jié)核、 腫瘤、 感染等許多疾病過程中都發(fā)揮著重要的作用。我們的研究表明， RTP含有近50%的甘露糖［7］， 組分RTP1， RTP2所含單糖比例不同; APS則含有N乙酰
葡糖胺殘基［1］， 組分APS1， APS2， APS3所含單糖比例也不同。這兩種多糖的免疫調(diào)節(jié)作用可能是通過MMR而起效的。本研究將探討APS混合組分、 RTP混合組分對(duì)Mφ吞噬及分泌細(xì)胞因子的影響， 以揭示兩種中藥多糖的免疫調(diào)節(jié)作用。
1 材料和方法
1.1 材料
SD大鼠（200～220 g， 雌雄各半）， 由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供， 動(dòng)物分籠飼養(yǎng)于空調(diào)溫室內(nèi)， 溫度22±2℃， 相對(duì)濕度50%～60%， 自動(dòng)調(diào)控晝夜各12 h， 顆粒飼料喂養(yǎng)， 自由飲水。RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司， 胎牛血清購自杭州四季青公司生物制品廠， PBS緩沖液購自博士德生物工程公司， 甘露糖購自上海試劑二廠; 半乳糖購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; APS及RTP由我實(shí)驗(yàn)室提供， EDTA以及異硫氰酸熒光素標(biāo)記的甘露糖化牛血清白蛋白(ManFITCBSA) 購自Sigma公司; GENios pro多功能酶標(biāo)儀為瑞士TENCN公司產(chǎn)品; Nikon H600L熒光顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品。
1.2 方法
1.2.1 腹腔Mφ的分離、 純化及培養(yǎng)
取6只雌性SD大鼠， 乙醚麻醉， 750 mL/L乙醇浸泡1 min， 取出， 消毒腹部皮膚， 打開腹壁， 但勿傷及腹膜。用注射器向腹腔內(nèi)注入PBS 10 mL， 輕揉腹腔5 min， 剪開腹膜， 用吸管吸取腹腔內(nèi)液體， 注入離心管， 1 000 r/min 離心5 min。棄上清， 分別加入6 mL含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液， 吹打混勻后計(jì)數(shù)， 調(diào)整細(xì)胞密度為1×109個(gè)/L， 分別接種腹腔Mφ于對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)板中， 置37℃ 50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)。3 h后輕輕吸棄培養(yǎng)液后， 再用PBS洗去未貼壁細(xì)胞， 重復(fù)3次， 每孔加入含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液， 用姬姆薩瑞氏染色法染色， 觀察Mφ占 95％以上［8］。純化后的單層大鼠腹腔Mφ用含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液置于37℃ 50
mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)。
1.2.2 熒光顯微鏡觀察MFITCBSA與Mφ的結(jié)合能力
取純化腹腔Mφ， 以每孔1×106個(gè)腹腔Mφ接種于底部覆蓋玻片的6孔培養(yǎng)板， 純化后分為3組: 空白對(duì)照組（2 mL 500 mL/L RPMI1640/PBS緩沖液）; ManFITCBSA陽性對(duì)照組（2 mL 0.01 g/L ManFITCBSA）; 甘露糖加MFITCBSA實(shí)驗(yàn)組（1 mL 1 g/L Man+1 mL 0.01 g/L ManFITCBSA）。用錫鉑紙包嚴(yán)培養(yǎng)板， 置37℃ 50 mL/L CO2孵箱中避光孵育60 min; 用PBS沖洗接種有Mφ的蓋玻片3遍， 40 g/L多聚甲醛固定30 min， PBS洗片， 晾干后滴上500 mL/L的甘油PBS 10 μL， 石蠟封片， 4℃短時(shí)儲(chǔ)存留待觀察。熒光顯微鏡激發(fā)光譜495 nm， BA520阻擋濾光片， DM505二向分色濾光片。
1.2.3 多糖對(duì)Mφ吞噬ManFITCBSA的影響
取純化腹腔Mφ， 以每孔1×104個(gè)接種于Costar96孔底部透明板， 置37℃及4℃， 50 mL/L CO2孵箱中孵育4 h， PBS沖洗3遍， 分別加入不同濃度的甘露糖（Man）、 半乳糖(GaL)、 APS混合組分、 RTP混合組分以及ManFITCBSA， 每組3個(gè)孔各加100 μL， 置37℃及4℃， 50 mL/L CO2孵箱中避光孵育60 min后， 棄上清， PBS沖洗3遍， 重復(fù)3次［9］。
1.2.4 多糖對(duì)Mφ分泌細(xì)胞因子的影響
取純化Mφ， 以每孔1×104個(gè)腹腔Mφ接種于Costar96孔培養(yǎng)板， 分別與APS、 RTP、 Man、 APS+ Man
、 RTP+ Man在37℃， 50 mL/L CO2孵箱中培養(yǎng)36 h， 取細(xì)胞上清按照試劑盒說明（Rat IL4 ELISA Kit， Rat TNFα ELISA Kit， BOSTER）測定細(xì)胞因子水平。簡述如下: 在酶標(biāo)板加入100 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 在反應(yīng)孔中加入待測樣品的Mφ培養(yǎng)液上清各100
μL， 然后加入100 μL生物素標(biāo)記抗體， 37℃反應(yīng)1 h， 0.01 mol/L PBS洗板3次， 然后每孔加入100 μL親和素過氧化物酶復(fù)合物（ABC）， 37℃反應(yīng)30 min， 洗板5次， 加入TMB顯色液， 避光反應(yīng)10～25 min， 加入TMB中止液， 450 nm測定光吸收值。
1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
數(shù)據(jù)以x±s表示， 利用SPSS11.0軟件進(jìn)行分析， 顯著性檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)及SNKq檢驗(yàn)， P
2 結(jié)果
2.1 甘露糖抑制Mφ吞噬ManFITCBSA 采用熒光顯微鏡觀察腹腔Mφ吞噬ManFITCBSA的情況(圖1A)， 通過競爭抑制試驗(yàn)觀察到: D甘露糖可以抑制該現(xiàn)象(圖1B)。
2.2 多糖對(duì)Mφ吞噬功能的影響
采用多功能酶標(biāo)儀檢測Mφ吞噬ManFITCBSA的能力， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明: 在37℃時(shí)， Mφ吞噬活性與ManFITCBSA濃度呈正相關(guān)， 在4℃時(shí)， ManFITCBSA與Mφ為非特異性吸附， 熒光強(qiáng)度不隨ManFITCBSA濃度改變而發(fā)生變化（圖2）; ManFITCBSA與MMR的結(jié)合為Ca2+依賴性， EDTA可阻斷該過程（圖3）， 其阻斷能力與EDTA濃度呈正
相關(guān); 甘露糖作為MR的阻斷劑， 也阻斷該過程， 其拮抗能力與甘露糖濃度相關(guān)， 半乳糖則不能阻斷MR介導(dǎo)的Mφ對(duì)ManFITCBSA的吞噬作用（圖4）; APS、 RTP均可阻滯Mφ吞噬ManFITCBSA的作用， 且呈劑量依賴性(圖5、 6)。
2.3 多糖刺激Mφ釋放TNFα， IL4的測定
采用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中TNFα和IL4水平， 體外將APS和RTP與Mφ共孵育36 h， 可以促進(jìn)正常腹腔Mφ分泌TNFα(圖6)， 與正常對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P
3 討論
我們已發(fā)現(xiàn)， RTP與APS均具有免疫調(diào)節(jié)作用， 但它的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)證明RTP、 APS均可抑制Mφ吞噬ManFITCBSA，提示RTP、 APS的免疫調(diào)節(jié)作用可能通過MR介導(dǎo)。
許多中藥多糖富含甘露糖或葡萄糖， 且以反復(fù)串聯(lián)的結(jié)構(gòu)存在， 與MR具有比MRmAb更高的結(jié)合特性［10］。如殼寡糖可通過Mφ表面的MR， 產(chǎn)生白介素1β和TNFα［11］; 海帶多糖能激活小鼠腹腔Mφ， 對(duì)S180腫瘤細(xì)胞有較好的殺傷作用［12］。我們的研究表明RTP含有近50%的甘露糖， 而APS則含有N乙酰葡糖胺殘基， 因此， RTP、 APS具有潛在的MR結(jié)合特性。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， RTP與APS均可以阻斷MR介導(dǎo)的Mφ吞噬作用， 且這種作用呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系， 為兩種多糖作用于MR提供了依據(jù)。
為了進(jìn)一步研究兩種多糖與MR的作用， 我們發(fā)現(xiàn)RTP和APS均可以促進(jìn)Mφ分泌細(xì)胞因子TNFα， 而MR的拮抗劑甘露糖可完全阻斷RTP刺激Mφ分泌TNFα的作用， 說明RTP是通過MR而起作用; 甘露糖則沒有該作用; RTP和APS對(duì)Mφ分泌細(xì)胞因子IL4無明顯影響， 揭示RTP和APS影響Mφ的免疫功能主要通過Th1型細(xì)胞免疫發(fā)揮作用， 同時(shí)提示我們以前實(shí)驗(yàn)中RTP和APS影響T細(xì)胞極化可能通過MR起作用。
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第9篇：巨噬細(xì)胞范文
【摘要】
目的: 分析連翹(FS )對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的體外吞噬和體外NO釋放的影響。方法: 無菌收集小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和羧基熒光素乙酰乙酸琥珀酰亞胺酯(CFDASE)標(biāo)記大腸桿菌DH5α， 短期培養(yǎng)3 h后流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析FS對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞體外吞噬的影響。用LPS體外刺激活化腹腔巨噬細(xì)胞， Griess Reagent試劑盒檢測并分析FS對(duì)巨噬細(xì)胞體外釋放NO的影響。結(jié)果: FCM分析顯示， 終濃度為40、 80、 160 mg/L的FS對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞體外吞噬具有明顯的促進(jìn)作用(P
【關(guān)鍵詞】 連翹提取物 腹腔巨噬細(xì)胞 吞噬 NO釋放
［Abstract］ AIM: To investigate the effect of forsythia suspensa (FS) extract on phagocytosis of peritoneal macrophages and NO production in vitro. METHODS: The peritoneal macrophagess were isolated from BALB/c mice. After stained with CFDASE， the DH5α were cocultured with peritoneal macrophagess for 3 h. The effect of FS extract on cytophagocytesis in vitro was analyzed by flow cytometry. The peritoneal macrophages were stimulated and activated by LPS in vitro. The effect of FS extract on NO production of the peritoneal macrophages in vitro was measured by NO assay kit. RESULTS: FCM analysis showed that FS extract significantly promoted the phagocytosis of peritoneal macrophages at the final concentration of 40， 80， 160 mg/L， respectively (P
［Keywords］forsythia suspensa extract;peritoneal macrophages;phagocytosis; NO production
連翹(forsythia suspensa， FS)又名旱蓮子、 大翹子、 落翹等， 為木犀科植物連翹的果實(shí)。它作為傳統(tǒng)中藥廣泛應(yīng)用于對(duì)炎癥、
發(fā)熱和潰瘍等方面的治療［1］。同時(shí)， FS的主要活性成分連翹苷在抗氧化、 抗菌、 抗病毒和解熱抗炎等方面［2］也起著重要的作用。本研究我們通過檢測FS對(duì)小鼠腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞體外吞噬和NO釋放的影響， 進(jìn)一步研究其免疫學(xué)效應(yīng)。
1 材料和方法
1.1 材料 清潔級(jí)BALB/c近交系小鼠(雄性， 8～10周齡， 體質(zhì)量20～22 g)購自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。FS購自四川廣汗市維康植化有限公司。L谷氨酰胺、 β巰基乙醇、 刀豆蛋白A(concanavalin A， ConA)購自Sigma公司。羧基熒光素乙酰乙酸(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester， CFDASE)購自美國Molecular Probes 公司。RPMI1640、 胎牛血清(fetal bovine serum， FBS)為美國GibcoBRL公司產(chǎn)品。Griess Reagent試劑盒為美國Promega公司產(chǎn)品。流式細(xì)胞儀(FACSCalibur)為美國Becton Dickinson公司產(chǎn)品。
1.2 方法
1.2.1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備和細(xì)胞培養(yǎng) 斷頸處死小鼠， 用750 mL/L乙醇消毒， 腹腔注射RPMI1640完全培養(yǎng)液約5 mL。用棉球輕揉腹壁1～2 min后， 收集腹腔液， 1500 r/min離心10 min， 棄上清， 用RPMI1640完全培養(yǎng)液(含100 mL/L的FBS)調(diào)整細(xì)胞密度為2×109/L。根據(jù)需要接種于24孔(1mL/孔) 或96孔(0.2mL/孔)細(xì)胞培養(yǎng)板中， 37℃、 50mL/L CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h 。輕輕吸棄培養(yǎng)液后， 再用RPMI1640完全培養(yǎng)液洗去未貼壁細(xì)胞， 繼續(xù)培養(yǎng)［3］。
1.2.2 對(duì)大腸桿菌DH5α的染色標(biāo)記 采用CFDASE染色標(biāo)記大腸桿菌DH5α。CFDASE用二甲基亞砜(DMSO)溶解成10 mmol/L的儲(chǔ)存液， -20℃ 保存。臨用前， 取適量用PBS稀釋成1 mmol/L的工作液， 備用。新鮮大腸桿菌DH5α離心棄去LB培養(yǎng)基(4 000 g， 6 min)， 冷PBS洗滌1次， 調(diào)整細(xì)菌密度為1×1010/L， 加入CFDASE工作液(終濃度為8 μmol/L)， 充分混勻后在37℃搖床振蕩(220 r/min， 15 min)。RPMI1640培養(yǎng)基靜置10 min終止染色后離心， 經(jīng)RPMI1640洗滌2次(4000 g， 6 min)后， 重懸。流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測DH5α的CFDASE染色標(biāo)記率為90%。
1.2.3 巨噬細(xì)胞體外吞噬 將CFDASE標(biāo)記好的大腸桿菌DH5α(1×107/孔)與小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(細(xì)胞密度為2×109/L)一同接種到24孔板內(nèi)。實(shí)驗(yàn)分組及處理: 設(shè)2組空白對(duì)照(RPMI1640完全培養(yǎng)液組和PBS組)和不同終質(zhì)量濃度FS組: (RPMI1640+FS 40)、 (RPMI1640+FS 80)、 (RPMI1640+FS 160)、 (PBS+FS 40)、 (PBS+FS 80)、 (PBS+FS 160)接種于24孔培養(yǎng)板。每組各設(shè)6個(gè)重復(fù)孔。37℃、 50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中溫育3 h后， 用細(xì)胞刮輕輕刮下貼壁的巨噬細(xì)胞， 各組分別經(jīng)由70 μm濾器過濾， 立即以FCM檢測。
1.2.4 巨噬細(xì)胞體外NO釋放 實(shí)驗(yàn)分組及處理， 設(shè)陰性對(duì)照組(單獨(dú)RPMI1640完全培養(yǎng)液組)、 陽性對(duì)照組(單獨(dú)LPS組)、 不同終質(zhì)量濃度的單純FS組和(FS+LPS)組， 每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔， 接種于96孔培養(yǎng)板。給藥組細(xì)胞與藥物FS共孵育4 h后， 再加入LPS(終濃度為10 mg/L)刺激繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集相應(yīng)培養(yǎng)上清-20℃保存。采用Griess Reagent試劑盒(Promega)以檢測小鼠巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中的NO穩(wěn)定氧化代謝產(chǎn)物亞硝酸鹽(NO-2)水平， 間接反映NO的釋放量。50 mL小鼠巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清加入96孔平底酶標(biāo)板中， 按試劑盒操作說明加入試劑， 室溫避光孵育10 min， 檢測A540值。
1.2.5 FCM檢測及分析 所有樣品經(jīng)FACSCalibur流式細(xì)胞儀和CELLQuest軟件獲取。先在前散射(FSC)對(duì)側(cè)散射(SSC)二維散點(diǎn)圖中， 劃出巨噬細(xì)胞細(xì)胞區(qū)R1。CFDASE為熒光1(FL1)。M1表示腹腔巨噬細(xì)胞吞噬經(jīng)CFDASE標(biāo)記后DH5α百分率。全部數(shù)據(jù)經(jīng)FACSCalibur流式細(xì)胞儀和CellQuest軟件獲取， 每管樣品檢測10000個(gè)細(xì)胞， 獲得的數(shù)據(jù)用CellQuest軟件分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS10.0進(jìn)行處理， 數(shù)據(jù)以x±s表示， 多組間比較采用方差分析， 兩兩間比較用LSDt檢驗(yàn)。
2 結(jié)果
2.1 FS對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞體外吞噬的影響 表1結(jié)果顯示， 僅對(duì)照組RPMI1640完全培養(yǎng)液和PBS組之間比較， 發(fā)現(xiàn)RPMI1640 懸浮的巨噬細(xì)胞吞噬率比對(duì)照組PBS表現(xiàn)較高。對(duì)照組RPMI1640 完全培養(yǎng)液和(RPMI1640+FS)組比較， 各濃度FS組均可促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬率的增加， 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)照組PBS和(PBS+FS)組比較， 相同濃度FS組也可促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬率的增加， 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同濃度FS間比較有一定的濃度梯度依賴性。巨噬細(xì)胞體外吞噬的一次代表性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖1)。
表1 FS對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞體外吞噬影響（略）
Tab 1 Influence of FS on the phagocytosis of peritoneal macrophage in vitro
aP
圖1 腹腔巨噬細(xì)胞體外吞噬DH5α（略）
Fig 1 Phagocytosis of peritoneal macrophage on DH5α in vitro
2.2 FS對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞體外NO釋放的影響 表2結(jié)果顯示， 單純RPMI1640完全培養(yǎng)液組為陰性對(duì)照組。不同終質(zhì)量濃度的單純FS組均可抑制巨噬細(xì)胞體外NO釋放， 且隨著藥物濃度的升高其抑制NO釋放的程度越高， 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LPS組為陽性對(duì)照組， 它的NO釋放結(jié)果為(0.36±0.01) μmol/L。在(LPS+FS)組中， FS也可抑制LPS誘導(dǎo)刺激巨噬細(xì)胞體外NO釋放， 不同濃度間也隨著藥物濃度的升高其抑制NO釋放的程度越高， 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與單純FS組作用趨勢呈一致性。巨噬細(xì)胞體外吞噬的統(tǒng)計(jì)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。
圖2 FS對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞體外NO釋放影響（略）
Fig 2 Influence of FS on NO production of peritoneal macrophage in vitro
aP
表2 FS對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞體外NO釋放影響（略）
Tab 2 Influence of FS on NO production of peritoneal macrophage in vitro
aP
3 討論
腹腔中的巨噬細(xì)胞主要是通過引起和調(diào)節(jié)局部細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)來調(diào)節(jié)和維持腹腔環(huán)境的穩(wěn)定， 是一種十分重要的免疫輔助細(xì)胞。它在細(xì)胞膜上表達(dá)MHCI/II類分子和多種黏附分子以及IgG Fc受體(FcγR)、 C3b受體(CRI)和多種細(xì)胞因子受體。在與多種病原微生物識(shí)別與結(jié)合過程中， 可以高表達(dá)IA抗原和分泌較高水平L10， 通過受體與病原體等抗原異物結(jié)合經(jīng)吞噬或吞飲作用， 主動(dòng)吞噬、 殺傷和消化病原微生物等抗原性物質(zhì)。
本實(shí)驗(yàn)我們采用新的方法， 用CFDASE標(biāo)記DH5α在體外被小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬， 間接證實(shí)了FS可促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的體外吞噬。不同濃度的FS對(duì)其吞噬影響呈一定的梯度表現(xiàn)， 與對(duì)照相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們推測FS可能通過與腹腔巨噬細(xì)胞表面的受體間的特異性結(jié)合而促進(jìn)了巨噬細(xì)胞的吞噬功能; 或者也可能對(duì)作為抗原的大腸桿菌DH5α的受體Fc段存在一定的調(diào)理作用， 從而協(xié)同促進(jìn)了腹腔巨噬細(xì)胞識(shí)別、 結(jié)合并吞噬的過程。
腹腔巨噬細(xì)胞的NO釋放是由LPS協(xié)同INFγ、 TNFα等細(xì)胞因子作用刺激誘導(dǎo)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)所達(dá)成的［4］。我們已知NO作為體內(nèi)重要的生物活性物質(zhì)， 可以兼具細(xì)胞間、 細(xì)胞內(nèi)信使以及神經(jīng)遞質(zhì)作用的信號(hào)分子。它是由血管及機(jī)體許多其他組織類型的細(xì)胞合成， 以自分泌或旁分泌作用參與正常生理過程和某些疾病的發(fā)生發(fā)展， 如血管擴(kuò)張、 血管通透性、 血小板黏附和聚集、 神經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、 宿主防御反應(yīng)等等。此外， 在免疫學(xué)上NO也具有重要的意義。它作為機(jī)體非特異性免疫系統(tǒng)的組成部分之一， 起著免疫效應(yīng)分子和免疫調(diào)節(jié)劑的作用， 可以殺傷細(xì)菌、 病毒和腫瘤細(xì)胞。但是， NO過量可對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用， 損害宿主細(xì)胞活性和導(dǎo)致基因突變， 如NO過量可誘發(fā)腫瘤， 有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與血液NO的濃度可呈正相關(guān)［5］。此外， 臨床上NO過量還常表現(xiàn)在的休克和哮喘等［6］。
已知LPS誘導(dǎo)激活巨噬細(xì)胞一般是沿2條道路進(jìn)行啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑: 一是LPS與靶細(xì)胞膜相應(yīng)受體作用并啟動(dòng)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑; 二是LPS作用細(xì)胞后， 核內(nèi)基因表達(dá)的變化及其上游信號(hào)分子的確定［6］。研究表明LPS的刺激可激活或增強(qiáng)通路MAPK家族(ERK1/2， JNK1/2以及p38MAPK)的磷酸化， 同時(shí)還可促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌釋放PGE2使之與其細(xì)胞表面G蛋白偶聯(lián)的受體結(jié)合激活腺苷酸環(huán)化酶， 導(dǎo)致cAMP 釋放增加及PKA的活化［7］。本試驗(yàn)結(jié)果表明FS對(duì)LPS刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞體外NO釋放有抑制作用。低濃度FS(40 mg/L)即可抑制腹腔巨噬細(xì)胞NO的體外釋放， 且各濃度梯度FS與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此我們推測FS抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞體外釋放NO的原因在于FS可能參與和影響了LPS誘導(dǎo)的某些通路的表達(dá)。文獻(xiàn)表明FS可以抑制cAMP磷酸二酯酶的活性并在一定程度上能夠降低胞內(nèi)cAMP的含量［8］; 它還可以抑制p38MAPK的活化、 阻斷NFκB途徑作用以及抑制iNOS蛋白和mRNA的表達(dá)［9］， 這些均為FS抑制腹腔巨噬細(xì)胞體外釋放NO提供了理論依據(jù)。
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