核磁共振波譜法的基本原理精選(九篇)

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第1篇：核磁共振波譜法的基本原理范文

摘要：

本文對(duì)莢膜多糖進(jìn)行了概述，綜述近年來(lái)細(xì)菌莢膜多糖相關(guān)的研究進(jìn)展，并從理化性質(zhì)與生物學(xué)功能的角度出發(fā)，總結(jié)了近年來(lái)莢膜多糖提取、分離、純化等方面的研究，重點(diǎn)介紹了與莢膜多糖結(jié)構(gòu)相關(guān)的研究進(jìn)展。本文為進(jìn)一步研究細(xì)菌致病性、分型機(jī)制提供必要的方法，為疫苗的設(shè)計(jì)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對(duì)加強(qiáng)致病菌的防控具有重要意義。

關(guān)鍵詞：

莢膜多糖；提??；分離；純化；理化性質(zhì)

莢膜多糖是細(xì)菌細(xì)胞壁外層的膠狀物質(zhì)，具有抗原性和特異性，可用于細(xì)菌鑒定［1］，是細(xì)菌重要的毒力因子［2］。莢膜多糖是一種分子量大、極性大的物質(zhì)，對(duì)其進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)解析要比單糖和寡糖更加復(fù)雜。很多細(xì)菌的表面都具有莢膜，例如肺炎鏈球菌，B群鏈球菌，豬鏈球菌等［3］。有報(bào)道認(rèn)為莢膜的存在與細(xì)菌耐藥性呈正相關(guān)，一旦感染則發(fā)病率和死亡率都很高［4］。為進(jìn)一步了解細(xì)菌的致病機(jī)制，設(shè)計(jì)及研制更加有效的疫苗，研究細(xì)菌莢膜多糖的結(jié)構(gòu)日益引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視。本文主要針對(duì)莢膜多糖的分離純化和結(jié)構(gòu)解析的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1細(xì)菌莢膜多糖的概述

莢膜是某些細(xì)菌表面的特殊結(jié)構(gòu)，是一層位于細(xì)胞壁表面的松散的粘液物質(zhì)，莢膜的成分因菌種不同而異，主要是由糖與糖醛酸組成的聚合物，如豬鏈球菌的莢膜多糖。也有部分細(xì)菌的莢膜多糖含有多肽及脂質(zhì)，如炭疽桿菌［5］。細(xì)菌莢膜具有抗原性，可用于細(xì)菌的鑒定［1］。細(xì)菌鑒定的前提是對(duì)細(xì)菌進(jìn)行科學(xué)的分型，目前對(duì)于細(xì)菌分型主要有兩大分型系統(tǒng)，即血清型分型系統(tǒng)和基因分型系統(tǒng)。血清型分型系統(tǒng)主要依據(jù)莢膜多糖和脂多糖不同的抗原性對(duì)細(xì)菌進(jìn)行區(qū)分?；蚍中拖到y(tǒng)主要依據(jù)毒力因子，與免疫相關(guān)的因子等因素為主，將具有相同致病機(jī)制的細(xì)菌分為一類［6］。莢膜多糖作為細(xì)菌的毒力因子，其與細(xì)菌的血清型有密切關(guān)系。不同血清型的細(xì)菌會(huì)產(chǎn)生不同的毒力因子，對(duì)宿主造成不同的影響，而不同的毒力因子是通過(guò)不同的基因進(jìn)行編碼的，因此，毒力因子與血清型之間存在著密不可分的關(guān)系。由于莢膜位于細(xì)菌最外部，是細(xì)菌感染宿主時(shí)最先接觸的物質(zhì)，所以多為細(xì)菌主要的毒力因子［2］。莢膜多糖作為毒力因子，在細(xì)菌抵抗免疫系統(tǒng)中吞噬細(xì)胞吞噬過(guò)程中擔(dān)任著重要角色［7］。以豬鏈球菌為例，豬鏈球菌2型的莢膜多糖主要由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、N2－乙酰半乳糖胺和唾液酸這5種單糖組成，其糖蛋白是由231個(gè)氨基酸殘基組成，由位于基因組3846～4541bp之間的一段長(zhǎng)696bp基因序列編碼［8］。莢膜多糖的存在降低了豬鏈球菌被吞噬細(xì)胞吞噬的程度，而無(wú)莢膜的突變株容易被吞噬。莢膜的厚度越大越有利于抵抗豬多形核白細(xì)胞的吞噬［9］。實(shí)驗(yàn)表明，由于莢膜多糖的存在，使豬鏈球菌2型能夠抵抗巨噬細(xì)胞的吞噬，并且使被吞噬的細(xì)菌可以在巨噬細(xì)胞中存活至少3h［10］。Gottschalk和Segura在2000年提出“特洛伊木馬”模型，即豬鏈球菌黏附在免疫細(xì)胞上，特別是單核細(xì)胞，隨著單核細(xì)胞通過(guò)血腦屏障［11］，這就是莢膜多糖發(fā)揮抗吞噬能力的機(jī)制。莢膜多糖作為毒力因子，致病機(jī)理就在于抗吞噬能力，黏附能力和維持細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)部存活的能力。

2細(xì)菌莢膜多糖的理化特征

從化學(xué)組成上來(lái)說(shuō)，大部分的細(xì)菌莢膜多糖是以2種或以上的單糖（如D－葡萄糖，D－半乳糖，L－鼠李糖等）及其他物質(zhì)（如磷酸根，唾液酸等）為重復(fù)單元，聚合形成的大分子物質(zhì)。大多數(shù)細(xì)菌的莢膜多糖為酸性黏多糖，屬于雜多糖類。有文獻(xiàn)報(bào)道b型流感嗜血桿菌莢膜多糖的主要成分是多聚核糖基核糖醇磷酸鹽［12］。還有一部分細(xì)菌莢膜多糖是有乙?；亩嗵墙M成［13］。A群腦膜炎奈瑟菌莢膜多糖，其主要結(jié)構(gòu)是多聚磷酸乙酰氨基吡喃型甘露糖，乙?；Y(jié)構(gòu)是該菌最重要的免疫原性表位［14］。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上來(lái)說(shuō)，莢膜多糖通過(guò)各種作用力，如分子間氫鍵或者其他非共價(jià)鍵，與細(xì)胞壁之間形成了比較強(qiáng)韌的外膜，黏附在細(xì)菌的表面。莢膜多糖是由重復(fù)的單糖通過(guò)糖苷鍵連接形成聚合物，由于單糖種類不同，連接方式不同，多糖結(jié)構(gòu)中是否存在支鏈，有機(jī)或者無(wú)機(jī)分子等因素導(dǎo)致莢膜結(jié)構(gòu)解析存在巨大的復(fù)雜性［15］。正是因?yàn)槠浞肿咏M成復(fù)雜性和構(gòu)型多樣性，科研人員以此作為細(xì)菌血清學(xué)分型的基礎(chǔ)，即根據(jù)細(xì)菌莢膜多糖的抗原性的異同對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分型。肺炎雙球菌，根據(jù)其莢膜多糖的抗原性，迄今為止，可分為96種血清型，而其中有30多種血清型有致病性。大腸桿菌，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過(guò)90種血清型，其中有少數(shù)是具有侵襲感染能力的，而在可以引發(fā)新生兒腦膜炎的這類大腸桿菌具有相同的多糖鏈，只是多糖的不同修飾導(dǎo)致它們之間存在差異［16］。

3細(xì)菌莢膜多糖的功能

莢膜由于其具有耐干燥，黏附，儲(chǔ)存養(yǎng)分等功能，成為致病性細(xì)菌的一種重要的毒力因子。細(xì)菌莢膜中水分占到95％以上，含有大量水分的莢膜在細(xì)菌的表面，可以避免細(xì)菌脫水死亡，這就使得有莢膜的細(xì)菌更容易在宿主間相互傳播［17］。莢膜多糖還能夠促進(jìn)細(xì)菌與細(xì)菌或者細(xì)胞之間的黏附，從而促進(jìn)生物膜的形成和在不同的生存環(huán)境中的定植［18］。例如，能夠引起齲齒的唾液鏈球菌和變異鏈球菌會(huì)分泌己糖基轉(zhuǎn)移酶，使口腔中的蔗糖轉(zhuǎn)變成果聚糖，這種果聚糖能使細(xì)菌牢牢黏附于牙齒表面，而細(xì)菌發(fā)酵糖類產(chǎn)生的乳酸在局部積累后，會(huì)使牙齒表面的琺瑯質(zhì)層發(fā)生腐蝕而引起齲齒［19］。某些細(xì)菌的莢膜還是儲(chǔ)存養(yǎng)分的場(chǎng)所，以備細(xì)菌處于營(yíng)養(yǎng)缺乏時(shí)可以利用，如黃色桿菌的莢膜。而豬鏈球菌的莢膜除上述作用外，最重要的作用是抗吞噬作用，由于它的存在大大降低了豬鏈球菌被吞噬的程度，而莢膜厚度的增加也會(huì)使豬鏈球菌抗白細(xì)胞殺傷能力［20］。

4細(xì)菌莢膜多糖的分離純化

莢膜多糖的提取分離一般分以下幾個(gè)步驟：去菌體，粗提總糖，去除蛋白質(zhì)和核酸，分級(jí)分離［21－22］。

4．1去除菌體和總糖粗提取在提取多糖之前，首先需要去除菌體。目前，去除菌體提取總糖的方法主要有離心法，酶解法，巴氏滅菌法［23］等。離心法，將滅菌過(guò)的培養(yǎng)液通過(guò)離心機(jī)離心，然后收集上層清液的方法除去菌體。但是該方法去除菌體的效果差，離心的效果依賴于高效能的離心設(shè)備。對(duì)于含有唾液酸等不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的莢膜多糖，最常用的方法是酶解法，即細(xì)菌培養(yǎng)液離心得到菌體，然后將菌體分散在緩沖液中，再加入不同的酶，酶解菌體，最后再次離心使菌體碎片和莢膜多糖分離，取上層清液［24］。用溶菌酶來(lái)裂解菌體，從而可以避免破壞莢膜多糖。酶解法的成本較高，但是專一性強(qiáng)，去除菌體的效果較好。中國(guó)海洋大學(xué)的趙峽課題組通過(guò)將菌體分散在甘氨酸緩沖液中，然后加入溶菌酶裂解消化的方法去除豬鏈球菌菌體，從而得到莢膜多糖［25］。巴氏滅菌法，通過(guò)對(duì)菌液進(jìn)行加熱滅菌，隨著溫度的提高，多糖的溶解度逐步提高，有利于后續(xù)的離心。巴氏滅菌法便于操作，去除菌體效果較好，過(guò)程中要注意溫度，溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致多糖分解。在2013年Gottschalk課題組發(fā)表的文章中，通過(guò)此方法，在121℃加熱菌液75min來(lái)達(dá)到去除菌體的目的，從而得到14型豬鏈球菌的莢膜多糖［26］。

4．2去除蛋白質(zhì)和核酸由于一些細(xì)菌的莢膜多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜且穩(wěn)定性較差，所以在純化過(guò)程中要注意方法的選擇。有機(jī)溶劑多級(jí)沉淀法由于其操作簡(jiǎn)單并且對(duì)操作人員的良好性被廣泛使用［27］。有機(jī)試劑引起多糖、蛋白等物質(zhì)沉淀的原因是加入有機(jī)試劑使水溶液的介電常數(shù)降低，從而增加了具有相反電荷的基團(tuán)之間的吸引力，促使分子聚集而沉淀，此類現(xiàn)象類似鹽析。但是利用該法沉淀莢膜多糖的同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致核酸和蛋白的沉淀，為避免多糖中混合核酸和蛋白，可以在溶液中加入陽(yáng)離子，例如CaCl2，NaCl，利用陽(yáng)離子和帶負(fù)電的基團(tuán)結(jié)合，降低多聚核苷酸鏈之間的排斥作用，從而去除核酸和蛋白，或者通過(guò)加入酶，將蛋白質(zhì)去除，得到莢膜多糖的沉淀［28］。

4．3分級(jí)分離根據(jù)莢膜多糖的理化性質(zhì)對(duì)其進(jìn)行分級(jí)分離，莢膜多糖是一種極性很大，分子量之間存在較大差異的物質(zhì)。所以可以通過(guò)體積排阻色譜技術(shù)進(jìn)行分離純化，其中凝膠層析技術(shù)運(yùn)用最為成熟，且效果最佳［29］。莢膜多糖除了可以根據(jù)分子量差異進(jìn)行分離純化，在其組成中有磷酸基或者乙?；@些基團(tuán)可以使莢膜多糖具有不同的電荷性質(zhì)和pH值，根據(jù)此類理化性質(zhì)可以采用離子交換技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分離純化［30］。進(jìn)一步的純化還可以采用超濾法，這是一種用于分子分離的膜分離技術(shù)，操作簡(jiǎn)便，無(wú)需添加化學(xué)試劑［31］?？梢愿鶕?jù)待分離的物質(zhì)的性質(zhì)選擇不同規(guī)格的超濾膜。

4．3．1凝膠色譜法凝膠色譜法是一種簡(jiǎn)單而快速的分離技術(shù)，對(duì)高分子物質(zhì)有較好的分離能力。分離的基本原理是分子篩效應(yīng)。根據(jù)凝膠的種類和性質(zhì)不同，分為交聯(lián)葡聚糖凝膠（sephadex），瓊脂糖凝膠（sepharose）［32］，丙烯葡聚糖凝膠（sepharcryl）等。根據(jù)多糖的性質(zhì)和分子量范圍選擇適合的凝膠種類和型號(hào)。CristinaDeCastro課題組于2008年發(fā)表的文章中，采用sepharcrylS－500HR凝膠柱成功地從Rhizobiumrubi分離純化出一種新的莢膜多糖［33］。在2010年Gottschalk課題組通過(guò)乙醇沉淀法提取2型豬鏈球菌的莢膜多糖，然后通過(guò)使用sepharcrylS－400HR凝膠裝柱，對(duì)粗多糖進(jìn)行分離純化，然后運(yùn)用GC－MS技術(shù)得到2型豬鏈球菌莢膜多糖的單糖組成，結(jié)合質(zhì)譜，核磁共振，以及相關(guān)化學(xué)反應(yīng)，確定了2型豬鏈球菌莢膜多糖的結(jié)構(gòu)［28］。該課題組在2013年又得到了14型豬鏈球菌莢膜多糖的結(jié)構(gòu)［26］。

4．3．2離子交換色譜法離子交換色譜的基本原理是根據(jù)物質(zhì)的酸堿性，極性的不同極性分離。運(yùn)用離子交換色譜技術(shù)分離糖類，可以有效地去除酸堿成分和無(wú)機(jī)離子，從而得到糖和糖苷［30］。但是對(duì)于帶有唾液酸的多糖樣品，不宜使用強(qiáng)陰離子交換，唾液酸會(huì)發(fā)生嚴(yán)重脫離［34］。

5莢膜多糖的結(jié)構(gòu)解析

莢膜多糖由于極性大，分子量高，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，多以復(fù)合物存在等原因，增加了結(jié)構(gòu)解析的難度。分離純化度高會(huì)增大結(jié)構(gòu)解析的成功率和準(zhǔn)確性。結(jié)構(gòu)解析一般分為以下幾個(gè)步驟，單糖組成分析，分子量確定［35］，糖殘基連接位置和順序、構(gòu)型、分支點(diǎn)結(jié)構(gòu)分析［36］。單糖組成分析方面，主要技術(shù)有高效液相色譜［37］，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)［38］，離子色譜技術(shù)［39］等。由于糖類物質(zhì)沒有紫外吸收，可以通過(guò)柱前衍生化使其結(jié)合上有光學(xué)活性的基團(tuán)，1－苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮（PMP）是目前最常用的衍生化試劑，該反應(yīng)條件溫和，操作簡(jiǎn)便，衍生化效率高，適合復(fù)雜樣品的單糖組成［40］。中國(guó)海洋大學(xué)的趙峽課題組在2014年發(fā)表的文章中，使用PMP做柱前衍生化，成功得到豬鏈球菌4種血清型的單糖組成及其摩爾比例［25］。離子色譜技術(shù)在近些年逐漸被運(yùn)用在糖化學(xué)研究中，2013年FionaL．Lin課題組通過(guò)運(yùn)用離子色譜技術(shù)，準(zhǔn)確的分析出肺炎鏈球菌33C和33D血清型的單糖組成［41］。糖殘基連接位置和順序方面，當(dāng)前常見的分析手段有氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。通過(guò)對(duì)多糖依次進(jìn)行甲基化反應(yīng)，水解反應(yīng)，還原反應(yīng)和乙?；磻?yīng)，然后運(yùn)用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)糖殘基連接位置和順序進(jìn)行確定。核磁共振技術(shù)為糖類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)解析起推動(dòng)作用，通過(guò)核磁共振圖譜分析可以推測(cè)出糖類物質(zhì)中碳鏈的連接位置，構(gòu)型等信息［42］，還可以進(jìn)行樣品檢定［43］。BentO．Petersen課題組在2013年通過(guò)核磁共振技術(shù)成功解析了肺炎鏈球菌47A血清型的結(jié)構(gòu)［44］。在2010年Gottschalk課題組運(yùn)用GC－MS技術(shù)得到2型豬鏈球菌莢膜多糖的單糖組成，結(jié)合質(zhì)譜，核磁共振，以及相關(guān)化學(xué)反應(yīng)，確定了2型豬鏈球菌莢膜多糖的結(jié)構(gòu)［28］。該課題組在2013年又得到了14型豬鏈球菌莢膜多糖的結(jié)構(gòu)［26］。莢膜多糖的結(jié)構(gòu)解析需要諸多分析技術(shù)的結(jié)合，譜圖解析工作難度仍然很大。

6多糖合成的相關(guān)基因和途徑

莢膜多糖合成的相關(guān)基因主要包含3種，即莢膜多糖合成調(diào)節(jié)基因，糖基轉(zhuǎn)移酶基因和轉(zhuǎn)運(yùn)基因。以肺炎鏈球菌為例，其90個(gè)血清型的莢膜多糖合成的相關(guān)基因簇已經(jīng)被測(cè)序并分析。除去3型和37型以外，其余的血清型的莢膜多糖合成的相關(guān)基因簇均位于染色體上dexB和aliA之間的一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄單位，具有位于上游位置高度保守的4個(gè)合成調(diào)節(jié)基因（cpsABCD），基因簇內(nèi)包含多種糖基轉(zhuǎn)移酶，多糖合成酶，乙?；D(zhuǎn)移酶和翻轉(zhuǎn)酶等［15］。糖基轉(zhuǎn)移酶（GT）作為多糖生物合成的主要酶之一。多糖結(jié)構(gòu)的多樣性取決于催化反應(yīng)中的GT。GT催化轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，即催化一個(gè)糖基供體上的糖殘基轉(zhuǎn)移到另一個(gè)受體上。糖基供體為糖核苷酸，而糖基受體可以是單糖、寡糖、多糖、多肽、蛋白質(zhì)等物質(zhì)［45］。根據(jù)糖基供體和生成的糖苷鍵的立體構(gòu)型，GT分為保留型和反轉(zhuǎn)型［46］。由于GT的不同作用的結(jié)果，使多糖結(jié)構(gòu)從組成到構(gòu)型都存在巨大的多樣性。從基因研究角度，表明細(xì)菌多糖的生物合成途徑分為3種，wzy－依賴途徑，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體－依賴途徑和合酶－依賴途徑［47］。以生物合成分為3個(gè)步驟，起始－延伸－連接終止。以上3種合成途徑主要根據(jù)延伸步驟進(jìn)行劃分?；蛘{(diào)控酶進(jìn)行多糖的生物合成。從多糖的多樣性，到多糖的合成調(diào)控，現(xiàn)階段仍暗含著尚不明確的步驟，有待進(jìn)一步的研究。

7展望

莢膜多糖作為細(xì)菌的主要毒力因子，在研制疫苗方面有重要作用。肺炎鏈球菌23型多糖疫苗于1983年在美國(guó)批準(zhǔn)并開始使用，在使用的過(guò)程中問(wèn)題也隨之發(fā)生，該疫苗對(duì)成年人的效果較好，但是對(duì)嬰幼兒效果不好［48］。這使人們對(duì)莢膜多糖制備的疫苗有了新的思考。細(xì)菌莢膜多糖作為主要的毒力因子，研究人員對(duì)其結(jié)構(gòu)組成，功能及基因已越來(lái)越重視［49］。高效地分離純化莢膜多糖對(duì)其結(jié)構(gòu)解析至關(guān)重要，不斷改進(jìn)原有分離技術(shù)和開發(fā)新型分離技術(shù)要齊頭并進(jìn)，從而得到純化度更高的多糖樣品，增加結(jié)構(gòu)解析的準(zhǔn)確性。隨著對(duì)莢膜多糖研究的深入，進(jìn)一步解析莢膜多糖結(jié)構(gòu)以及合成基因與調(diào)節(jié)機(jī)制等方面［50］，會(huì)對(duì)莢膜多糖在疫苗研制和疾病治療中的作用有更加清晰的認(rèn)識(shí)。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)生物工程手段對(duì)細(xì)菌進(jìn)行改造，使細(xì)菌的莢膜多糖向著有利于人類生存和應(yīng)用的方向發(fā)展。

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