重復(fù)的遺傳學(xué)效應(yīng)精選(九篇)
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第1篇：重復(fù)的遺傳學(xué)效應(yīng)范文
在高校遺傳學(xué)教學(xué)中存在許多經(jīng)典案例，如：果蠅的翅型、體色、眼色等性狀的遺傳；豌豆的性狀遺傳以及玉米籽粒的形狀和顏色性狀的遺傳等。其中，還有一個(gè)非常重要的經(jīng)典案例，即血型遺傳。自20世紀(jì)初至今,ABO血型遺傳一直是復(fù)等位基因的一個(gè)不可缺少的經(jīng)典案例。隨著科學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展，血型的經(jīng)典內(nèi)涵得到不斷提升，新的研究結(jié)果使血型遺傳所涵蓋的遺傳學(xué)知識點(diǎn)越來越多，內(nèi)容越來越豐富。因此，以我們身邊最常見的表型--血型為案例開展遺傳學(xué)教學(xué)不僅可以將復(fù)雜的知識點(diǎn)簡單化、形象化，便于理解，還可以將繁多的基礎(chǔ)知識串聯(lián)起來，便于記憶。另外，以血型遺傳作為經(jīng)典案例在遺傳學(xué)的教學(xué)中還可以不斷加人新的研究和新的應(yīng)用，使經(jīng)典的內(nèi)涵不斷得到新的提升，讓學(xué)生的視野接觸到前沿的科學(xué)知識，為日后的科研接力打好基礎(chǔ)。
1血型與遺傳學(xué)之間的重要關(guān)系
開展案例教學(xué)，案例的選擇是關(guān)鍵。血型是人類血液由遺傳控制的個(gè)體性狀之一，與人類的生活關(guān)系密切，用途廣泛。自1900年到2005年，已檢測出約29個(gè)血型系統(tǒng)[21。臨床上最常用的有“ABO血型系統(tǒng)”、“Rh血型系統(tǒng)”、“MN血型系統(tǒng)”和“HLA血型系統(tǒng)”。這些血型系統(tǒng)涵蓋了復(fù)等位基因、基因互作之上位效應(yīng)等遺傳學(xué)的孟德爾定律拓展原理，基因的表達(dá)調(diào)控及群體遺傳等遺傳學(xué)的精髓內(nèi)容。透過這個(gè)知識窗口，可以看到遺傳學(xué)在血型中的奧秘。
孟德爾遺傳定律從建立、發(fā)展到不斷拓展完善，一直都是貫穿高校遺傳學(xué)教學(xué)的核心知識點(diǎn)。由于現(xiàn)在大學(xué)生從高中開始就接觸孟德爾定律，如果大學(xué)教學(xué)還是重復(fù)高中階段所涉及的內(nèi)容，學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣難以提高。在高中知識的基礎(chǔ)上，開展案例教學(xué)，引入現(xiàn)代遺傳學(xué)在人類血型上的最新認(rèn)識，則不但可以給學(xué)生一種似曾相識的感覺，還能自然地激起他們深入探索的興趣。血型的遺傳特征及生化基礎(chǔ)可以清晰明了地向?qū)W生闡述清楚孟德爾定律的一些重要的延伸知識內(nèi)容。從紅細(xì)胞血型到白細(xì)胞血型，從常見的ABO血型到罕見的孟買、Rh血型，對于假基因、等位基因、復(fù)等位基因和擬等位基因等不容易理解的基因概念以及基因之間的相互作用都可以通過血型案例，把學(xué)生帶入情境之中，在教師的指引下由學(xué)生自己依靠其擁有的基礎(chǔ)知識結(jié)構(gòu)和背景，在血型案例情境中發(fā)現(xiàn)、分析和解決問題，比較輕松地掌握這些容易混淆不清的概念和一些難以理解的遺傳學(xué)現(xiàn)象，如非等位基因之間的相互作用之上位效應(yīng)等。
此外，人的血紅蛋白基因在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)調(diào)控還涉及遺傳學(xué)中的表型和基因型之間的關(guān)系，真核生物中的基因表達(dá)調(diào)控模式等知識點(diǎn)。對血型相關(guān)的一些遺傳疾病進(jìn)行分析，還可以引申出基因突變和染色體缺失突變及一些重要的遺傳標(biāo)記。血型的遺傳學(xué)檢測方法及臨床上的輸血原則和溶血、血型互配等現(xiàn)象也與受基因表達(dá)調(diào)控的紅細(xì)胞的細(xì)胞膜糖基的特征和生化機(jī)制密切 相關(guān)，引導(dǎo)遺傳學(xué)從理論到實(shí)驗(yàn)，再到實(shí)踐中的應(yīng)用。血型與疾病的關(guān)聯(lián)分析，把科研思維引入高校遺傳學(xué)教學(xué)中，讓學(xué)生緊跟時(shí)展的步伐，理論聯(lián)系實(shí)際，為日后的科研工作打好基礎(chǔ)。
遺傳學(xué)中兩大重要的主題是遺傳和變異，主要包括孟德爾遺傳和連鎖遺傳、基因突變和染色體畸變。通過以復(fù)旦大學(xué)遺傳學(xué)教學(xué)大綱為參考，與劉祖洞主編的《遺傳學(xué)》和喬守怡主編的《現(xiàn)代遺傳學(xué)》教材內(nèi)容相比較發(fā)現(xiàn)，血型遺傳案例除了與上述遺傳學(xué)四大內(nèi)容關(guān)聯(lián)外，還涉及到基因的表達(dá)調(diào)控、群體遺傳、表觀遺傳等知識點(diǎn)，其中大部分知識點(diǎn)都是要求學(xué)生重點(diǎn)掌握的內(nèi)容。目前，血型案例所涵蓋的主要遺傳學(xué)知識內(nèi)容及在遺傳學(xué)學(xué)科中的重要意義的歸納見表1。因此，把血型作為經(jīng)典案例，開展遺傳學(xué)的案例教學(xué)既貼近生活，引發(fā)學(xué)生深刻的思考，又能代表性地進(jìn)一步闡述探討遺傳學(xué)的生物知識。
2血型案例在遺傳學(xué)教學(xué)中的開展
在以血型為案例的教學(xué)過程中，我們首先根據(jù)高校遺傳學(xué)的教學(xué)目標(biāo)和培養(yǎng)目標(biāo)的要求，在學(xué)生掌握了一些遺傳學(xué)的基礎(chǔ)知識和理論知識的基礎(chǔ)上，結(jié)合遺傳學(xué)的教學(xué)進(jìn)度逐步有序地進(jìn)行介紹：1.血型基本知識介紹；2.紅細(xì)胞血型的細(xì)胞膜糖基特征和生化機(jī)制；3.紅細(xì)胞血型與輸血；4.血型的遺傳學(xué)規(guī)律特征，包括(I)ABO血型復(fù)等位基因遺傳及其應(yīng)用，（II)ABO血型基因的克隆，（III)ABO血型的遺傳學(xué)鑒定；5.ABO血型的拓展，包括(I)孟買血型與擬孟買血型，（II)紅細(xì)胞血型與白細(xì)胞血型。下面主表1血型與高校遺傳學(xué)教學(xué)的重要關(guān)系
要選取兩個(gè)方面闡述在遺傳學(xué)教學(xué)中的開展過程。
2.1血型基本知識在教學(xué)中的開展
ABO血型系統(tǒng)是第一個(gè)被描述的紅細(xì)胞血型系統(tǒng)，也是最具有臨床意義的一個(gè)系統(tǒng)。因此，在進(jìn)行血型基本知識介紹時(shí)往往以ABO血型為例。隨著以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的血型研究的發(fā)展，ABO血型的基因遺傳背景目前已比較清楚。在介紹血型基因的基本知識同時(shí)也涵蓋著遺傳學(xué)知識的傳播，而且隨著血型基因知識的不斷豐富完善，涵蓋的遺傳學(xué)知識也越來越廣泛。
ABO血型由3個(gè)復(fù)等位基因控制，即iA、產(chǎn)和i°o在開展遺傳學(xué)相關(guān)教學(xué)活動時(shí)，一般都用此作為分析生物界中復(fù)等位現(xiàn)象的經(jīng)典例證。這些基礎(chǔ)知識對于高校學(xué)生來說可能在高中的時(shí)候就已經(jīng)獲得。因此，在大學(xué)開展相關(guān)教學(xué)時(shí)，除了簡單介紹這3個(gè)主要的復(fù)等位基因外，還可以深入講述新的研究結(jié)果，到目前為止通過分子生物學(xué)方法已經(jīng)確定了160多個(gè)^50等位基因，只是目前國際上以4川7基因作為等位基因的參比序列，其他基因均與其緊密相關(guān)，非常保守。在此基礎(chǔ)上ABO血型又可分為許多亞群，其中A血型表現(xiàn)出最多的亞型。在紅細(xì)胞血型系統(tǒng)中還有一種Rh血型，分為Rh陽性和Rh陰性。Rh血型主要由3個(gè)緊密連鎖的基因D/d、C/c、E/e決定，這3個(gè)基因以單倍型方式傳遞，屬于擬等位基因。這樣在講解原有知識基礎(chǔ)上，又不局限于原有知識范圍，由ABO血型到Rh血型，由復(fù)等位基因引出擬等位基因，在教學(xué)方法上可以通過相互比較，舉例分析，擴(kuò)大學(xué)生的知識面，提
高他們的學(xué)習(xí)興趣。
人類的血型是不是一生恒定不變的？面對這個(gè)問題，很多學(xué)生都會認(rèn)為血型是由遺傳決定，不會改變。其實(shí)人類的血型也會發(fā)生變異，如急性白血病以及再生障礙性貧血可以使血型抗原減弱，骨髓增生異常綜合征可以導(dǎo)致血型抗原丟失等。而且，健康人也存在血型變異的現(xiàn)象，但是這個(gè)是與細(xì)胞表面血型物質(zhì)受到掩蓋以及人體存在一些稀有ABO等位基因有關(guān)。這些新的知識可以向?qū)W生很好地展示“遺傳和變異”，利用身邊的血型案例調(diào)動學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性，使他們積極主動地掌握遺傳學(xué)的精髓。
此外，最近幾年疾病引發(fā)基因甲基化和突變的研究'又可以結(jié)合表觀遺傳學(xué)的內(nèi)容開展教學(xué)。
2.2紅細(xì)胞血型的細(xì)胞膜糖基特征和生化機(jī)制在教學(xué)中的開展
人類ABO基因位于9號染色體長臂(9q34)，其基因產(chǎn)物是一些專一性的糖基轉(zhuǎn)移酶，可以催化血型抗原前體特定部位的糖基轉(zhuǎn)移，從而控制ABO血型抗原的生物合成。其中4基因編碼產(chǎn)物為N-乙酰-D-半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶(簡稱A酶)，可以產(chǎn)生常見的A抗原；S基因編碼產(chǎn)物ci-l，3-D-半乳糖轉(zhuǎn)移酶(簡稱B酶)，可以產(chǎn)生常見的B表面抗原；和S基因同時(shí)存在產(chǎn)生的等位基因，其編碼產(chǎn)物具有A酶和B酶的特異性，在紅細(xì)胞表面上產(chǎn)生不同強(qiáng)度的A和B抗原；而O基因則是第258位和第349位堿基缺失導(dǎo)致的密碼子移位，使終止密碼提前出現(xiàn)，合成了無酶活性的短肽，因而體內(nèi)沒有A酶和B酶，也不能催化糖基轉(zhuǎn)移，只有前體物質(zhì)H的產(chǎn)生為H抗原(圖1)。因此ABO血型有時(shí)也稱為八811型[71。這樣，不同的、B、0基因編碼不同的多肽，產(chǎn)生具有不同功能的糖基轉(zhuǎn)移酶，非常簡單地引出了遺傳學(xué)中經(jīng)典的基因與酶的關(guān)系的“一個(gè)基因一條多肽(一個(gè)基因一個(gè)酶)假說”,使學(xué)生很容易獲得一個(gè)基因決定一條相應(yīng)的多肽鏈(酶)的結(jié)構(gòu)，并相應(yīng)地
影響這個(gè)多肽(以及由單條或多條多肽鏈組成的酶）的功能這種遺傳學(xué)思想，達(dá)到良好的教學(xué)效果。
此外，最新研究發(fā)現(xiàn)ABH抗原除表達(dá)在血細(xì)胞表面以外，還可以出現(xiàn)在除腦脊液外的分泌液中；有大約80%的個(gè)體具有產(chǎn)生這些可溶性抗原的遺傳基因；這種分泌抗原的表達(dá)由雙結(jié)構(gòu)基因控制，即第19號染色體2個(gè)緊密連鎖的Ft/n(用和基因座。ABO血型抗原都由前體H物質(zhì)合成，SeAe基因和丑冷基因都可以控制合成H物質(zhì)；簡單來說，基因的表達(dá)決定體液中是否出現(xiàn)ABH抗原，H/h基因的表達(dá)決定紅細(xì)胞上是否出現(xiàn)ABH抗原。但是，并不是所有帶m基因的個(gè)體唾液中都分泌ABH物質(zhì)，還要受到Wh基因的制約，其中hh型(即孟買型)均為非分泌型[7]。這樣又引出了遺傳學(xué)中一個(gè)很重要的概念--上位基因，很重要的遺傳學(xué)現(xiàn)象--上位效應(yīng)。這些屬于遺傳學(xué)中基因互作的重點(diǎn)內(nèi)容，而且發(fā)生基因相互作用的非等位基因仍然遵循孟德爾分離和自由組合定律，后代的基因型及其比例是可預(yù)計(jì)的，所以在遺傳學(xué)教學(xué)中還可用于親子鑒定、重大遺傳疾病的關(guān)聯(lián)分析、人種演化、群體遺傳分析等相關(guān)內(nèi)容。
2.2相關(guān)技術(shù)的拓展應(yīng)用
ABO血型的分子檢測是分子遺傳學(xué)教學(xué)中PCR技術(shù)拓展應(yīng)用的案例。血型基因的表達(dá)影響血型的表現(xiàn)型，表型相同的個(gè)體其基因型不一定相同。如何區(qū)分iAiA、Pi0在表現(xiàn)型都是A型和iBiB、iBi0在表現(xiàn)型都是B型的個(gè)體，可以根據(jù)A、B、0血型基因堿基的差異，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)分型人類ABO血型的方法。這種方法可以對個(gè)體血型(血型基因型)進(jìn)行判定：是屬于AA型、AO型，還是BB型或BO型。在這個(gè)基礎(chǔ)上，我們進(jìn)行了改進(jìn)，并結(jié)合教學(xué)進(jìn)程，作為自選實(shí)驗(yàn)在學(xué)生中開設(shè)，獲得了學(xué)生的好評。在135個(gè)學(xué)生中開展自選實(shí)驗(yàn)，其中有80%的學(xué)生選擇ABO血型鑒定這個(gè)實(shí)驗(yàn)，并表示對這個(gè)實(shí)驗(yàn)很感興趣。
此外，還可通過分析核苷酸來確定分泌型ABH血型的Se基因型。主要基因分型技術(shù)有：（l)PCR-序列特異性引物(PCR-SSP)，這是一種新的基因多態(tài)性分析技術(shù)，根據(jù)基因座某一堿基的差異設(shè)計(jì)一系列引物，特異性引物僅擴(kuò)增與其對應(yīng)的等位基因， 而不擴(kuò)增其他的等位基因；（2)PCR-DNA測序法，先通過PCR擴(kuò)增基因的主要片段，然后測定序列;(3)PCR-限制性內(nèi)切酶法，用對位點(diǎn)特異的限制性內(nèi)切酶消化基因，再通過Southernblot分析來確定。目前，PCR-SSP常用于胎兒血型鑒定及白血病引起的血型抗原異常等血型鑒定。隨著450基因結(jié)構(gòu)和研究方法的迅速發(fā)展，AB0血型定型也將進(jìn)入基因定型的時(shí)代，揭示更多的關(guān)于AB0基因和AB0血型表觀遺傳學(xué)等方面的奧秘。
在教學(xué)過程中還可以設(shè)計(jì)一系列與血型相關(guān)的論題，引導(dǎo)學(xué)生査閱相關(guān)方面的最新進(jìn)展，總結(jié)出血型與人類疾病和性格之間的關(guān)系以及蘊(yùn)涵的遺傳學(xué)原理。學(xué)生可以分組制作PPT討論，還可針對某一論題，學(xué)生組隊(duì)分為正反兩方，開展辯論式討論。一學(xué)期可以安排一次課時(shí)(45分鐘)開展辯論式討論,前30分鐘讓學(xué)生正反方陳述觀點(diǎn)，列舉證據(jù)開展辯論，后15分鐘用于總結(jié)和點(diǎn)評。在這個(gè)模式下，幾乎所有的學(xué)生都積極主動地參與進(jìn)來，將引導(dǎo)、鼓勵(lì)與考評相結(jié)合，充分調(diào)動了學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性[11]。開展“血型是否可以決定性格”類似專題的辯論式討論，既增加了遺傳學(xué)教學(xué)的興趣性及可接受性，還可以使學(xué)生的思維在辨析中得到操練。正反兩方隊(duì)員通過收集資料和案例，與同學(xué)辯論解釋的過程中，不僅掌握了深奧的科學(xué)知識，而且還與現(xiàn)實(shí)生活相聯(lián)系，并且將遺傳學(xué)應(yīng)用于實(shí)際，填補(bǔ)了傳統(tǒng)教學(xué)在知識靈活認(rèn)知與實(shí)踐中的不足。
3以血型為案例開展遺傳學(xué)教學(xué)的優(yōu)點(diǎn)
作為日常生活中被人們廣泛熟知的遺傳學(xué)常識，血型遺傳學(xué)的研究歷程符合遺傳學(xué)的發(fā)展規(guī)律與教學(xué)規(guī)劃，其作為遺傳學(xué)教學(xué)案例有著不可替代的優(yōu)勢：
第2篇：重復(fù)的遺傳學(xué)效應(yīng)范文
關(guān)鍵詞：光遺傳學(xué)；上轉(zhuǎn)換納米粒子；近紅外光轉(zhuǎn)換器；光調(diào)控；離子通道；生理活動
0引言
精準(zhǔn)調(diào)控生物分子以及生理過程，對于理解疾病的發(fā)生發(fā)展和實(shí)施有效的治療具有重大意義[1-2]。而離子通道作為細(xì)胞膜的主要成分，對于神經(jīng)、肌肉等其它系統(tǒng)的電生理信號的傳導(dǎo)和整合起到關(guān)鍵作用，它的活化或功能障礙會影響正常生理及病理進(jìn)程，比如大腦思維，肌肉收縮和離子通道病[3-5]。目前，常用于離子通道調(diào)控的策略有以下幾種：(1)化學(xué)分子作用，如離子通道激活劑或阻斷劑；(2)基因工程干預(yù)，如特異性地表達(dá)、敲除或沉默目的基因來影響通道蛋白的活性；(3)物理電刺激，作用于特定的電壓門控離子通道[6-9]。盡管這些方法都取得了一定的進(jìn)展，但在實(shí)際應(yīng)用中依然存在著許多挑戰(zhàn)。例如，化學(xué)藥物隨血液循環(huán)的非識別性積累及作用難以避免，這極大地限制了調(diào)控的空間分辨率[10]。再者，化學(xué)或遺傳擾動的不可逆性也阻礙了實(shí)際調(diào)控的時(shí)間準(zhǔn)確性[7]。此外，盡管電學(xué)模式的物理刺激，尤其是對于深部大腦刺激而言，顯示出很好的時(shí)空準(zhǔn)確性和應(yīng)用價(jià)值。但是，實(shí)際操作中需要高侵入性地在深層腦組織植入電極或芯片，會造成潛在的臨床不良反應(yīng)[11-12]。
因此，迫切需要開發(fā)精度高、損傷小的調(diào)控膜離子通道的有效技術(shù)。近年來，使用光來控制生物分子和生理過程已引起了廣泛關(guān)注[13-15]。其中一種新興的被稱作光遺傳學(xué)的生物技術(shù)被應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域，并且能高選擇性地，甚至在毫秒級的時(shí)間分辨率下實(shí)現(xiàn)神經(jīng)功能的操控[16-18]。更重要的是，通過基因工程對光敏視紫紅質(zhì)離子通道蛋白進(jìn)行改造，使其在離子特異性以及光譜響應(yīng)性2個(gè)方面進(jìn)一步多樣化。這為推動光遺傳學(xué)在更復(fù)雜的生物體系應(yīng)用的提供了機(jī)會，不僅在體外單細(xì)胞水平，還在自由活動動物上對腦回路介導(dǎo)的行為學(xué)進(jìn)行調(diào)控[19-22]。然而，盡管這些技術(shù)取得了令人矚目的成就，但目前報(bào)道的光敏感視紫紅質(zhì)蛋白，或其它用于膜通道調(diào)節(jié)的光遺傳學(xué)工具主要是在可見光區(qū)工作。由于可見光組織穿透性不足，生物體吸收和散射嚴(yán)重，這些因素極大地限制了光遺傳學(xué)在體內(nèi)應(yīng)用[18，23-25]。雖然有研究報(bào)道通過光學(xué)纖維或微型發(fā)光二極管植入可以做到深層腦組織刺激，但這種高度侵入性的手段會引起一定的安全隱患[26-27]。由此，開發(fā)新的光遺傳學(xué)技術(shù)，使其能夠在活體條件下無(微)創(chuàng)地、有效地調(diào)控深層部位膜通道具有重要意義。
值得注意的是，科學(xué)家們目前為實(shí)現(xiàn)體內(nèi)有效的光遺傳學(xué)刺激做出了多方面努力，其中將光敏離子通道蛋白激發(fā)波長移至近紅外窗口(＞700nm)被認(rèn)為有利于更深的組織穿透能力[24，28-29]。比如通過基因工程化的策略，目前不同突變視紫紅質(zhì)離子通道蛋白的響應(yīng)光譜已經(jīng)從藍(lán)光紅移到黃光，甚至紅光區(qū)域，但這些光遺傳學(xué)體系仍局限在可見光波長范圍內(nèi)(表1)[30-31]。此外，通過使用近紅外光響應(yīng)納米材料作為光轉(zhuǎn)換器，進(jìn)一步原位刺激光遺傳學(xué)工具，可以增強(qiáng)光穿透能力進(jìn)而調(diào)控離子通道的活性[32-34]。其中，鑭系元素?fù)诫s的上轉(zhuǎn)換納米粒子作為獨(dú)特的光學(xué)材料被選為潛在的光納米轉(zhuǎn)換器。該材料具有將近紅外光(如980或808nm)轉(zhuǎn)換為紫外、可見或近紅外區(qū)域的多種發(fā)射的性能(表2)，鑒于其較少的散射和更深的組織滲透深度，已被廣泛地應(yīng)用于生物成像和納米醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域[35-39]?；诖?，近年來人們將鑭系元素?fù)诫s的上轉(zhuǎn)換納米粒子與各種光敏離子通道蛋白結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了近紅外上轉(zhuǎn)換的光遺傳學(xué)調(diào)控，并取得了顯著的研究成果[32，40-41]。
因此，我們聚焦于生物醫(yī)學(xué)研究中將近紅外上轉(zhuǎn)換納米轉(zhuǎn)換器用于光遺傳學(xué)調(diào)控的最新成果。首先，我們對特定功能的上轉(zhuǎn)換納米平臺與光敏離子通道蛋白結(jié)合的策略進(jìn)行了總結(jié)；其次，詳細(xì)地介紹了上轉(zhuǎn)換光遺傳學(xué)的廣泛應(yīng)用以及可改進(jìn)的技術(shù)；最后，關(guān)于進(jìn)一步推進(jìn)該技術(shù)向臨床轉(zhuǎn)化并克服當(dāng)前挑戰(zhàn)提出了建議和展望。
1開發(fā)上轉(zhuǎn)換納米粒子介導(dǎo)的近紅外光遺傳學(xué)平臺
通過匹配不同光敏視蛋白的激活波長，選擇適當(dāng)?shù)纳限D(zhuǎn)換納米粒子作為近紅外光轉(zhuǎn)換器，這種組合策略可以靈活地實(shí)現(xiàn)特定離子通道的激活。2011年，Deisseroth等[53]在一項(xiàng)專利申請中首先提出了這個(gè)理念，并列舉了各種上轉(zhuǎn)換納米粒子與細(xì)胞膜上光響應(yīng)視蛋白表達(dá)的神經(jīng)元組合并進(jìn)行光調(diào)控的方法。在2013年，Han等在一項(xiàng)基金申請里介紹了用于體內(nèi)神經(jīng)元無光纖操控的上轉(zhuǎn)換光遺傳學(xué)設(shè)計(jì)。此后在2015年，不同研究團(tuán)隊(duì)分別報(bào)道了在體外體內(nèi)成功地實(shí)現(xiàn)了上轉(zhuǎn)換光遺傳學(xué)調(diào)控的研究[54-55]。
例如，Yawo等[40]使用藍(lán)色發(fā)光(發(fā)射峰在450和480nm)的上轉(zhuǎn)換納米材料NaYF4∶Yb/Sc/Tm@NaYF4，在近紅外976nm激光照射下，可以有效地激活PsChR離子通道，并產(chǎn)生明顯的動作電位；另外，利用發(fā)出綠光(550nm)的NaYF4∶Sc/Yb/Er作為近紅外光轉(zhuǎn)換器，進(jìn)而可用于激活表達(dá)細(xì)胞中的C1V1或mVChR1離子通道蛋白(圖1)。進(jìn)一步地研究還證明，結(jié)合上轉(zhuǎn)換納米粒子的光遺傳學(xué)調(diào)控效果顯示了刺激的時(shí)間和功率依賴性。但是，該研究仍有待改進(jìn)空間，比如上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率，納米材料的生物安全性等方面。
(1)將上轉(zhuǎn)換納米粒子嵌入細(xì)胞可生長的膜載體。如圖2a所示，Lee等[54]制備了上轉(zhuǎn)換納米材料(NaYF4∶Yb/Tm@NaYF4)混合嵌入聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)聚合物的薄膜。這種0.5mm厚的薄膜不僅可用于神經(jīng)元接觸培養(yǎng)，還可以用作光遺傳學(xué)調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)平臺，將近紅外激光轉(zhuǎn)換為藍(lán)光，隨后激活表達(dá)有藍(lán)色光敏通道視紫紅質(zhì)的蛋白(ChR2)的神經(jīng)元。更關(guān)鍵地是，該體系通過1、5和10Hz的980nm脈沖激光刺激，實(shí)現(xiàn)了毫秒級分辨率的神經(jīng)元活化響應(yīng)。此外，Yawo等[40]比較分析了不同接觸式細(xì)胞光遺傳學(xué)調(diào)控平臺的效率。根據(jù)圖2b所示，方法一將上轉(zhuǎn)換納米粒子與神經(jīng)元直接接觸，而方法二在二者之間采用玻片間隔。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種方法均以激光功率依賴性的方式顯示出光刺激下向內(nèi)性的膜電流響應(yīng)。但是，在相同的近紅外激發(fā)功率下，方法一的效率明顯高于方法二，說明需要將上轉(zhuǎn)換納米材料盡可能靠近地放置于光敏通道蛋白的位置，因?yàn)楣庾拥墓β拭芏扰c距離的平方成反比。
(2)將上轉(zhuǎn)換納米粒子制成微光極。Shi等[57]首先將UCNPs包裝到玻璃微光極中，制成可植入的光轉(zhuǎn)換器將近紅外能量轉(zhuǎn)換為可見光，然后刺激具有不同ChRs表達(dá)的神經(jīng)元(圖2c)。這些微型光學(xué)器件顯示出極好的長期生物相容性，并且可以遠(yuǎn)程控制腦功能的調(diào)節(jié)，甚至用于復(fù)雜的動物行為學(xué)操控。
(3)直接利用細(xì)胞或生物體組織攝取上轉(zhuǎn)換納米粒子(圖2d)。該方法在目前研究中最為常用，將功能修飾的上轉(zhuǎn)換納米粒子與所要調(diào)控的細(xì)胞孵育，或者直接通過注射的方式進(jìn)入特定組織器官，待納米粒子被有效攝入后，進(jìn)行近紅外激光照射并實(shí)現(xiàn)光遺傳學(xué)調(diào)控。這種策略不僅可以達(dá)到亞細(xì)胞層面的精準(zhǔn)光調(diào)控，而且在動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方面也易于實(shí)施。但是，局限也很突出，比如難以操作，生物安全患等方面。
2近紅外上轉(zhuǎn)換光遺傳學(xué)體系在生物功能調(diào)控方面的應(yīng)用進(jìn)展
近紅外上轉(zhuǎn)換納米技術(shù)和光遺傳學(xué)的結(jié)合，從原理上克服了體內(nèi)常用光遺傳學(xué)研究中遇到的局限性，包括激發(fā)光的低穿透性或者光源植入的侵入性，為神經(jīng)細(xì)胞或非神經(jīng)體系中膜離子通道的調(diào)控提供了巨大的機(jī)會[32]。這種靈活的光學(xué)操控技術(shù)在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域取得了一系列成果，并進(jìn)一步證明了其更廣泛的適用性(表3)[34，69-70]?？紤]到生物的內(nèi)在復(fù)雜性，到目前為止，上轉(zhuǎn)換光遺傳學(xué)及其他調(diào)控技術(shù)，在詳細(xì)闡明基本的生理、病理方面的探索仍然處于最初期階段。因此，下面將著重討論目前在不同生物模型上，采用近紅外上轉(zhuǎn)換光遺傳學(xué)調(diào)節(jié)膜離子通道、鈣信號以及相關(guān)生物學(xué)活性方面的研究進(jìn)展。
2.1神經(jīng)細(xì)胞膜電位
將光活性蛋白用于刺激活化或抑制神經(jīng)活動是近年來神經(jīng)學(xué)研究中的一大創(chuàng)新。這種光遺傳手段由于具有較低的侵入性并且能夠在時(shí)間與空間尺度精確地調(diào)節(jié)神經(jīng)活動，因而在神經(jīng)學(xué)研究中具有較為廣闊的應(yīng)用前景[23]。
早在2015年，Lee等[54]報(bào)道了通過UCNP進(jìn)行神經(jīng)調(diào)節(jié)的應(yīng)用。該研究中視紫紅質(zhì)離子通道蛋白通過生物工程的手段表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)胞中，在近紅外光(980nm)的照射下，這些神經(jīng)元能夠在毫秒范圍內(nèi)產(chǎn)生持續(xù)的神經(jīng)脈沖信號。在之后的研究中，科研人員設(shè)計(jì)并制備了一系列發(fā)光性質(zhì)不同的UCNPs，用于不同光敏離子通道的活化[15，31]。譬如，Han等[41]設(shè)計(jì)制備了IR806染料敏化的UCNP，通過800nm的近紅外光激發(fā)，實(shí)現(xiàn)了對紅光響應(yīng)離子通道(ReaChR)的調(diào)節(jié)。實(shí)驗(yàn)中，染料敏化的UCNP被包覆于聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)薄膜中，用于海馬神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)。這些神經(jīng)細(xì)胞能夠?qū)崿F(xiàn)精確的時(shí)空調(diào)節(jié)，以光強(qiáng)度依賴性地方式被激活并產(chǎn)生神經(jīng)信號。除此之外，在976nm激發(fā)條件下能發(fā)射綠光(550nm)的UCNPs(NaYF4∶Sc/Yb/Er@NaYF4)也被用于刺激離子通道C1V1或mVChR1以產(chǎn)生光電流。而對于表達(dá)PsChR的神經(jīng)元，則可以通過發(fā)射藍(lán)光的UCNPs(NaYF4∶Sc/Yb/Tm@NaYF4)實(shí)現(xiàn)近紅外光遺傳學(xué)刺激。上轉(zhuǎn)換納米材料可調(diào)的光學(xué)性質(zhì)和不同光敏離子通道蛋白的靈活搭配為近紅外光遺傳學(xué)體系提供了豐富多樣的選擇，極大地促進(jìn)了后續(xù)在動物模型上的生理、病理研究。
2.2鈣信號通路
不同于常見報(bào)道的UCNP-ChR體系，Zhou和Han等[55]展示了另一種基于上轉(zhuǎn)換納米顆粒的近紅外光遺傳學(xué)平臺，被稱作“Opto-CRAC”(圖3a)。Opto-CRAC在細(xì)胞和活體環(huán)境中，通過近紅外光照射而發(fā)出藍(lán)光的UCNPs(NaYF4∶Yb/Tm@NaYF4)作用于經(jīng)基因工程改造的光敏鈣離子通道蛋白，既可以選擇性地控制細(xì)胞內(nèi)鈣離子的流入以及受此過程調(diào)控的基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)(圖3(b～d))。通過對光信號的調(diào)節(jié)(如激光的脈沖、強(qiáng)度)，該體系的光遺傳模塊LOVSoc能夠可逆地產(chǎn)生持久且周期變化的鈣離子信號。更為重要的是，Opto-CRAC介導(dǎo)的光致鈣離子信號通路活化可以引發(fā)免疫細(xì)胞的特異性生理響應(yīng)。通過使用近紅外光激活光控-鈣通道，可以促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的成熟及抗原的呈遞，進(jìn)而刺激T細(xì)胞的活化。通過這種手段實(shí)現(xiàn)了對細(xì)胞信號通路進(jìn)行的精確操作，進(jìn)而調(diào)控下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，方便其在動物生理/病理研究中發(fā)揮作用。
此外，斑馬魚活體模型廣泛用于生命醫(yī)藥領(lǐng)域，比如生物造影，診斷治療及生理病理研究[61]。目前，關(guān)于近紅外光遺傳學(xué)調(diào)控在斑馬魚模型中的可行性研究被Xing等[62]報(bào)道。該工作巧妙地設(shè)計(jì)了808nm激發(fā)的上轉(zhuǎn)換光遺傳學(xué)體系，實(shí)現(xiàn)了對離子通道ChR2的調(diào)節(jié)以及鈣離子介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞命運(yùn)調(diào)控(圖4)。更為重要的是，該體系揭示了在體外和活體條件下，通過近紅外光介導(dǎo)的離子通道的調(diào)節(jié)可引起細(xì)胞的凋亡，具有進(jìn)一步在腫瘤治療方面的應(yīng)用前景。
2.3線蟲行為學(xué)
除了能對細(xì)胞膜離子通道進(jìn)行有效地調(diào)節(jié)外，在改進(jìn)上轉(zhuǎn)換光遺傳學(xué)研究方面，Zhang等[58]通過利用準(zhǔn)連續(xù)波的近紅外激發(fā)手段，提高了上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率并在表達(dá)ChR2的線蟲體內(nèi)成功地實(shí)現(xiàn)光遺傳學(xué)神經(jīng)信號及行為學(xué)調(diào)控(圖5(a，b))。最近的一項(xiàng)研究中，Gao等[67]采用線蟲模型，借助近紅外激發(fā)綠光發(fā)射的UCNP對表達(dá)有Crimson光敏離子通道的不同神經(jīng)元(運(yùn)動神經(jīng)元或中間神經(jīng)元)進(jìn)行調(diào)控，實(shí)現(xiàn)了對線蟲多種運(yùn)動行為的控制(圖5c)。這些工作不僅揭示了增強(qiáng)UCNP的多光子發(fā)光效率的可能性，還通過近紅外光使線蟲產(chǎn)生了受觸動刺激的反應(yīng)，展現(xiàn)出近紅外光光遺傳學(xué)這種非侵入性調(diào)控策略在不同活體動物模型應(yīng)用上的優(yōu)勢和靈活性。
2.4鼠神經(jīng)活性及行為學(xué)
鼠類模型在生化、醫(yī)藥研究中作為一種最為普遍的動物模型，對于光遺傳學(xué)的轉(zhuǎn)化研究更具價(jià)值[30]。盡管深層組織的光學(xué)刺激在鼠類模型中很大程度上需要特殊的光學(xué)設(shè)施，以及復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)手術(shù)操作，但隨著光遺傳學(xué)和上轉(zhuǎn)換納米技術(shù)的發(fā)展，通過近紅外光進(jìn)行小鼠腦部功能的光遺傳學(xué)調(diào)控已經(jīng)成為可能。
Shi等[63]報(bào)道了一種基于UCNP的微型光極器件實(shí)現(xiàn)了遠(yuǎn)程光學(xué)控制小鼠腦部神經(jīng)元(表達(dá)有多種視蛋白如ChR2或C1V1)的目標(biāo)(圖6)。機(jī)械激光投射系統(tǒng)通過發(fā)出的近紅外光，可以有效地控制鼠的不同腦部區(qū)域的功能并產(chǎn)生神經(jīng)脈沖活動，譬如腦部紋狀體，中腦腹側(cè)蓋區(qū)以及視覺皮層。值得注意的是，在另一項(xiàng)工作中，Shi等[63]還通過設(shè)計(jì)制備不同光譜特征的UCNPs，實(shí)現(xiàn)了體外與體內(nèi)條件下，神經(jīng)細(xì)胞的多重刺激或抑制。上轉(zhuǎn)換光遺傳技術(shù)在小鼠神經(jīng)活動刺激研究中的成功應(yīng)用，極大地促進(jìn)了基礎(chǔ)生理調(diào)控以及神經(jīng)科學(xué)的發(fā)展。
另外，McHugh及Liu[66]探究了將UCNPs作為光遺傳調(diào)節(jié)器以微侵入注射式的方法調(diào)控小鼠腦部深層神經(jīng)元功能的可能性(圖7)。該研究中，近紅外介導(dǎo)的光遺學(xué)傳刺激能夠引發(fā)腦部腹側(cè)被蓋區(qū)域多巴胺的釋放。在此基礎(chǔ)上，通過刺激腦部內(nèi)側(cè)隔核的抑制性神經(jīng)元，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生神經(jīng)振蕩。更為重要的是，研究中這種上轉(zhuǎn)換光遺傳體系還可以抑制癲癇小鼠海馬體中的興奮性神經(jīng)元，實(shí)現(xiàn)記憶恢復(fù)，展現(xiàn)了其在神經(jīng)疾病治療方面的巨大潛力。
除了腦部神經(jīng)活動調(diào)控，上轉(zhuǎn)換光遺傳體系還被成功地應(yīng)用于小鼠的脊柱神經(jīng)調(diào)節(jié)并用以控制小鼠的行為活動。Shi等[61]用聚丙烯以及UCNP制成光極器件，植入小鼠脊柱不同部位中(圖8)。這些小鼠在已麻醉的情況下，通過近紅外光的刺激，可以由肌電圖觀測到其腿部肌肉的活動。而自由活動的小鼠，在光的刺激下其運(yùn)動行為還能被有效地抑制。這種柔性器件與上轉(zhuǎn)換光遺傳學(xué)的結(jié)合，還展現(xiàn)出較好的生物相容性。在長達(dá)4個(gè)月的植入期內(nèi)未引起明顯的炎癥，適用于動物行為學(xué)的長期跟蹤研究。
3近紅外上轉(zhuǎn)換光遺傳學(xué)技術(shù)存在的問題及改進(jìn)策略
盡管上轉(zhuǎn)換光遺傳學(xué)前景廣闊，但目前仍然面臨著納米粒子生物安全性低，近紅外光上轉(zhuǎn)換效率低，以及持續(xù)照射引起的熱效應(yīng)顯著等挑戰(zhàn)[32，71]。為了解決這些問題，科學(xué)家們已經(jīng)從各方面入手來改進(jìn)這項(xiàng)技術(shù)，以期實(shí)現(xiàn)更高效，更精確地生物功能調(diào)控，并進(jìn)一步使未來的臨床轉(zhuǎn)化研究成為可能。
3.1提高上轉(zhuǎn)換效率
首先，上轉(zhuǎn)換納米材料的量子效率低是實(shí)現(xiàn)有效地光遺傳學(xué)調(diào)控的最大限制因素。到目前為止，在低于100W·cm-2的激發(fā)光功率密度下，近紅外到可見光上轉(zhuǎn)換效率最高僅約為5%，而考慮到實(shí)際應(yīng)用中，生物機(jī)體對于輻射暴露的最大允許劑量(例如980nm，皮膚組織MPE(maximumpermissibleexposure)＜1W·cm-2)的限制，通常上轉(zhuǎn)換效率會遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于1%[72]。對此，許多研究團(tuán)隊(duì)提出了增強(qiáng)上轉(zhuǎn)換效率的不同策略，包括合成核-殼結(jié)構(gòu)或表面修飾來控制局部環(huán)境的猝滅效應(yīng)，利用敏化劑/活化劑來改善能量轉(zhuǎn)移效率，以及通過激發(fā)光源的工程化來促進(jìn)光子轉(zhuǎn)移等[73-74]。
將增強(qiáng)上轉(zhuǎn)換發(fā)光效率的策略進(jìn)一步應(yīng)用于光遺傳學(xué)調(diào)控的研究已有報(bào)道。Shi和Wang研究團(tuán)隊(duì)[65]最近通過合成核-殼-殼納米結(jié)構(gòu)，并優(yōu)化Yb3+離子的摻雜含量，實(shí)現(xiàn)了3倍于傳統(tǒng)核-殼結(jié)構(gòu)納米粒子的上轉(zhuǎn)換發(fā)光增強(qiáng)，并將其進(jìn)一步開發(fā)為一種可植入的光學(xué)傳感器，用于對表達(dá)eNpHR氯離子通道的小鼠大腦活性及行為學(xué)進(jìn)行光遺傳學(xué)抑制。另外，Prasad等[59]在一項(xiàng)近紅外光遺傳學(xué)的工作中應(yīng)用了新型的核-殼型上轉(zhuǎn)換納米粒子(NaYbF4∶Tm@NaYF4)，這種材料的發(fā)光強(qiáng)度比傳統(tǒng)NaYF4∶Yb/Tm@NaYF4納米體系發(fā)光約高出6倍。此外，Zhang團(tuán)隊(duì)[58]通過使用準(zhǔn)連續(xù)波作為激發(fā)光源來進(jìn)行光遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)，不僅提高了上轉(zhuǎn)換藍(lán)光發(fā)射，還降低了潛在的熱效應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)了有效的光遺傳神經(jīng)調(diào)控。
3.2控制熱效應(yīng)
利用近紅外上轉(zhuǎn)換技術(shù)可以有效地激活深層組織中的光敏膜離子通道。但應(yīng)該指出的是，大部分上轉(zhuǎn)換納米粒子在980nm激光照射下可能會導(dǎo)致局部組織的熱損傷[72]。為了避免這種熱效應(yīng)，在實(shí)際上轉(zhuǎn)換光遺傳學(xué)調(diào)控中，大部分的研究只能通過合理控制激光的功率以及照射時(shí)間來控制。除此以外，將上轉(zhuǎn)換激發(fā)波長從980nm移至800nm，在很大程度上降低了機(jī)體組織水的熱響應(yīng)，可以極大地減少激光引起的熱刺激[75]。例如，在Han等[64]的報(bào)道中，使用染料敏化的核/殼結(jié)構(gòu)上轉(zhuǎn)換材料，可以在800nm近紅外光照射下激活海馬神經(jīng)元中的離子通道蛋白(ReaChR)。
3.3改善生物相容性
在生物醫(yī)學(xué)乃至臨床應(yīng)用中，無機(jī)金屬納米材料在體內(nèi)的生物相容性或潛在毒性是一個(gè)重要的問題[76]。迄今為止，尚無詳盡的報(bào)道涉及上轉(zhuǎn)換納米粒子本身或用于表面功能化的相關(guān)試劑和配體的刺激性及長期毒性的研究，如免疫反應(yīng)和誘變作用。但可以證實(shí)的是，上轉(zhuǎn)換納米材料的形貌尺寸、化學(xué)組成及表面修飾都影響其在體外和體內(nèi)的安全性[76-80]。有一些常規(guī)的策略可以在一定程度上降低上轉(zhuǎn)換納米體系的毒性，比如制備超小尺寸納米粒子(＜10nm)以增強(qiáng)生物清除率[81]；選擇合適的配體進(jìn)行表面修飾，例如聚乙二醇(PEG)、二氧化硅(SiO2)等安全性高的生物功能修飾劑；再者，通過增強(qiáng)上轉(zhuǎn)換發(fā)光進(jìn)而降低納米材料的使用濃度，也是一種解決劑量依賴的毒性問題行之有效的方法[82-83]。另一方面，由于生物體本身沒有光遺傳學(xué)工具，而通過病毒或聚合物的基因轉(zhuǎn)染手段在體內(nèi)表達(dá)光敏蛋白也具有一定的安全性顧慮。
3.4實(shí)現(xiàn)特異性調(diào)控
盡管通過上轉(zhuǎn)換光遺傳學(xué)在神經(jīng)元或非神經(jīng)元調(diào)節(jié)方面取得了初步成功，但是目前在實(shí)際應(yīng)用中光控生理功能的效率還受限于調(diào)控的精確性。主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：
(1)光遺傳學(xué)工具的離子選擇性。目前廣泛使用的光敏感視紫紅質(zhì)蛋白，尤其是陽離子通道蛋白(例如ChRs)，其激活后對Ca2+、Na+或K+等的細(xì)胞內(nèi)流缺乏選擇性，因此難以做到精準(zhǔn)控制生理信號。對于如何解決離子選擇性問題，有以下兩種可能的策略：一是對已有的ChRs進(jìn)行基因工程改造，得到具有高離子選擇性的突變體，但至今還鮮有相關(guān)報(bào)道；二是結(jié)合其他現(xiàn)有的光遺傳學(xué)技術(shù)，構(gòu)建離子選擇性好的光遺傳學(xué)工具。例如，基于特異性的Ca2+通道激活釋放的光遺傳學(xué)平臺(Opto-CRAC)，在體外和體內(nèi)都體現(xiàn)出優(yōu)秀的Ca2+信號調(diào)節(jié)能力[55，84]；另外，近年來報(bào)道的熱敏離子通道(TRPs)也極具潛力，有望實(shí)現(xiàn)高選擇性的Ca2+信號調(diào)控。
(2)光遺傳學(xué)調(diào)控的細(xì)胞/組織特異性。許多在細(xì)胞層面上的光遺傳學(xué)研究表明，上轉(zhuǎn)換納米轉(zhuǎn)換器盡可能地靠近膜離子通道蛋白，可顯著提高光子能量轉(zhuǎn)移的效率，對調(diào)控效果產(chǎn)生重要影響。目前已報(bào)道了不同的策略，被用于將上轉(zhuǎn)換納米粒子盡可能特異地連接在光敏蛋白表達(dá)的細(xì)胞膜上(圖9)。其中包括抗原-抗體結(jié)合的策略，將UCNPs定位于細(xì)胞表面，還可以通過糖代謝標(biāo)記技術(shù)來共價(jià)連接。
而在動物層面，目前通過使用靶向的光基因遞送技術(shù)，如細(xì)胞/組織特異性慢病毒感染等可以實(shí)現(xiàn)特異性的光遺傳學(xué)調(diào)控[85-87]。但在實(shí)際的神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用中，需要借助于腦定位注射來實(shí)現(xiàn)精確光遺傳學(xué)基因及上轉(zhuǎn)換納米體系在目的組織區(qū)域表達(dá)。由于大腦結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，很難保證操作的精準(zhǔn)度，這在光遺傳學(xué)研究中也是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)。
(3)納米粒子靶向性。除此以外，上轉(zhuǎn)換納米粒子的靶向能力是遠(yuǎn)程調(diào)控細(xì)胞/組織特異性離子通道的另一個(gè)限制因素[88-89]。例如，在深層腦區(qū)的光遺傳學(xué)操作中，納米粒子難以有效通過血腦屏障(BBB)，因而只能通過注射的方法來輸送上轉(zhuǎn)換納米顆粒。這種策略不僅增加了創(chuàng)傷性，還有可能引入一些潛在的不良反應(yīng)。因此，開發(fā)完全無創(chuàng)的、可血液遞送的上轉(zhuǎn)換納米平臺，進(jìn)而能夠用于腦部的近紅外光遺傳學(xué)體系將是未來研究的一大方向。
3.5標(biāo)準(zhǔn)化上轉(zhuǎn)換光遺傳學(xué)設(shè)備
最后，除了對上轉(zhuǎn)換納米轉(zhuǎn)換器和光遺傳學(xué)工具的改進(jìn)之外，可靠的光學(xué)調(diào)控儀器以及信號記錄設(shè)備在實(shí)際的上轉(zhuǎn)換光遺傳學(xué)應(yīng)用也亟待開發(fā)。迄今為止，用于上轉(zhuǎn)換材料光學(xué)表征的大多數(shù)儀器都是實(shí)驗(yàn)室個(gè)人定制。此外，在動物模型中用于近紅外激光介導(dǎo)的光遺傳刺激、監(jiān)測的專用儀器也非常有限[90-91]。因此，目前的上轉(zhuǎn)換光遺傳學(xué)研究的穩(wěn)定性和重復(fù)性還不盡人意，亟待研發(fā)商用的、標(biāo)準(zhǔn)化的儀器(例如光譜儀，刺激器，顯微成像系統(tǒng)及膜片鉗設(shè)備等)?？傮w而言，由于近紅外上轉(zhuǎn)換光遺傳學(xué)是一個(gè)多學(xué)科、高度交叉的領(lǐng)域，學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的任何建設(shè)性合作與整合都將有利于該技術(shù)的轉(zhuǎn)化應(yīng)用。
第3篇：重復(fù)的遺傳學(xué)效應(yīng)范文
關(guān)鍵詞 藥物成癮，表觀遺傳學(xué)，組蛋白乙酰化，DNA甲基化。
分類號 B845
藥物成癮作為一種慢性復(fù)發(fā)性腦疾病。復(fù)吸率達(dá)95％以上。環(huán)境線索誘發(fā)的復(fù)吸一直是藥物成癮治療的難題，大多成癮者在經(jīng)過戒毒治療之后對環(huán)境刺激沒有明顯的渴求和復(fù)吸傾向，但離開戒毒所回到原來的生活環(huán)境之后，又會出現(xiàn)很高的復(fù)吸率。主要原因就是成癮藥物導(dǎo)致的異常記憶的長期存在所致。FosB是目前成癮與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)領(lǐng)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)保持時(shí)間最長的分子，但其時(shí)間長度顯然無法與成癮行為及成癮記憶的長期性相匹配。成癮記憶長期性的分子機(jī)制有待進(jìn)一步探索。神經(jīng)細(xì)胞中唯一保持穩(wěn)定的就是染色體組，研究表明DNA甲基化等表觀遺傳學(xué)的改變是發(fā)育過程中細(xì)胞記憶的重要分子基礎(chǔ)，進(jìn)而維持細(xì)胞在分裂過程中保持表型的相對穩(wěn)定，尤其是某些基因的甲基化能使該基因永久沉默和不再激活，有可能是細(xì)胞分化結(jié)束后記憶長期保持的重要分子機(jī)制。提示表觀遺傳變異的長時(shí)穩(wěn)定性也許可作為成癮長期性的非常重要的候選機(jī)制。因此，表觀遺傳學(xué)有可能為成癮記憶長期存在的腦機(jī)制研究提供新視角，并且為藥物成癮的臨床治療提供新的思路。
2 成癮記憶長期性分子機(jī)制的研究進(jìn)展
2.1 學(xué)習(xí)記憶的異常改變是藥物成癮長期存在的重要原因
藥物成癮的形成是從偶爾或控制性使用藥物發(fā)展到不可控制的強(qiáng)迫性使用藥物的過程，其主要特征是產(chǎn)生不惜一切代價(jià)的覓藥行為并長期保持這一行為。這一過程伴隨著學(xué)習(xí)記憶功能的變化。大量研究表明，不論是學(xué)習(xí)記憶還是成癮過程都使相應(yīng)腦區(qū)結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生長時(shí)程變化從而導(dǎo)致行為改變。藥物成癮過程與學(xué)習(xí)記憶可能存在相同的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)表明二者作用于相同的腦區(qū)，學(xué)習(xí)記憶過程中起關(guān)鍵作用的相關(guān)腦區(qū)(如，海馬)參與成癮藥物的強(qiáng)化效應(yīng)，在藥物成癮過程中起關(guān)鍵的作用的中腦多巴胺系統(tǒng)也參與學(xué)習(xí)記憶過程；電生理實(shí)驗(yàn)證明二者有相同的細(xì)胞機(jī)制，盡管成癮藥物主要通過中腦多巴胺系統(tǒng)產(chǎn)生強(qiáng)化作用，學(xué)習(xí)記憶過程主要發(fā)生于海馬、杏仁核、前額葉皮層等腦區(qū)，但兩個(gè)過程都在相應(yīng)腦區(qū)出現(xiàn)細(xì)胞突觸長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)或長時(shí)程抑制(LTD)現(xiàn)象；分子生物學(xué)研究表明，學(xué)習(xí)記憶和成癮的形成無論發(fā)生在哪一腦區(qū)，不論是通過何種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制最終大多匯聚于環(huán)一磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB，cAMP-response element binding protein)，并通過CREB調(diào)控相應(yīng)的靶基因改變細(xì)胞的可塑性。此外，某些個(gè)體初次接觸成癮藥物就能產(chǎn)生深刻記憶從而形成和維持強(qiáng)迫性用藥行為；戒斷很長一段時(shí)間的成癮行為仍能由條件線索誘發(fā)。以上事實(shí)表明學(xué)習(xí)記憶功能的異常改變并長期保持是產(chǎn)生藥物成癮的重要原因。
2.2 成癮相關(guān)記憶長期性的分子生物學(xué)機(jī)制
成癮藥物進(jìn)入體內(nèi)會導(dǎo)致海馬、前額葉皮層、中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)及伏隔核等學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)的多巴胺、谷氨酸等神經(jīng)遞質(zhì)釋放的異常變化，通過作用于相應(yīng)的受體引發(fā)一系列分子事件，包括激活細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，改變神經(jīng)營養(yǎng)因子、轉(zhuǎn)錄因子、即刻早期基因或染色體的結(jié)構(gòu)等，并最終引起突觸的可塑性、甚至神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致成癮記憶的長期存在。因此闡明成癮記憶長期性與頑固性的分子機(jī)制是治療藥物成癮的關(guān)鍵。
CREB是目前研究最多的與成癮記憶密切相關(guān)的分子機(jī)制之一，大多數(shù)成癮藥物都可以通過直接或間接途徑增加多巴胺的釋放，然后通過作用于D1受體增加cAMP的釋放從而活化PKA，使CREB磷酸化調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)成癮藥物的行為效應(yīng)。CREB也是哺乳動物長時(shí)記憶形成的必要環(huán)節(jié)，促進(jìn)海馬、杏仁核CREB的活動的動物學(xué)習(xí)記憶能力增強(qiáng)。因此，CREB在藥物成癮與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)基因表達(dá)過程中起樞紐作用，參與成癮記憶的形成。長期慢性成癮藥物處理可使cAMP/PKA/CREB通路的功能上調(diào)，導(dǎo)致異常的記憶形成。毋庸置疑，cAMP/PKA/CREB通路的變化是成癮記憶產(chǎn)生的關(guān)鍵分子機(jī)制之一，但是CREB的變化在停止藥物使用后幾天內(nèi)便恢復(fù)正常，不能解釋藥物戒斷后很長一段時(shí)間內(nèi)(甚至終身)成癮記憶長期存在這一客觀事實(shí)。可能的解釋是CBEB的變化是啟動而不是維持成癮記憶長期存在的更加穩(wěn)定的分子機(jī)制的必要環(huán)節(jié)。
FosB是目前成癮與學(xué)習(xí)記憶領(lǐng)域內(nèi)保持時(shí)間最長的分子，在成癮藥物急性作用下通過cAMP/PKA/CREB通路誘發(fā)即刻早期基因c-fos、c-jum的表達(dá)，但在數(shù)小時(shí)后便恢復(fù)到正常水平。FosB也是Fos蛋白家族成員之一，但對藥物的急性效應(yīng)無明顯的反應(yīng)。相反在成癮藥物的反復(fù)作用下，F(xiàn)osB的表達(dá)逐漸增加，而c-fos、c-jun的表達(dá)逐漸減少。FosB蛋白具有較高的穩(wěn)定性，在停止藥物后數(shù)月內(nèi)都保持相對穩(wěn)定。FosB一旦形成后便能調(diào)節(jié)許多靶基因表達(dá)，細(xì)胞周期素依賴激酶5(cdk5)基因便是其調(diào)控的最重要的靶基因之一，參與神經(jīng)元的生長。因此，F(xiàn)osB的高表達(dá)能夠增強(qiáng)突觸的可塑性，甚至改變神經(jīng)元的形態(tài)，維持成癮記憶的長期性。但是FosB蛋白的變化在停止藥物后只能保持幾個(gè)月，其時(shí)間長度仍然無法與成癮行為及成癮記憶的長期性相匹配。
2.3 成癮記憶長期性的表觀遺傳學(xué)研究
表觀遺傳學(xué)(Epigenetics)是研究核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達(dá)了可以遺傳的變化的一門遺傳學(xué)分支學(xué)科。其中DNA甲基化的改變一般不可逆轉(zhuǎn)，是發(fā)育過程中細(xì)胞記憶的重要分子基礎(chǔ)，維持細(xì)胞在分裂過程中保持表型的相對穩(wěn)定。由此推測表觀遺傳學(xué)的變化，尤其是基因的甲基化能使該基因永久沉默和不再激活，有可能是細(xì)胞分化結(jié)束后記憶長期保持的重要分子機(jī)制?？梢酝茰yDNA甲基化等表觀遺傳學(xué)的改變可能是成癮記憶長期存在的分子基礎(chǔ)之一。
真核生物的遺傳信息主要儲存在染色體上，染色體的基本結(jié)構(gòu)主要是H2A、H2B、H3、H4四種組蛋白構(gòu)成的八聚體以及纏繞在上面的DNA所組成。染色體空間結(jié)構(gòu)的變化調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子與相關(guān)基因的結(jié)合，從而控制基因的表達(dá)。表觀遺傳學(xué)機(jī)制主要通過改變?nèi)旧w的空間構(gòu)型來影響基因的表達(dá)，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾(包括乙?；?、甲基化、磷酸化等)、染色體重塑和非編碼
RNA(如RNAi)等作用方式。DNA甲基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑之間是相互作用的，染色質(zhì)的重塑和組蛋白的去乙?；窍嗷ヒ蕾嚨?，DNA甲基化可能需要組蛋白去乙?；?HDACs)的活動或染色質(zhì)的重塑中的成分參與。通常，DNA甲基化、組蛋白去乙?；腿旧|(zhì)的壓縮狀態(tài)和DNA的不可接近性，以及基因處于抑制和沉默狀態(tài)相關(guān)；而DNA的去甲基化、組蛋白的乙?；腿旧|(zhì)松散狀態(tài)，則與轉(zhuǎn)錄的啟動、基因活化和行使功能有關(guān)。DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一，可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化能關(guān)閉某些基因的活性，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá)。DNA的甲基化是在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?I甲基胞嘧啶。乙?；D(zhuǎn)移酶(HATs)主要是在組蛋白H3、H4的N端尾上的賴氨酸加上乙酰基，去乙?；?HDACs)則相反。不同位置的修飾均需要特定的酶來完成，通過這些酶作用改變?nèi)旧w的空間結(jié)構(gòu)。
成癮藥物會導(dǎo)致VTA、NAe和其他相關(guān)腦區(qū)的mRNA水平的改變。這些基因表達(dá)的變化在戒斷后可存月余。這些長時(shí)程的變化使人們將研究染色質(zhì)重塑作為長時(shí)程甚至終身持續(xù)影響大腦獎賞區(qū)域的基因表達(dá)的分子基礎(chǔ)。最近研究表明，早期接觸成癮藥物不改變基因編碼而調(diào)控基因活性的表觀遺傳學(xué)機(jī)制，對成熟的神經(jīng)元具有長效作用從而增加成年后的成癮易感性，并且在急性或慢性接觸成癮藥物的過程中表現(xiàn)出不同的作用機(jī)制。
急性可卡因注射導(dǎo)致紋狀體的e-Fos和FosB表達(dá)，并且這個(gè)現(xiàn)象與給藥后30分鐘內(nèi)的H4乙?；亩虝涸黾佑嘘P(guān)。CBP因?yàn)槠鋬?nèi)在的組蛋白乙?；钚?，在藥物導(dǎo)致的FosB基因組蛋白乙?；^程中起了重要的介導(dǎo)作用，并且也可能在其他基因中也起了類似的作用。急性可卡因注射也能誘導(dǎo)出e-Fos基因啟動子的H3的乙?；?，并且這種作用需要蛋白激酶MSK1。相對于急性處理，慢性可卡因處理和自我給藥可以激活或者抑制許多不同的基因。比如急性或者慢性處理都會產(chǎn)生FosB基因，但是急性暴露使H4產(chǎn)生乙酰化而慢性處理使H3產(chǎn)生乙?；?。慢性成癮藥物處理后特異性誘導(dǎo)的基因，比如Cdk5和Bdnf基因也表現(xiàn)出H3的乙?；⑶业玫阶C明的確是這種表觀遺傳學(xué)的變化引起來特定基因表達(dá)的變化。因?yàn)槁蕴幚砗蟮慕鋽嗥?，出現(xiàn)了可卡因引起的BDNF啟動子的組蛋白乙?；?，組蛋白修飾的變化是先于這個(gè)區(qū)域BDNFmRNA和蛋白質(zhì)的增加。
在急性和慢性給藥引起的表觀遺傳學(xué)修飾不同，存在著由H4乙?；騂3乙?；霓D(zhuǎn)變。在海馬急性和慢性電刺激之后也會有這種類似的轉(zhuǎn)變。這提示H3乙酰化可能象征著一種染色質(zhì)變化的信號，代表持久穩(wěn)固或者重復(fù)激活的基因的。HATs(組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶)和HDACs(組蛋白去乙?；?對于H3H4的特定乙?；鶜堄嗟拇呋磻?yīng)的特異性現(xiàn)在知之甚少。急性或慢性處理之后，HATs或HDACs對于基因調(diào)控的截然相反的作用可能介導(dǎo)了H4乙?；騂3乙?；霓D(zhuǎn)變。
全基因組水平的表觀遺傳修飾的檢測手段使相關(guān)基因的篩查更為有效?？煽ㄒ蛘{(diào)控Cdk5和Bdnf基因的組蛋白乙酰化，使應(yīng)用染色體免疫沉淀芯片(ChIP on ChiD)或SACO[301的方法探索全基因組層面的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的檢測方法顯示出重要作用，提示染色質(zhì)水平的失調(diào)可能導(dǎo)致可卡因成癮?；蚪M層面的表觀遺傳學(xué)方法在發(fā)育和腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域曾發(fā)現(xiàn)了許多令人振奮的結(jié)果，現(xiàn)在類似的研究正在成癮研究中進(jìn)行。現(xiàn)在Nestler的實(shí)驗(yàn)室初步鑒定了幾百個(gè)慢性可卡因處理后顯著過高或過低乙?；幕?。
此外，慢性可卡因處理可引起甲基化CPG島結(jié)合蛋白2(MeCP2)與甲基化CPG島結(jié)合蛋白MBD1的高表達(dá)，通過蛋白去乙?；敢种葡掠位虻谋磉_(dá)參與成癮過程。以上結(jié)果提示染色體重塑(組蛋白乙酰化與DNA甲基化)可能在成癮記憶的形成與保持過程中起關(guān)鍵作用，從而為成癮記憶長期性的分子機(jī)制提供了新的研究思路。目前研究初步發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙?；敢种苿?HDAC)參與苯丙胺行為敏感化的聯(lián)想性學(xué)習(xí)記憶過程，這些結(jié)果表明表觀遺傳學(xué)的變化參與維持成癮過程中神經(jīng)適應(yīng)性的變化。
盡管在許多成癮關(guān)鍵因子中發(fā)現(xiàn)了表觀遺傳學(xué)修飾，但有證據(jù)表明這些修飾可能通過不同的作用機(jī)制起作用。轉(zhuǎn)錄因子FosB與成癮狀態(tài)的轉(zhuǎn)換有關(guān)，在NAc能顯示出在可卡因作用下大于25％的mRNA穩(wěn)定狀態(tài)所有變化。染色體免疫沉淀能顯示其中一種mRNA的反應(yīng)，可卡因能引起Cdk5基因14的FosB直接激活，而Bdnf基因則不是直接激活FosB，說明這些基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的變化不是通過相同的機(jī)制。Cdk5基因的激活部分介導(dǎo)了慢性可卡因引起的NAc中的樹突可塑性。這些發(fā)現(xiàn)都支持這樣一個(gè)模型：FosB的積累和特定啟動子的染色體重塑因子相互作用在成癮的發(fā)展和維持中發(fā)揮重要作用。
3 研究展望
表觀遺傳學(xué)和藥物成癮都不是新興的研究領(lǐng)域，但是從表觀遺傳學(xué)角度研究成癮問題，是近幾年興起的一個(gè)研究熱點(diǎn)。從表觀遺傳變異解釋藥物成癮的神經(jīng)可塑性變化和精神依賴，為成癮藥物獎賞性的后天獲得和成癮相關(guān)記憶長時(shí)存在都提供了很有力的解釋機(jī)制。目前對于成癮進(jìn)程中的一些關(guān)鍵因子的組蛋白乙?；辛顺醪降难芯?，研究的結(jié)果使我們看到了更多表觀遺傳機(jī)制在藥物成癮研究領(lǐng)域的前景。
3.1 成癮記憶再鞏固過程的表觀遺傳機(jī)制研究
近幾年來，記憶再鞏固是學(xué)習(xí)記憶領(lǐng)域里的一個(gè)研究熱點(diǎn)，結(jié)果表明記憶再鞏固與記憶鞏固存在部分共同的神經(jīng)機(jī)制，但它不是鞏固過程的延續(xù)，而是記憶過程中的一個(gè)獨(dú)立現(xiàn)象，存在特有的神經(jīng)機(jī)制。再鞏固理論為成癮記憶的長期性提供了一種新的解釋機(jī)制，在特定環(huán)境使用成癮藥物會激活已經(jīng)形成的成癮記憶，被激活的記憶后會變得不穩(wěn)定，在成癮藥物作用下能夠促進(jìn)記憶的再鞏固過程，使原有的記憶痕跡更加牢固，多次結(jié)合后便產(chǎn)生病理性記憶，這種異常的再鞏固機(jī)制可能導(dǎo)致成癮記憶長期存在。
記憶再鞏固過程需要合成新的蛋白質(zhì)來維持原來的記憶的穩(wěn)定，記憶提取激活后在外周或記憶相關(guān)腦區(qū)(如，海馬、基底外側(cè)杏仁核、伏隔核)注射蛋白合成抑制劑能阻斷原來形成的成癮記憶。ERK是參與成癮記憶再鞏固過程的重要分子，藥物相關(guān)的環(huán)境線索在喚醒成癮記憶時(shí)能夠激活ERK的表達(dá)，記憶喚醒后抑制ERK通路可阻斷記憶的再鞏固過程，從而消除或減弱原來的成癮記憶，抑制ERK通路下游的鋅指蛋白(Zif268)的表達(dá)同樣能干擾記憶的再鞏固。說明ERK通路是成癮記憶再鞏固的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，這種反復(fù)的再鞏固過程和其積累效應(yīng)會導(dǎo)致一段時(shí)間內(nèi)相關(guān)記憶不容易消退致使成癮記憶長期存在。記憶再鞏固的表觀遺
傳機(jī)制研究可能是該領(lǐng)域研究的一個(gè)新的趨勢。
3.2 成癮過程中促進(jìn)記憶的基因與抑制記憶基因的表觀遺傳學(xué)改變
許多基因參與記憶形成、鞏固、保持與提取過程，一類是記憶促進(jìn)基因(memory promoting genes)，另一類是記憶抑制基因(memory suppressing genes)。目前大多數(shù)研究關(guān)注記憶促進(jìn)基因在記憶形成過程中的作用，發(fā)現(xiàn)了一些在短時(shí)記憶轉(zhuǎn)化為長時(shí)記憶過程中起關(guān)鍵作用的基因。相對于記憶促進(jìn)基因研究取得的重要進(jìn)展，目前對記憶抑制基因情況知之甚少，蛋白磷酸酯酶1(proteinphosl)hatase1，PP1)與cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白2(CREB2)是目前已知的兩個(gè)抑制長時(shí)記憶形成的分子，二者都是多巴胺受體激活后誘發(fā)的cAMP/PKA/CREB通路的重要環(huán)節(jié)，抑制PP1與CREB2基因的表達(dá)則促進(jìn)短時(shí)記憶向長時(shí)記憶的轉(zhuǎn)換。提示這種甲基化的發(fā)生與記憶形成過程中匹配的環(huán)境線索相聯(lián)系，即在條件化的過程起重要作用。因此，綜合研究成癮藥物作用先記憶促進(jìn)與記憶抑制基因的表觀學(xué)變化便于更清晰的闡明成癮記憶長期存在的分子機(jī)制。
3.3 存在的問題
許多表觀遺傳調(diào)控子的特異性拮抗劑的缺乏阻礙了精神障礙相關(guān)的染色質(zhì)重塑的研究。所有的可用的組蛋白去乙?；?HDACs)的拮抗劑都是非特異性的，能夠阻止所有一型和二型的HDACs。更別說一些特定的HDACs(比如三型HDACs:termedsirtuins酵素和二型HDACs:HDAC6)除了組蛋白還能使其他蛋白質(zhì)脫去乙酰基，這就使對這些抑制劑的生物學(xué)作用的解釋更加復(fù)雜化了。特定HDACs或其他染色質(zhì)重塑的特異性抑制劑才能使我們區(qū)分出精神病理現(xiàn)象中表觀遺傳調(diào)控機(jī)制所起的特定的作用。
第4篇：重復(fù)的遺傳學(xué)效應(yīng)范文
表觀遺傳學(xué)（epigenetics)是與遺傳學(xué)（genetic)相對應(yīng)的概念，是對經(jīng)典遺傳學(xué)的有益補(bǔ)充；其認(rèn)為在不改變基因序列的條件下，生物體從基因到基因表型之間存在一種調(diào)控，這種機(jī)制即“表觀遺傳學(xué)”的含義。盡管已被提出70余年,但直到近10余年，隨著科學(xué)家們對這種“獲得性遺傳”的進(jìn)一步認(rèn)識，才成為生命科學(xué)界最熱門的研究之一。因此,研究者們轉(zhuǎn)換思維，從表觀遺傳學(xué)角度對AD發(fā)病及治療進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了一系列表觀修飾的關(guān)鍵酶類，以及對這些酶類發(fā)揮影響的藥物，從而為AD藥物研發(fā)提供了新的思路和研究方向。本文擬就AD的表觀遺傳學(xué)治療研究綜述如下。
1阿爾茨海默?。ˋD)概況
阿爾茨海默?。ˋD)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶力損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。它是最常見的癡呆類型，西方國家[中50%?70%的癡呆屬于AD。其病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涵蓋了遺傳和環(huán)境的危險(xiǎn)因素，涉及成千上萬個(gè)基因表達(dá)的改變，以及多種信號途徑的上調(diào)，如P淀粉樣肽W-amyloidpeptide,Ap)的沉積、Tau蛋白過度磷酸化、炎癥、氧化應(yīng)激、能量代謝、血管因素及細(xì)胞凋亡周期異常等。ad的典型病理改變包括突觸喪失、某些神經(jīng)遞質(zhì)水平下降、神經(jīng)元內(nèi)異常物質(zhì)沉積以及選擇性腦神經(jīng)細(xì)胞死亡，使大腦受累區(qū)域廣泛萎縮，導(dǎo)致記憶力喪失伴行為改變和人格異常，嚴(yán)重者可影響工作及社會生活。受累區(qū)域常會出現(xiàn)A沉積、老年斑（senileplaques,SP)、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillarytangles,NFT)及Tau蛋白過度磷酸化等。疾病逐漸進(jìn)展惡化，甚至累及生命。遺憾的是目前尚缺乏延緩或阻礙疾病進(jìn)展的治療手段。
在AD中，涉及神經(jīng)元退行性改變的基因達(dá)200余個(gè),越來越多的研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)在沒有基因序列改變的情況下，某些機(jī)制也可以決定致病基因何時(shí)或怎樣表達(dá)，最終導(dǎo)致AD發(fā)病。因此，AD基因組并不能完全解釋發(fā)病機(jī)制[14]。已知編碼APP、PSEN1和PSEN2的基因僅可導(dǎo)致家族性早發(fā)型AD(early-onsetAD,EOAD);而大多數(shù)（約95%)AD均為晚發(fā)型AD(late-onsetAD,LOAD)或散發(fā)型。因此可以推斷，表觀遺傳現(xiàn)象或環(huán)境因素參與了LOAD的致病。這就部分解釋了為什么同一家族中有的家庭成員發(fā)病而另一些不發(fā)??；而且，在年輕的同卵雙胞胎中基因組無實(shí)質(zhì)上的差異，而在同一老年雙胞胎中其基因表觀遺傳學(xué)上存在顯著差異。
大量研究數(shù)據(jù)證實(shí)，基因-環(huán)境相互作用在AD的病理生理過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用營養(yǎng)物質(zhì)、毒素、環(huán)境暴露及人的生活行為,都可以在不改變基因組序列的條件下使基因激活或沉默。目前已知的可調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的表觀遺傳學(xué)機(jī)制主要分兩大類：①基因選擇性轉(zhuǎn)錄的調(diào)控：包括基因組DNA甲基化，多種組蛋白甲基化及乙?；刃揎?；②基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控：包括微小RNA(microRNA,miRNA)和小干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA)等非編碼RNA的調(diào)節(jié)，以及沉默的核糖體RNA(ribosomalRNA,rRNA)基因。除此之外，染色體重塑、基因印記、X染色體失活也屬于表觀遺傳學(xué)范疇。
2表觀遺傳學(xué)
表觀遺傳學(xué)的涵義即在DNA序列不發(fā)生改變的情況下，基因的表達(dá)與功能發(fā)生改變，并產(chǎn)生可遺傳的表型?；緳C(jī)制即：通過多種基因修飾，影響基因轉(zhuǎn)錄和（或）表達(dá)，從而參與調(diào)控機(jī)體的生長、發(fā)育、衰老及病理過程。至此，表觀遺傳學(xué)的發(fā)現(xiàn)極大豐富了傳統(tǒng)遺傳學(xué)的內(nèi)容，使人們認(rèn)識到遺傳信息可以有兩種形式：即DNA序列編碼的“遺傳密碼”和表觀遺傳學(xué)信息。它和DNA序列改變不同的是,許多表觀遺傳的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)是可逆的，這就為許多疾病的治療開創(chuàng)了樂觀的前景。
2.1組蛋白修飾
組蛋白在DNA組裝中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，利用核心組蛋白的共價(jià)修飾傳遞表觀遺傳學(xué)信息。這些修飾主要包括組蛋白甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化及特定氨基酸殘基N-末端的SUMO化;其中組蛋白氨基末端上的賴氨酸、精氨酸殘基是修飾的主要靶點(diǎn),這些組蛋白翻譯后修飾(post-translationalmodifications,PTMs)對基因特異性表達(dá)的調(diào)控，是其表觀遺傳學(xué)的重要標(biāo)志。正常機(jī)體內(nèi)，組蛋白修飾保持著可逆的動態(tài)平衡。一般而言,組蛋白乙?；窃诮M蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histoneacetyl-transferase,HATs)的催化下，從乙酰輔酶A上轉(zhuǎn)移乙?；浇M蛋白N-末端的賴氨酸殘基上；由于乙酰化中和了組蛋白的正電荷，使組蛋白末端和相關(guān)DNA帶負(fù)電荷磷酸基團(tuán)之間的作用減弱，降低了組蛋白和DNA之間的親和力，這種染色質(zhì)構(gòu)象的放寬有助于轉(zhuǎn)錄因子向靶基因片段聚集并利于轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行。而去乙?；瘎t是組蛋白去乙?；福╤istonedeacetylases,HDACs)將乙酰基從乙?；M蛋白轉(zhuǎn)移到乙酰輔酶A上，形成了致密的染色質(zhì)狀態(tài)，從而使基因轉(zhuǎn)錄下降或沉默。
2.2DNA甲基化
DNA甲基化較組蛋白修飾更進(jìn)一步，是表觀遺傳學(xué)的又一重要機(jī)制。DNA甲基化主要是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNAmethyltransferase,DNMTs,包括DNMT1、2、3a/b和4)催化下，將同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)-甲硫氨酸循環(huán)中S-腺苷甲硫氨酸（SAM)中的甲基，由四氫葉酸轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的第5位上形成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine,5-mC)。其中，相鄰的胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸（CpGs)是最主要的甲基化位點(diǎn)。在人類基因組中，CpG以兩種形式存在：一種分散存在于DNA中，其CpG70%?90%的位點(diǎn)是甲基化的；另一種CpG呈密集分布于一定區(qū)域，稱之為“CpG島”（CpGislands),通常位于或接近基因啟動子區(qū)（promoterregions),在正常人體基因組中處于非甲基化狀態(tài)。CpG島中的胞嘧啶甲基化可以阻礙轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，從而可致基因沉默。一般而言，高度甲基化的基因可致表達(dá)抑制,而低甲基化的基因可增強(qiáng)基因表達(dá)或過表達(dá)。
2.3非編碼RNA
表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制涉及RNA的主要包括:miRNA、siRNA以及維持細(xì)胞周期的沉默rRNA基因的一部分。
miRNA是較短的雙鏈RNA分子，約有22個(gè)核苷酸，來源于機(jī)體自身基因即細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中較大的RNA前體，有自己的啟動子和調(diào)控元件。人類基因組中有約700?800個(gè)miRNA。這些小分子RNA在轉(zhuǎn)錄后通過綁定靶mRNA,從而抑制轉(zhuǎn)錄或誘導(dǎo)mRNA分裂降解。大多數(shù)miRNA具有高度保守性和組織特異性，可以調(diào)控機(jī)體中30%?50%的蛋白質(zhì)編碼基因。siRNA長短與miRNA相似，作用方式也有很多相同之處，區(qū)別在于siRNA可以體外合成,多由外源性導(dǎo)入或感染誘導(dǎo)產(chǎn)生。
重復(fù)rRNA基因的復(fù)制為真核生物核糖體提供了初始活性位點(diǎn)，在基因表達(dá)中是蛋白質(zhì)合成的熱點(diǎn)區(qū)。不同細(xì)胞類型可表現(xiàn)不同的活性rRNA比率,提示隨著細(xì)胞發(fā)育分化，rRNA基因拷貝數(shù)比例會發(fā)生改變。沉默rRNA的表觀遺傳學(xué)方式在這個(gè)過程中發(fā)揮了重要作用,使活性和非活性rRNAs保持了動態(tài)平衡。
2.4染色質(zhì)重塑、基因印記和X染色體失活
染色質(zhì)重塑（chromatinremodeling)指基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和重組等過程中，核小置和結(jié)構(gòu)及其中的組蛋白發(fā)生變化，引起染色質(zhì)改變的過程；主要機(jī)制即致密的染色質(zhì)發(fā)生解壓縮，暴露基因轉(zhuǎn)錄啟動子區(qū)中的特定結(jié)合位點(diǎn)，使轉(zhuǎn)錄因子（transcriptionfactor,TF)更易與之結(jié)合?；蛴∮?geneticimprinting)指來自親本的等位基因在發(fā)育過程中產(chǎn)生特異性的加工修飾，導(dǎo)致子代體細(xì)胞中兩個(gè)親本來源的等位基因有不同的表達(dá)方式，即一個(gè)等位基因有表達(dá)活性，另一等位基因沉默。X染色體失活指雌性哺乳動物細(xì)胞中兩條X染色體的其中之一失去活性的現(xiàn)象,即X染色體被包裝成異染色質(zhì)，進(jìn)而因功能受抑制而沉默化，使雌性不會因?yàn)閾碛袃蓚€(gè)X染色體而產(chǎn)生兩倍的基因產(chǎn)物。
3AD的表觀遺傳學(xué)3.1組蛋白修飾
研究顯示，在AD中存在組蛋白的PTMs。組蛋白3(histone3,H3)磷酸化作為激活有絲分裂的關(guān)鍵步驟，可使AD海馬神經(jīng)元呈過磷酸化狀態(tài)。對APP/PS1突變小鼠和野生型小鼠進(jìn)行條件恐懼訓(xùn)練,結(jié)果顯示前者乙?；疕4較野生小鼠組降低50%;之后對突變組進(jìn)行HDAC抑制劑（histonedeacetylasesinhibitors,HDACIs)曲古抑菌素A的治療，顯示前者乙?；疕4水平出現(xiàn)了上升。在一項(xiàng)皮層神經(jīng)元培養(yǎng)模型研究中，APP過度表達(dá)則可導(dǎo)致H3和H4乙酰化降低，以及c-AMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-responseelementbindingprotein,CREB)水平下降;而CREB則是腦神經(jīng)元中激活記憶相關(guān)基因，形成長期記憶的關(guān)鍵蛋白?？傊?，盡管在AD患者、AD動物模型及AD培養(yǎng)模型中，都出現(xiàn)了組蛋白修飾,但這個(gè)過程是極其復(fù)雜的,特異性位點(diǎn)會因功能狀態(tài)不同而出現(xiàn)組蛋白乙?；黾踊驕p少。
3.2DNA甲基化
3.2.1相關(guān)基因的甲基化研究顯示，盡管很難判
斷AD中甲基化程度是升高還是下降，但12個(gè)甲基化的AD特異性基因表現(xiàn)出了顯著的“表觀偏移”；同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，在DNMT1啟動子內(nèi)一些CpG位點(diǎn)也表現(xiàn)出年齡相關(guān)的表觀偏移。研究還發(fā)現(xiàn)，葉酸、甲硫氨酸及Hcy代謝與DNA甲基化機(jī)制顯著關(guān)聯(lián)。例如，人類及動物模型葉酸缺乏將導(dǎo)致基因組整體低甲基化，而補(bǔ)充葉酸則可部分逆轉(zhuǎn)甲基化程度。Smith等研究發(fā)現(xiàn)，衰老及AD人群中都出現(xiàn)了葉酸缺乏和甲硫氨酸-Hcy周期的改變。另一研究發(fā)現(xiàn)AD患者腦脊液（cerebro-spinalfluid,CSF)中葉酸顯著下降，同樣下降的還有CSF及腦組織中SAM。同時(shí)還觀察到AD患者腦組織中S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)及血漿中Hcy的升高，后者可抑制DNA甲基化。
目前已知的AD相關(guān)基因主要包括：p淀粉樣蛋白前體（APP)基因、早老素1(PS1)和早老素2(PS2)基因、載脂蛋白E(ApoE)基因、p-分泌酶（BACE)基因、sortilin相關(guān)受體基因(sortilin-relatedreceptor1gene,SORL1)以及白介素1a(IL-1a)和白介素6(IL-6)基因等。其中，APP基因、BACE基因或PS1基因均存在可調(diào)控的CpG甲基化位點(diǎn)。有研究顯示,一例AD尸檢的大腦皮層中APP基因發(fā)生了完全去甲基化，而正常樣本或匹克氏病（Pick’sdisease)患者樣本則沒有這種變化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，葉酸缺乏所致的BACE和PS1基因表達(dá)增強(qiáng)，可通過補(bǔ)充SAM而恢復(fù)正常。同樣，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給予APP過度表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠缺乏葉酸、B12及B6的飲食，可以使SAH升高并上調(diào)PS1和BACE的表達(dá)，以及促進(jìn)A的沉積和出現(xiàn)認(rèn)知障礙。在LOAD尸檢標(biāo)本中，研究者發(fā)現(xiàn)了著名的“年齡依賴的表觀遺傳學(xué)漂移”(age-dependentepigeneticdrift);對CpG島異常的表觀遺傳學(xué)控制,可能促成了LOAD的病理變化,因此，“表觀遺傳學(xué)漂移”可能是LOAD個(gè)體易感的重要機(jī)制。
3.2.2Tau蛋白相關(guān)的甲基化Tau蛋白是一種微管結(jié)合蛋白（microtubulebindingprotein,MAP),它能與神經(jīng)軸突內(nèi)的微管結(jié)合，具有誘導(dǎo)與促進(jìn)微管形成，防止微管解聚、維持微管功能穩(wěn)定的功能。對記憶和正常大腦功能起重要作用。然而，在AD中,Tau蛋白不僅不再發(fā)揮正常功能，還會因異常磷酸化或糖基化等改變了Tau蛋白的構(gòu)象，使神經(jīng)元微管結(jié)構(gòu)廣泛破壞，形成以Tau蛋白為核心的NFT,最終導(dǎo)致神經(jīng)元功能受損或神經(jīng)元丟失。
人體在正常條件下，Tau蛋白啟動子的AP2結(jié)合位點(diǎn)是非甲基化的，但SP1和GCF結(jié)合位點(diǎn)則被甲基化。而隨著年齡的增加，SP1作為一種轉(zhuǎn)錄激活位點(diǎn)甲基化程度升高,GCF作為啟動子抑制位點(diǎn)則逐漸去甲基化，因此總體而言Tau蛋白的基因表達(dá)是下調(diào)的。尤其在額葉及海馬區(qū)域，正常Tau蛋白也出現(xiàn)了年齡相關(guān)的下降。蛋白磷酸酶2A(PP2A)是一種針對磷酸化Tau蛋白的去磷酸化酶，PP2A催化亞基的甲基化可以激活該酶。研究顯示，在APP及PS1基因突變的轉(zhuǎn)基因小鼠中，PP2A的甲基化程度顯著下降，結(jié)果顯示Tau蛋白磷酸化增高。對培養(yǎng)的神經(jīng)元添加葉酸拮抗劑甲氨蝶呤，也可導(dǎo)致PP2A去甲基化，從而增加Tau蛋白的磷酸化程度。另外，還有研究顯示，Hcy可以使PP2A的甲基化程度及活性下降,而添加葉酸和B12則可以逆轉(zhuǎn)這個(gè)過程。總之，Tau蛋白的磷酸化和脫磷酸化間平衡是維持微管穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素；而其中磷酸化相關(guān)酶類的甲基化程度,成為影響Tau蛋白磷酸化的重要因素。
3.2.3異常的細(xì)胞周期和神經(jīng)元凋亡研究證實(shí),細(xì)胞周期異常和神經(jīng)元凋亡是AD神經(jīng)退行性變的常見機(jī)制。AD神經(jīng)元中細(xì)胞周期及凋亡途徑關(guān)鍵因子受DNA甲基化影響并發(fā)生上調(diào)。包括細(xì)胞周期素B2基因、caspase-1基因、caspase-3基因等。這些相關(guān)基因的低甲基化使細(xì)胞進(jìn)入異常細(xì)胞周期。同樣,高Hcy可使培養(yǎng)神經(jīng)元凋亡，也間接證實(shí)了低甲基化導(dǎo)致異常細(xì)胞周期；而使用SAM還可起到拮抗細(xì)胞凋亡的效果。
3.3A與miRNA
研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可以調(diào)節(jié)APP的表達(dá)、APP處理、A聚積以及BACE1的表達(dá)，從而導(dǎo)致A毒性改變或影響神經(jīng)再生。因而,miRNA失調(diào)可使APP表達(dá)及處理過程發(fā)生改變，最終引起神經(jīng)元存活率和神經(jīng)再生程度的改變。針對全球AD人群和正常老年人群的對比研究發(fā)現(xiàn)，特異性miRNA水平存在顯著差異。研究顯示，在AD中APP相關(guān)miRNA顯著下降，而APPmRNA水平則保持平穩(wěn)，提示miRNA影響APP表達(dá)是通過抑制轉(zhuǎn)錄而不是促進(jìn)APPmRNA的裂解；同時(shí)，在AD皮層中miRNA-106b出現(xiàn)顯著下降。具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
3.4AD與一碳代謝
葉酸代謝又稱為一碳代謝，需要SAM提供甲基。諸多研究表明,AD患者常存在血漿及CSF中Hcy升高（兩者濃度升高常呈正相關(guān))，血漿葉酸和B12水平下降，以及腦組織中SAM減少。早期暴露于缺乏葉酸及B族維生素飲食的動物，其AD相關(guān)基因在腦組織中發(fā)生了表觀遺傳學(xué)修飾。SAM作為甲基化過程最重要的甲基來源，其產(chǎn)生及循環(huán)依賴于甲硫氨酸循環(huán)的正常進(jìn)行[11]。研究顯示,AD患者CSF中SAM出現(xiàn)顯著下降，口服SAM(1200mg,qd)4?8個(gè)月,可以使CSF中SAM濃度升高。同時(shí)，維生素B12缺乏可使SAM產(chǎn)生減少，從而影響甲基化。前瞻性隊(duì)列研究表明，高Hcy與AD高風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)，而較高的葉酸攝入量可以降低老年人的AD風(fēng)險(xiǎn)。葉酸缺乏導(dǎo)致的SAM缺乏以及Hcy升高，使甲基化水平下降；并且，Hcy影響SAM和SAH水平，后兩者可調(diào)節(jié)DNA甲基化活性以及蛋白翻譯后修飾。另外，研究還發(fā)現(xiàn)Hcy可通過抑制甲基化，降低PP2A甲基化程度，從而導(dǎo)致Tau蛋白過磷酸化、NFT及SP形成。因此，最關(guān)鍵機(jī)制即：葉酸/同型半胱氨酸代謝異常導(dǎo)致AD相關(guān)基因啟動子的表觀遺傳修飾（CpG區(qū)域甲基化狀態(tài)的改變)，使基因沉默（高甲基化）或過度表達(dá)（低甲基化)，最終發(fā)生AD。
4表觀遺傳學(xué)在AD診療中的應(yīng)用研究
近年來，隨著表觀遺傳學(xué)在AD研究中的不斷進(jìn)步，研究者已逐漸將其應(yīng)用于AD的診斷及治療中，盡管多數(shù)還處于臨床前試驗(yàn)階段，但表觀遺傳學(xué)應(yīng)用于AD臨床的前景是樂觀并值得期待的。
4.1表觀遺傳學(xué)診斷手段
利用亞硫酸氫鈉進(jìn)行甲基化測序是檢測DNA甲基化的金標(biāo)準(zhǔn)。該方法利用鹽析法從血液中提取基因組DNA,經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理后，變性DNA中胞嘧啶轉(zhuǎn)換為尿嘧啶，而5-mC則不發(fā)生轉(zhuǎn)換，因此在經(jīng)過PCR擴(kuò)增和DNA測序后，胸腺嘧啶則代表非甲基化胞嘧啶，而5-mC(主要為CpG二核苷酸）仍為胞嘧啶。繼而由該方法延伸出多個(gè)DNA甲基化分析法，例如：甲基化特異性PCR(methylationspecificPCR,MSP)、結(jié)合亞硫酸氫鹽限制性分析（combinedbisulfiterestrictionanalysis,COBRA)以及甲基敏感性單核苷酸引物(methylation-sensitivesinglenucleotideprimerextension,MS-SNuPE)等。然而，由于目前對AD相關(guān)基因甲基化的研究還不完善，只能在臨床前研究中應(yīng)用甲基化測序，用于對比分析AD中基因甲基化的真實(shí)狀態(tài)。
實(shí)時(shí)基因成像（real-timegeneticimaging)技術(shù)是另一種判斷基因表觀遺傳修飾的手段；該技術(shù)避免了尸檢或動物研究，是一種新型的非侵入性的可視化基因調(diào)控檢測。磁共振波譜（MRspectroscopy,MRS)即是這樣一種特殊的磁共振成像，該技術(shù)可掃描到特定的蛋白，將來可使我們能夠?qū)崿F(xiàn)對基因表達(dá)變化的可視化實(shí)時(shí)檢測，理論上而言可以追蹤到DNA甲基化或組蛋白修飾的責(zé)任蛋白；因此，在一定程度上，將為AD的表觀遺傳學(xué)診斷和治療提供新的手段[39]。
此外，另有研究發(fā)現(xiàn)，脂肪酸酰胺水解酶（fattyacidamidehydrolase,FAAH)參與了AD的發(fā)病，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)FAAH易于從外周血中檢出，并可作為一個(gè)新的潛在的AD生物標(biāo)志物（biomarker),繼而用于AD的預(yù)測或診斷。然而，由于一些AD相關(guān)蛋白或酶類在外周血中易降解，穩(wěn)定的miRNA檢測已成為反映疾病的重要手段。由于大多數(shù)AD患者外周血單核細(xì)胞中存在各種miRNA的表達(dá)上調(diào)（如miR-371、miR-517等),且與其在AD腦中高表達(dá)相對應(yīng)，提示通過測定血漿及血單核細(xì)胞的miRNA譜變化,可作為AD診斷和病情評估的重要方法。
4.2AD的表觀遺傳學(xué)治療
表觀遺傳學(xué)對研究AD的發(fā)病機(jī)制和病程轉(zhuǎn)歸,以及研發(fā)新的藥物等方面開拓了廣闊的空間。表觀遺傳學(xué)藥物進(jìn)入體內(nèi)后，可充當(dāng)基因轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的“開關(guān)”，通過不同的基因修飾及調(diào)控基因表觀修飾相關(guān)酶類的活性，繼而達(dá)到在未改變DNA序列的情況下影響基因表型。因此，正是表觀遺傳學(xué)改變的“可逆性”，使與之相關(guān)藥物的研發(fā)成為AD治療研究的新方向和重點(diǎn)。
4.2.1HDACIs近年來，科學(xué)家們研發(fā)了多種新的HDACIs。根據(jù)化學(xué)形態(tài)主要分為4類：①短鏈脂肪酸類：如丁酸鈉、苯丁酸鹽和丙戊酸（valproicacid,VPA);②異輕肟酸（hydroxamicacid)類：如曲古抑菌素A(trichostatinA,TSA)、辛二酰苯胺異輕肟酸(suberoylanilidehydroxamicacid,SAHA);③環(huán)氧酮類：如trapoxinA和trapoxinB;④苯甲酰胺類：如MS-275。這些HDACIs與鋅依賴性HDAC蛋白（zinc-dependentHDACprotein,I、II及IV類組蛋白亞型）相互作用；煙酰胺作為NAD+前體，可以抑制III類HDAC蛋白。其中，研究最廣泛的是丁酸鈉、苯丁酸鹽、VPA、TSA和SAHA。
目前FDA批準(zhǔn)上市的是SAHA,-種治療T細(xì)胞淋巴瘤的新型化合物，不僅可增加組蛋白乙酰化水平，同時(shí)還可提高認(rèn)知。在神經(jīng)系統(tǒng)中，VPA具有抗驚厥和穩(wěn)定情緒的作用，因此這些作用可能與引起組蛋白乙?；淖冇嘘P(guān)；VPA還可以通過抑制GSK-3#介導(dǎo)的y-分泌酶裂解APP,從而抑制Ap的產(chǎn)生，減少A斑塊，最終緩解AD模型鼠的認(rèn)知功能障礙。Ricobaraza等研究顯示，4-苯基丁酸乙酯（PBA)可通過降低GSD-3#來降低AD大鼠腦內(nèi)Tau蛋白磷酸化，并可清除突觸間A沉積，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，從而恢復(fù)記憶并逆轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)障礙。而煙酰胺則可選擇性降低Tau蛋白磷酸化并增加乙?；腶微管蛋白。Fischer等也研究發(fā)現(xiàn)，非特異性HDACIs如VPA、TSA、4-苯基丁酸鈉及伏立諾他等，都可以通過不同的表觀遺傳機(jī)制影響Ap沉積和Tau蛋白過磷酸化，并可改善學(xué)習(xí)和記憶力。另外,HDACi丙戊酸可以降低APP的表達(dá)，減輕大腦中的A肽斑塊負(fù)擔(dān)；研究還證實(shí)，HDACI治療還可誘導(dǎo)樹突發(fā)芽，增加突觸數(shù)量，以及恢復(fù)學(xué)習(xí)行為和形成長期記憶。Zhang等報(bào)道，口服HDACIMS-275可改善神經(jīng)炎癥和腦淀粉樣變，以及改善AD模型動物的行為能力。這些研究提示,HDACIs可通過調(diào)節(jié)HDAC蛋白活性和Tau蛋白磷酸化水平，從而用于AD的治療.
HDACIs可選擇性抑制HDACs,導(dǎo)致組蛋白乙?；缴?，恢復(fù)AD模型動物中組蛋白乙?；郊疤岣邔W(xué)習(xí)和記憶能力。例如：Guan等發(fā)現(xiàn)當(dāng)腦內(nèi)HDAC2過表達(dá)時(shí)，小鼠海馬神經(jīng)元樹突棘密度降低、突觸形成減少、CA1區(qū)LTP形成障礙、空間記憶和工作記憶損傷；而使用HDACIs則能夠促進(jìn)小鼠神經(jīng)元樹突棘和突觸的形成，改善AD模型小鼠的學(xué)習(xí)和記憶減退狀態(tài)。因此，HDAC2可能是HDACIs最適宜的治療靶點(diǎn)之一，可能使腦神經(jīng)元內(nèi)合成新的蛋白以改善或恢復(fù)AD患者記憶。除此之外,HDACIs對基因表達(dá)的調(diào)節(jié)具有特異效應(yīng),可以在上調(diào)靶基因表達(dá)的同時(shí)下調(diào)其他基因;這種基因特異性常通過轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)控，后者可以識別特定啟動子和增強(qiáng)子序列，并賦予靶基因特異性（gene-specificeffects),使之對HDACIs具有敏感性[44],繼而逆轉(zhuǎn)表觀遺傳改變。同時(shí)，應(yīng)用HDACIs治療AD還應(yīng)當(dāng)考慮其是否可穿透血腦屏障，因此，最近的一項(xiàng)研究研發(fā)了一種可進(jìn)入CNS(“CNS-penetrant”)的HDACIs(I類）EVP-0334,目前已進(jìn)入I期臨床試驗(yàn)用于AD治療。
眾所周知，AD大腦受累的主要區(qū)域?yàn)閮?nèi)側(cè)嗅皮質(zhì)、海馬及杏仁核等。研究發(fā)現(xiàn)，與正常腦組織相比,AD患者皮質(zhì)中HDAC6蛋白水平升高了52%,而海馬中則升高了92%。HDAC6與Tau蛋白共同存在于核周，并發(fā)生相互作用；其中HDAC6具有獨(dú)立的微管蛋白脫乙酰基酶的活性。使用HDAC6抑制劑Tubacin治療或敲除HDAC6,并不能影響HDAC6與Tau蛋白的相互作用，但可以減少Tau蛋白磷酸化[55]。通過結(jié)合HDAC6,Tau蛋白可抑制脫乙酰酶活性,從而導(dǎo)致微管蛋白乙?；黾?；在Tau蛋白過表達(dá)的細(xì)胞中也可見這種增加；說明過量的Tau蛋白成為HDAC6的抑制劑，然而AD患者中正常Tau蛋白是減少的。文獻(xiàn)顯示，HDAC6的減少或丟失可改善聯(lián)想和空間記憶形成[56,57],以及阻斷A誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元線粒體運(yùn)輸障礙。最近有研究人員還發(fā)現(xiàn),HDAC6無效突變（nullmutation)可以挽救神經(jīng)元中Tau蛋白誘導(dǎo)的微管缺陷。他們采用遺傳和藥理學(xué)方法抑制HDAC6的tubulin特異性脫乙?；富钚?，證實(shí)這種“挽救效應(yīng)”有可能是通過增進(jìn)微管乙酰化所介導(dǎo)的。這些研究結(jié)果表明,HDAC6有可能是AD和相關(guān)Tau病的一種獨(dú)特的有潛力的藥物靶點(diǎn),HDAC6抑制劑有望成為AD治療的新型藥物。
目前研究證實(shí)，HDACIs可用來治療神經(jīng)變性病、抑郁、焦慮情緒、認(rèn)知功能障礙及神經(jīng)發(fā)育障礙,因此為AD的治療提供廣闊的前景。但現(xiàn)有的HDACIs存在生物利用度低、代謝快、低選擇性等缺點(diǎn)。因此,研究開發(fā)結(jié)構(gòu)新穎、副作用小、特異性及選擇性高的HDACI具有重要的臨床意義。
4.2.2飲食因素除此之外，飲食因素，例如葉酸、維生素B2、B6、B12、蛋氨酸、膽堿等都可以影響甲基供體SAM的形成，并影響DNMTs活性；同時(shí)，一些天然化合物，如異黃酮、黃酮、兒茶素、姜黃素、白藜蘆醇等，可以改變表觀遺傳學(xué)機(jī)制,影響染色質(zhì)修飾酶的活性，因此備受關(guān)注。
研究證實(shí)，傳統(tǒng)用于抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗細(xì)胞凋亡及預(yù)防高脂血癥的姜黃素，也可用于治療AD：在體外實(shí)驗(yàn)中，姜黃素可抑制A聚集沉積、A#誘導(dǎo)的炎癥、戶分泌酶及乙酰膽堿酯酶的活性；而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)則證實(shí)，口服姜黃素可抑制AD動物腦組織中Ap沉積、Ap寡聚化及Tau蛋白磷酸化，并改善行為及認(rèn)知。另有研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素還可加速淀粉樣斑塊的分解，繼而改善AD的空間記憶障礙。據(jù)Bora-Tatar等[65]報(bào)道，在33種羧酸衍生物中，姜黃素是最有效的HDAC抑制劑，甚至比丙戊酸和丁酸鈉更強(qiáng)效；另有研究也發(fā)現(xiàn)，姜黃素可顯著降低HDAC1、3和8蛋白水平，并可提高乙?；疕4水平。同時(shí)，姜黃素還是潛在的HAT抑制劑，2004年Balasubramanyam等[66]發(fā)現(xiàn)，姜黃素是p300/CREB結(jié)合蛋白HAT活性特異性抑制劑，對維持一定的CREB水平起到關(guān)鍵作用。因此，姜黃素對HDAC和HAT均有調(diào)節(jié)作用；作為已知的抗氧化劑，姜黃素可能是通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激，從而對乙?；腿ヒ阴；哂须p重調(diào)節(jié)作用。
AD表觀遺傳學(xué)改變受環(huán)境、營養(yǎng)因素等諸多因素共同作用，因此自孕前保健開始,直至子代的一生，都保持機(jī)體內(nèi)外生存環(huán)境的良好，保證表觀遺傳學(xué)正常修飾及表達(dá),在一定程度上可能會預(yù)防AD的發(fā)生。同時(shí)，由于目前糖尿病、肥胖、心血管疾病、高血壓等都是公認(rèn)的AD高危因素，通過表觀遺傳學(xué)機(jī)制防治這些疾病，也是降低AD的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的重要手段。另外，提倡低熱量、低膽固醇和富含葉酸、B族維生素及姜黃素等的飲食，以及降低血漿Hcy值，可能對保護(hù)大腦神經(jīng)元，改善老年期認(rèn)知，以及預(yù)防AD發(fā)生或逆轉(zhuǎn)AD的表觀遺傳改變，起到一定的積極作用。
4.2.3其他因素由于DNA甲基化是可逆的，該過程的相關(guān)酶類也可作為AD治療的研究靶點(diǎn),例如DNMT抑制劑。然而，目前對DNMT抑制劑的研究多局限于腫瘤的治療，因此對于AD的治療作用還有待進(jìn)一步研究。另外，研究發(fā)現(xiàn)AD中與APP裂解機(jī)制相關(guān)的多個(gè)miRNA也發(fā)生了改變,因此針對miRNA的AD表觀遺傳治療成為重要研究方向。2006年，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所裴鋼院士研究組研究發(fā)現(xiàn)，腎上腺素受體被激活后，可以增強(qiáng)y-分泌酶的活性，進(jìn)而能夠增加AD中Ap的產(chǎn)生。這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)揭示了AD致病的新機(jī)制，提示腎上腺素受體有可能成為研發(fā)AD治療藥物的新靶點(diǎn)。
5展望
綜上所述，在AD中，表觀遺傳學(xué)機(jī)制對疾病發(fā)生發(fā)展起到了關(guān)鍵作用，尤其是散發(fā)性AD。表觀遺[8]傳學(xué)調(diào)節(jié)障礙導(dǎo)致相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄異常，引起關(guān)鍵蛋白或酶類異常，繼而發(fā)生一系列病理生理改變，是AD發(fā)病的主要原因。表觀遺傳學(xué)改變可以通過表觀遺傳藥物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)，因而這不僅為AD的治療開創(chuàng)了一片新天地，更引導(dǎo)醫(yī)藥行業(yè)進(jìn)入了一個(gè)嶄新的領(lǐng)域。
然而,使用表觀遺傳學(xué)藥物治療疾病也面臨著一系列難題。對于目前可用的表觀遺傳學(xué)化合物如HDACIs及辣椒素等而言，主要的困難即缺乏針對不同腦區(qū)、不同神經(jīng)元亞型或特異基因的“選擇性”。
第5篇：重復(fù)的遺傳學(xué)效應(yīng)范文
遺傳病以及和遺傳有密切關(guān)系的常見病、多發(fā)病，如高血壓、糖尿病、精神發(fā)育不全、癌癥等已成為人類健康和生命的主要威脅。這些疾病也會發(fā)生流行，但它們的流行方式，流行因素和傳染病等的流行有很大不同。對這些新問題的探索就是遺傳病流行病學(xué)的探究內(nèi)容。
遺傳病流行病學(xué)是人類群體遺傳學(xué)的一個(gè)新分支，它是在人類群體遺傳學(xué)和流行病學(xué)的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的。它探索的是和遺傳有關(guān)的疾病的流行規(guī)律。它已經(jīng)而且還將進(jìn)一步闡明單基因遺傳病和染色體病的傳遞規(guī)律和發(fā)病原因，這是優(yōu)生學(xué)的重要依據(jù)之一。它目前的主要任務(wù)在于探索復(fù)雜性遺傳疾?。òǜ哐獕?、糖尿病、精神失常和腫瘤）的遺傳原因和環(huán)境因子，還可尋找其在中老年發(fā)病的復(fù)雜疾病的時(shí)態(tài)特征。
1遺傳病的流行方式
遺傳病分為單基因遺傳病、多基因遺傳病和染色體遺傳病3大類。不同類型的遺傳病在家系或由家系組成的群體中表現(xiàn)出各自不同的傳遞方式，此外某些遺傳病的發(fā)生，還需環(huán)境定因子的誘發(fā)。遺傳病是遵循一定的規(guī)律或條件而發(fā)生流行的。
1.1單基因病的流行方式
1.1.1常染色體顯性遺傳?。ˋD）其流行特征是摘要:（1）患者的雙親中，往往只有1個(gè)患病，且大多數(shù)是雜合子;（2）患者的同胞中，發(fā)病患者的數(shù)量約占1/2，且男女發(fā)病機(jī)會均等;（3）系譜中，連續(xù)幾代都可看到發(fā)病的患者，但是，有時(shí)由于內(nèi)、外環(huán)境的改變，致病基因的功能不一定表現(xiàn)（外顯不全）。
1.1.2常染色體隱性遺傳病（AR）其流行特征是摘要:（1）患者的雙親往往都是無病的，但他們都是攜帶者;（2）患者的同胞中，發(fā)病患者的數(shù)量約占1/4，且男女發(fā)病的機(jī)會均等;（3）系譜中看不到連續(xù)幾代的常染色體隱性遺傳病，往往表現(xiàn)為散發(fā);（4）隱性基因的頻率很低，為0.01～0.001。因此一個(gè)攜帶者或患者隨機(jī)地和群體中一個(gè)成員結(jié)婚時(shí)，生出患兒的機(jī)會很小;但是若實(shí)行近親結(jié)婚，則比例就會大大提高。
1.1.3X連鎖隱性遺傳病其流行特征是摘要:（1）人群中男性患者遠(yuǎn)多于女性患者，家系中往往只有男性患者;（2）雙親都無病時(shí)，兒子可能發(fā)病，女兒則不會發(fā)病，兒子假如發(fā)病，其致病基因是從攜帶者的母親傳來;（3）由于交叉遺傳，男性患者的兄弟、外祖父、舅父、姨表兄弟、外甥、外孫等可能是發(fā)病的患者，其他的親屬不可能是患者。
1.1.4X連鎖顯性遺傳病其特征是摘要:（1）此病代代相傳，故患者的雙親一般有1人是本病患者;（2）致病的顯性基因位于X染色體上，所以，女性患者和正常男性婚配所生子女中，女兒和兒子發(fā)病的機(jī)會都為1/2，男性患者和正常女性婚配，女兒全部發(fā)病，兒子都正常;（3）女性患者多于男性患者，但癥狀上男重于女;（4）連續(xù)幾代相傳。
1.1.5Y連鎖遺傳病其特征是摘要:父子、兄弟、祖孫、遠(yuǎn)祖遠(yuǎn)孫、叔侄、堂兄弟、遠(yuǎn)房叔侄或兄弟的相關(guān)都是1，而祖母孫、母子、外祖外孫、舅甥和兄妹的相關(guān)都是零。當(dāng)在Y染色體上存在致病基因時(shí)，從優(yōu)生角度考慮，此類家系應(yīng)只生女孩，這樣就杜絕了該有害基因在家系中的蔓延。
1.2染色體病的流行方式
1.2.1染色體數(shù)目異常導(dǎo)致的遺傳?。?）性染色體數(shù)異常摘要:如45，X;47，XXX;47，XXY;47，XYY等。對于45，X的由來尚未弄清，也就是XO核型的遺傳病流行學(xué)有待探索。47，XXY即為小癥，其母親生育年齡過大或許是一個(gè)因素，是該病流行的一個(gè)原因。（2）常染色體數(shù)目異常摘要:包括十幾種綜合征，在此僅舉幾例，從中我們可以窺見它們在遺傳病流行學(xué)上的意義。①先天愚型摘要:患兒的核型有以下幾型摘要:21-三體型摘要:母親年齡過大是本病一個(gè)重要的流行因素，21-三體型先天愚型偶有能生育的，后代中約有1/2將發(fā)育成先天愚型兒，這是21-三體型先天愚型遺傳流行的一個(gè)特征。嵌合型摘要:有的細(xì)胞核型正常，有的細(xì)胞核型為21-3體型。易位型摘要:其中較常見的有D/G易位，也就是14/21易位，患兒母親核型常為D/G的平衡易位攜帶者，經(jīng)常有自然流產(chǎn)史，所生小兒中約有1/3為先天愚型患兒，1/3為平衡易位攜帶者。G/G型易位，即21/22易位，頻率比D/G易位低，這種易位型核型的產(chǎn)生，基本上也可經(jīng)突變或遺傳而來，和D/G易位型者基本相同。②18-三體綜合征摘要:這種病也較為常見，新生兒中發(fā)病率為1/4500，即0.02%。③13-三體綜合征摘要:這種病少見，新生兒中發(fā)病率為1/25000，即0.004%。
此外，尚發(fā)現(xiàn)過22-三體綜合征等。常染色體三體綜合征除21-三體征外，對其遺傳病流行病學(xué)特征還很少探究，原因是病例罕見，患兒受到嚴(yán)重影響，經(jīng)常過早夭折，因此難以進(jìn)一步觀察。
1.2.2染色體結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致的遺傳病染色體結(jié)構(gòu)異常分為缺失、重復(fù)、倒位、易位、環(huán)形染色體和等臂染色體等。平衡易位除了能從祖代往下代傳遞外，可能還是造成重復(fù)和缺失的原因之一。除平衡易位外，其他類型染色體結(jié)構(gòu)變異對個(gè)體的影響則較大，經(jīng)常引起流產(chǎn)等現(xiàn)象。據(jù)報(bào)道，有自然流產(chǎn)史、死產(chǎn)史或有畸形生產(chǎn)史的夫婦（一般僅其中之一有畸變），染色單體畸變（包括斷裂、碎片）和染色體畸變（包括斷片、雙著絲粒染色體、微小體等）數(shù)均較對照顯著為高，可見有染色體結(jié)構(gòu)畸變的雙親在遺傳病流行中有著相當(dāng)重要的意義。
1.3多基因病的流行方式在多基因遺傳病中，當(dāng)一對夫婦生出了第2個(gè)該病患兒，表明他們帶有更多的和易患性有關(guān)的基因，其一級親屬患該病的風(fēng)險(xiǎn)將會增加。病情嚴(yán)重的患者，其一級親屬的患病風(fēng)險(xiǎn)性比病情輕的要高。當(dāng)一種多基因遺傳病的一般群體發(fā)病率有性別差異時(shí)，發(fā)病率低的某一性別患者的一級親屬發(fā)病率高。假如已發(fā)病，其一級親屬的發(fā)病率將比發(fā)病率高的另一性別患者的一級親屬為高。
2影響遺傳病流行的幾個(gè)因素
2.1突變突變造成的最大危害性是使群體的遺傳負(fù)荷增加。除少數(shù)突變外，對生物自身來說，大多數(shù)突變都是有害的。由于突變造成某些性狀使個(gè)體在成熟前過早夭折，某些性狀降低了結(jié)婚的機(jī)會，以及另一些性狀使個(gè)體的平均產(chǎn)子數(shù)較群體為低。由此，突變產(chǎn)生的不正常基因比正常個(gè)體傳給后代的機(jī)會要小，致使代代相傳時(shí)突變基因的頻率降低。突變新問題使人類處于非常危險(xiǎn)的境地，之所以如此，還有一個(gè)原因，就是環(huán)境的污染、生態(tài)平衡的破壞，致使人類基因突變率有增無減。
2.2隔離隔離的后果使遺傳病的發(fā)病率顯著提高，原因是隔離有類似于近親婚配的效應(yīng)。由于隔離，使純合子的比例增加，而使雜合子的比例下降。假如在隔離人群內(nèi)不實(shí)行隨機(jī)婚配而實(shí)行近親婚配，則遺傳后果更為嚴(yán)重，實(shí)行近親婚配隔離人群內(nèi)的多種遺傳病尤其是智力低下極為普遍。
2.3遷移遷移帶來種群的混雜，遷移使大群體中的基因流向隔離群，從而打破了隔離的屏障，對抗隔離的有害影響。因此，遷移和混雜具有優(yōu)生的功能。
第6篇：重復(fù)的遺傳學(xué)效應(yīng)范文
基因多態(tài)性是指基因的某些位點(diǎn)可以發(fā)生中性改變，使DNA 的一級結(jié)構(gòu)各不相同，但并不影響基因的表達(dá)，形成多態(tài)?；虻亩鄳B(tài)性可以看作是在分子水平上的個(gè)體區(qū)別的遺傳標(biāo)志，有很多表現(xiàn)的方式：最常見的是單核苷酸多態(tài)性（SNP），還有短片段重復(fù)序列、插入和缺失多態(tài)性等。與稀有和高外顯率的致病性突變不同，SNP 廣泛存在于人群中，是廣義上基因點(diǎn)突變，其發(fā)生率在1%以上。易感基因的特點(diǎn)是基因變異本身，并不直接導(dǎo)致疾病的發(fā)生，而只造成集體患病的潛在危險(xiǎn)性增加，一旦外界有因素介入，即可導(dǎo)致疾病發(fā)生。多基因病屬高發(fā)疾病，嚴(yán)重影響著人類的健康。常見的多基因病及其誘發(fā)基因：
其一，精神分裂癥。精神分裂癥是一種嚴(yán)重的精神疾病，全世界約有1%的人患有這種疾病。表現(xiàn)為患者認(rèn)知能力的障礙和大腦異常。目前認(rèn)為，精神分裂癥是一種多基因遺傳病。經(jīng)典的連鎖分析和候選基因關(guān)聯(lián)分析及最近的全基因組掃描，發(fā)現(xiàn)可能的精神分裂癥易感基因主要包括：COMT，NRGI，DTNBP1，DISCI，G72，DAAO，RGS4 等；對患者死后腦組織的分子水平研究也發(fā)現(xiàn)一些易感基因：DLX1，REELIN，SEMAPHORIN3A 等。通過對精神分裂癥患者和正常人的腦容量比較發(fā)現(xiàn)，精神分裂癥患者的腦容量較小。一些研究中也發(fā)現(xiàn)，與大腦容量相關(guān)的易感基因GULP1 與精神分裂癥也相關(guān)，人的GULP1 基因位于2 號染色體上。研究表明，GULP1 基因的兩個(gè)單核苷酸多肽位點(diǎn)（SNP）rs2004888 和rs4522565 都顯著的與精神分裂癥有關(guān)。
其二，心血管疾病。冠狀動脈硬化性心臟?。ê喎Q冠心?。┦怯蛇z傳和環(huán)境因素共同所致的復(fù)雜疾病，許多研究表明血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）基因、血管緊張素原（AGT）基因及內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因多態(tài)性與基因型表達(dá)的冠心病相關(guān)。急性心肌梗死（AMI）也被證明是與環(huán)境相關(guān)的多基因病，其家族史被認(rèn)為是一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素。隨著近年來對基因組學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，確定了一系列的AMI易感基因及相關(guān)單核苷酸多肽（SNP）位點(diǎn)。
除上述致冠心病的易感基因外，還包括與男性AMI 相關(guān)的CX37 基因的C1019T 及AT1R 基因A1166C。原發(fā)性高血壓（EHT）也是由遺傳易感性和環(huán)境因素共同決定的疾病， 研究表明，AGT235M，ACEALUD 和ApoBXall 被證明與中國漢族人群原發(fā)性高血壓有關(guān)。
其三，唇腭裂。唇腭裂是一種常見的先天畸形，發(fā)生率為0.1豫耀0.2豫。在不同人群中有15%耀20%的家族史，因此遺傳因素被認(rèn)為在唇腭裂的病因?qū)W中占重要地位。不同的人特定區(qū)域如1q，2p，4p，6p，14q，17q，19q 均發(fā)現(xiàn)與唇腭裂的發(fā)病相關(guān)的基因位點(diǎn)。在我國，非綜合征型唇腭裂發(fā)病率較高。非綜合征型唇裂伴或不伴腭裂指不伴發(fā)其它系統(tǒng)畸形的不屬于任何綜合征的唇裂、唇裂合并腭裂的總稱，這是一種常見的頜面部先天畸形。已確定的非綜合征型唇腭裂易感基因包括：定位于1p36.3，編碼5，10原亞甲基四氫葉酸還原酶基因MTH-FR；定位于2p13，編碼多肽類生長因子的基因TG原F琢；定位于1q32原1q41，編碼蛋白質(zhì)與DNA 結(jié)合域的干擾素調(diào)節(jié)因子IRF6；定位于4p16 的同源異型盒基因MSX1；定位于11q23 的脊髓灰質(zhì)炎受體相關(guān)基因PVRL1 等。
其四，瘢痕疙瘩家系。瘢痕疙瘩是人類特有的一種創(chuàng)傷后病理性瘢痕愈合現(xiàn)象，其發(fā)病的主要因素，其遺傳模式為常染色體顯性遺傳伴外顯不完全，且瘢痕疙瘩的發(fā)病存在顯著的種族差異。對日本家系和非洲裔美國人家系的易感基因定位研究，確定其易感基因位點(diǎn)分別與染色體2q23 和7p11存在連鎖關(guān)系。
第7篇：重復(fù)的遺傳學(xué)效應(yīng)范文
論文關(guān)鍵詞：小麥，EST-SSR分子標(biāo)記，可轉(zhuǎn)移性，禾本科能源植物
能源問題是21世紀(jì)人類面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)之一[1]。隨著社會與經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，中國對能源的需求將會不斷增加。植物能源是地球貯藏太陽能的一種形式，也是化石能源形成的前體，在太陽能、核能的大規(guī)模應(yīng)用開發(fā)之前，植物能源是從化石能源到太陽能過渡期間的、能夠進(jìn)行大規(guī)模開發(fā)利用的可再生資源之一。生物燃料屬于植物能源，是以生物質(zhì)為載體的能源，直接或間接地來源于植物的光合作用。地球上的植物通過光合作用每年生產(chǎn)的生物燃料量，相當(dāng)于目前人類每年消耗礦物能的20倍。因此，生物燃料的開發(fā)生物論文，將是人類利用可再生能源的主要途徑[2]。
高大禾本科植物是最易獲得、生產(chǎn)力高、儲量豐富的木質(zhì)纖維生物質(zhì)之一，作為轉(zhuǎn)化燃料乙醇的原料潛力巨大。以“能源草”作為生物質(zhì)能源的原材料成本低、效率高，不占用耕地，可利用山坡邊際土地，兼具水土保持的功效論文參考文獻(xiàn)格式。燃燒后產(chǎn)生的污染物也很少，可有效減輕溫室效應(yīng)、降低環(huán)境污染。因此開發(fā)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的禾本科能源植物已經(jīng)成為當(dāng)前生物質(zhì)能研究的一個(gè)熱點(diǎn)[3]。
斑茅(Saccharum arundinaceum)又名大密、笆茅、大巴茅，是甘蔗屬多年生、密叢高大草本，稈直立，高可達(dá)4米以上，莖達(dá)2厘米，具有分蘗力強(qiáng)、根系發(fā)達(dá)、抗旱性強(qiáng)等特性[3]。中國芒（Miscanthus sinensis）、五節(jié)芒（Miscanthus floridulus）均為禾本科芒屬植物，具有生長迅速、適應(yīng)性強(qiáng)，種植成本低、利用率高等多種優(yōu)勢。目前，歐美多國已開始大面積種植芒屬植物并大規(guī)模研究其作為能源作物的開發(fā)利用價(jià)值[2,4,5]。南荻（Triarrhena lutarioriparia Liu)是原產(chǎn)我國長江流域、伴生于蘆葦叢中的高大草本植物，植物學(xué)分類歸屬禾本科荻屬，具有水土保持、固堤防洪、凈化水體和空氣、維護(hù)自然生態(tài)系統(tǒng)等作用[6]。河八王(Saccharum arundinaceum)為甘蔗的雜交親本[7]，菅（Themeda villosa）及香根草（Vetiveriazizanioides）也曾作為水土保持及優(yōu)良薪炭草種[8]。然而，這些禾本科植物均處于野生狀態(tài)，遺傳學(xué)研究報(bào)道極少生物論文，基因組資源極其匱乏，限制了該類植物的遺傳改良。因此，借助現(xiàn)代分子遺傳與育種學(xué)方法對其進(jìn)行研究改良，培育適宜于大規(guī)模生產(chǎn)栽培的能源植物新品種，對于促進(jìn)這些野生戰(zhàn)略資源植物的開發(fā)利用，服務(wù)于國家經(jīng)濟(jì)建設(shè)具有重要意義。
SSR(Simple Sequence Repeats)即簡單重復(fù)序列，又稱微衛(wèi)星(Microsatellites)DNA，是一種由1-6個(gè)核苷酸為重復(fù)單位組成的串聯(lián)重復(fù)序列，同一類微衛(wèi)星DNA分布在基因組的不同位置上，由于SSR重復(fù)次數(shù)的不同，而形成SSR座位的多態(tài)性[9]。EST-SSR來源于表達(dá)的基因片段，作為功能基因的一部分，具有很高的保守性，且可直接用于基因組作圖和基因發(fā)掘，尤其可以用于比較基因組學(xué)研究[10]。SSR分子標(biāo)記被證明是現(xiàn)今最可靠實(shí)用的DNA分子標(biāo)記之一，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物的基因組學(xué)和遺傳育種學(xué)研究。但是，根據(jù)傳統(tǒng)方法,開發(fā)新的SSR分子標(biāo)記費(fèi)時(shí)費(fèi)力且價(jià)格昂貴[11]。目前，SSR標(biāo)記的通用性已被不少研究者證明，如Garcia-Moreno等人研究了向日葵SSR標(biāo)記對紅花的可轉(zhuǎn)移性[12]生物論文，Rallo等人研究了橄欖SSR標(biāo)記對洋橄欖的可轉(zhuǎn)移性[13]，Wang等人研究了紅豆SSR引物對綠豆的可轉(zhuǎn)移性[14]。
因此，借助與這幾類草本植物親緣關(guān)系較近、基因組學(xué)研究相對較為深入的、同屬禾本科的小麥EST-SSR引物序列，開發(fā)可用于中國芒等野生能源植物的SSR分子標(biāo)記，將大大地降低開發(fā)成本、提高實(shí)驗(yàn)效率。本研究旨在探測小麥EST-SSR引物對這幾種有潛力禾本科能源植物的可轉(zhuǎn)移性，開發(fā)出可靠的SSR分子標(biāo)記，為這些能源植物的遺傳育種研究奠定基礎(chǔ)論文參考文獻(xiàn)格式。
1材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)材料
1.1.1 植物樣品
植物樣品選用了中國科學(xué)院武漢植物園采集保存的、均屬禾本科的7種多年生草本植物。其中斑茅為甘蔗屬，中國芒和五節(jié)芒為芒屬，河八王為河八王屬，南荻為荻屬，菅為菅屬，香根草為金須茅屬植物（表1）。于10月上旬采樣，采集新鮮幼嫩葉片約2g，放入裝有50g無水硅膠的密封袋中瞬時(shí)干燥，隨后放入-20℃冰箱保存。另外，設(shè)置小麥品種中國春（CS）作為SSR擴(kuò)增對照。
表1 供試的禾本科植物
編號
Code
名種
Species
拉丁名
Latin name
染色體數(shù)
Chromosome number
染色體倍數(shù)
Chromosome ploidy
A
斑茅
Saccharum arundinaceum
60
2X
B
中國芒
Miscanthus sinensis
38
2X
C
五節(jié)芒
Miscanthus floridulus
38
2X
D
河八王
Narenga porphyrocoma
30
2X
E
南荻
Triarrhena lutarioriparia
38
2X
F
菅
Themeda villosa
20
2X
G
香根草
Vetiveria zizanioides
20
2X
CS
小麥
Triticum aestivum
第8篇：重復(fù)的遺傳學(xué)效應(yīng)范文
[關(guān)鍵詞] 金釵石斛； DALP； 遺傳多樣性
[收稿日期] 2013-03-14
[通信作者] 虞泓，教授，Tel：（0871） 65034655，F(xiàn)ax：（0871） 68182565，E-mail：，
金釵石斛Dendrobium nobile Lindl多年生草本，為蘭科Orchidaceae石斛屬Dendrobium Sw植物。生于海拔500～1 700 m的山坡林中樹上或路邊巖石上。主要分布于云南、貴州、四川、湖北、廣西、廣東，海南島和臺灣等地[1-2]。金釵石斛為常用珍貴中藥，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中列為上品，具有滋陰清熱，生津益胃，潤肺止咳，明目強(qiáng)身等功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，石斛還具有抗腫瘤，抗衰老，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，擴(kuò)張血管及抗血小板凝集等作用[3-5]。在我國藥典收載的5種石斛中，金釵石斛生物堿含量最高[6]。同時(shí)石斛在國際花卉市場上占有重要地位，具有很高的商業(yè)價(jià)值[7]。
Direct amplification of length polymorphisms （DALP）以通用測序引物M13為核心序列，在此基礎(chǔ)上任意添加少數(shù)堿基形成引物，對樣品基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到相應(yīng)的DNA指紋[8]。相比RAPD等分子標(biāo)記，DALP包含了更多的信息量，有更高的可重復(fù)性和穩(wěn)定性，是揭示生物居群遺傳多樣性及其遺傳結(jié)構(gòu)快速、有效、重復(fù)性好的可靠方法，適合于檢測居群間和居群內(nèi)的遺傳變異[9]。DALP分子標(biāo)記在物種鑒定、遺傳多樣性分析、系統(tǒng)與進(jìn)化等研究得到廣泛應(yīng)用，可用來判斷植物類群的分類地位、習(xí)性、系統(tǒng)、種子擴(kuò)散機(jī)制、分布地區(qū)和演替階段，對居群遺傳分化程度的影響；近些年還被廣泛應(yīng)用于中草藥植物遺傳分析和藥材鑒定，尋找中藥材品種之間的遺傳差異性[10-16]。
近年來，由于長期過度的開發(fā)，金釵石斛生境破壞和退化，加之生長緩慢等原因，金釵石斛也逐漸變?yōu)橄∩?。本研究試圖利用DALP標(biāo)記，對云南金釵石斛居群進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化分析，為金釵石斛種質(zhì)資源的保護(hù)與可持續(xù)利用提供依據(jù)。
1 材料
金釵石斛7居群共83個(gè)個(gè)體分別采自貢山、景洪、思茅、騰沖、保山、屏邊、文山等地區(qū)。以采自騰沖的喇叭唇石斛D.Lituiflorum居群10個(gè)個(gè)體，為比較。除景洪和思茅的部分個(gè)體外，試驗(yàn)所用樣品均引種至云南昆明官渡區(qū)小哨鄉(xiāng)白漢場英茂生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室基地（海拔2 100 m）。樣品來源、編號和生境情況，見表1。
表1 金釵石斛和喇叭唇石斛居群的材料來源
Table 1 Origin of Dendrobium nobile and D.lituflorum
2 方法
2.1 金釵石斛的總DNA的提取 基因組DNA提取采用CTAB法[17]，并稍作修改。0.5 g左右的植物葉片放到研缽中，加入適量PVP和2% β-巰基乙醇迅速研磨成糊狀，然后加入4 mL預(yù)熱到65 ℃的2×CTAB（含2% β-巰基乙醇）中，65 ℃水浴1 h，冷卻，加入1/3體積5 mol?L-1的KAc冰浴1 h，4 ℃ 7 000×g離心3 min，取上清，CI（氯仿-異戊醇 24∶1）抽提2次，取上清加 3/4 體積的異丙醇，-20 ℃靜置30～60 min，12 000×g離心10 min，70%乙醇洗2次，無水乙醇洗1次。加400 μL 1×TE，室溫靜置2 h，使DNA 充分溶解，1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，用λDNA（25， 50， 100 mg?L-1）標(biāo)定，利用Kodak 1D分析軟件分析并標(biāo)定到20 mg?L-1備用。
2.2 PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系：采用20 μL反應(yīng)體系，其中模板DNA 60 ng， 2 μL 25 mmol?L-1 MgCl2，2 μL 10×Buffer， 1 μL 2.5 mmol?L-1 dNTPs （上海生工分裝），4 μL 0.5 U?μL-1Taq酶（Shanghai Promega），1 μL 5 pmol選擇性引物（上海生工合成），3 μL 5 pmol?L-1反向引物（上海生工合成）。引物序列見表2。本研究采用反向引物DALPR1分別與5個(gè)選擇性引物組合進(jìn)行DALP擴(kuò)增。
表2 DALP引物組序號與序列
Table 2 Sequences of the primer groups
擴(kuò)增程序：使用PE9700擴(kuò)增儀（美國PE公司）。95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。
產(chǎn)物檢測：擴(kuò)增產(chǎn)物在1×TBE，1.0%的瓊脂糖凝膠中電泳，溴化乙錠染色， Kodak凝膠成像系統(tǒng)照像，檢測DALP帶型，再進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染。
2.3 聚丙烯酰胺電泳 5%非變性聚丙烯酰胺凝膠（丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺29∶1），上樣量5 μL（樣品 6×上樣緩沖液 5∶1）。電泳條件 Bio-Rad垂直電泳儀（美國Bio-Rad公司） 1 000 V，150 min。
2.4 DALP銀染 本實(shí)驗(yàn)采用快速銀染法：①固定液（10%乙酸）洗脫直至溴酚蘭顏色褪去，超純水洗3次，每次不少于2 min。②染色液（0.1%的硝酸銀，0.4%的甲醛） 染色40 min；水洗2 s立即拿出。③在顯影液（3.0%碳酸鈉，顯影前加入0.4%甲醛，0.02% 10 g?L-1（硫代硫酸鈉）中顯影至帶紋清晰，固定液（10%乙酸）固定5 min，超純水洗10 min自然晾干，電泳圖見圖1。
圖1 DALP電泳式樣
Fig.1 The electrophoresis pattern of DALP
2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 利用Kodak 1D 分析軟件分析，每個(gè)樣品的擴(kuò)增帶按有或無記錄，“有”賦值為1，“無”賦值為0，得到原始數(shù)據(jù)表征矩陣，弱帶及重復(fù)性不好的條帶不予統(tǒng)計(jì)。利用PopGene32共享軟件統(tǒng)計(jì)多態(tài)條帶比率（PPB），計(jì)算擴(kuò)增產(chǎn)物的Shannon 信息指數(shù)，Nei′s 遺傳相似系數(shù)，遺傳距離（genetic distance），有效等位基因數(shù)（effective number of alleles），以及基因分化系數(shù)Gst等，同時(shí)結(jié)合Treeview軟件對得到的遺傳距離矩陣進(jìn)行非加權(quán)配對算術(shù)平均法（UPGMA）聚類分析，構(gòu)建聚類圖。
3 結(jié)果
3.1 遺傳多樣性 金釵石斛7個(gè)居群，5組DALP引物擴(kuò)增得到140條清晰條帶，平均每個(gè)引物擴(kuò)增條帶數(shù)為28，其中102條為多態(tài)條帶，多態(tài)比率為72.86%，平均每組引物擴(kuò)增所得多態(tài)條帶為20.4。7個(gè)居群的平均多態(tài)位47.96%，物種水平的多態(tài)位72.86%。其中思茅居群（NK）的多態(tài)位最高為68.57%，騰沖居群（NL）次之，為55.71%。居群的多態(tài)位在22.86%～68.57%，見表3。
在居群水平，平均觀察等位基因數(shù)Na 1.479 6，平均有效等位基因數(shù)Ne 1.323 7，平均遺傳多樣性
表3 金釵石斛居群DALP遺傳多態(tài)性
Table 3 Analysis of the genetic polymorphism of the 7 populations of Dendrobium nobile
指數(shù)H 0.186 1，平均Shannon 多樣性指數(shù)I 0.273 9；在物種水平，Na 1.728 6；Ne 1.501 1；H 0.288 9；I 0.424 2，見表4。
表4 金釵石斛居群遺傳多樣性參數(shù)
Table 4 The parameters of population genetic diversity in Dendrobium nobile
3.2 遺傳分化 總居群基因多樣度Ht 0.281 3，各居群基因分化系數(shù)Hs 0.186 1，基因分化系數(shù)Gst 0.338 6。金釵石斛7個(gè)居群中，有66.14%的遺傳變異來自居群內(nèi)，33.86%的遺傳變異來自居群間，居群間存在較高水平的遺傳分化。
3.3 遺傳關(guān)系 金釵石斛7居群和外類群喇叭石斛1居群中，貢山居群（NH）與騰沖居群（NL）之間的遺傳一致度為最大值0.955 9，遺傳距離為最小值0.045 1，這2個(gè)居群首先聚在一起，而金釵石斛各居群與外類群喇叭唇石斛NQ的遺傳一致度最小，遺傳距離最大。各居群的UPGMA聚類分析見圖2。
4 討論
4.1 金釵石斛居群間的遺傳關(guān)系 UPGMA聚類圖表明，7個(gè)居群的金釵石斛首先分別聚為3支，第1支是滇西地區(qū)的貢山居群（NH）、騰沖居群（NL）和保山居群（NN）； 第2支是滇東南地區(qū)的屏邊居群（NP）和文山居群（NX）；第3支是滇南地區(qū)的景洪居群（NM）和思茅居群（NK）。金釵石斛7個(gè)居群的遺傳距離與地理距離呈一定程度的正相關(guān)。這可能是由于較近的金釵石斛居群間基因交流發(fā)生的頻率相對較高，使之保持了較近的親緣關(guān)系。第1支滇西地區(qū)的貢山居群（NH）、騰沖居群（NL）和保山居群，與第2支滇東南地區(qū)的屏邊居群（NP）和文山居群（NX））先聚在一起，此后才與第3支滇南地區(qū)的景洪居群（NM）和思茅居群（NK）相聚。滇西地區(qū)與滇東南地區(qū)的金釵石斛居群間，有相對較近的親緣關(guān)系。這可能歸因于在云南曾發(fā)生過的特殊地質(zhì)事件[18]，但具體原因仍需結(jié)合蘭科石斛屬植物的起源與分化事件進(jìn)一步深入研究。最后，外類群喇叭唇石斛（NQ）與金釵石斛各居群的遺傳距離較遠(yuǎn)，位于UPGMA聚類圖的最外一支。
圖2 金釵石斛7個(gè)居群及喇叭唇石斛1個(gè)居群UPGMA聚類圖
Fig.2 Dendrogram of 7 populations of Dendrobium nobile and 1 population of D.lituflorum by UPGMA
4.2 金釵石斛的遺傳多樣性 DALP分析顯示，金釵石斛物種遺傳多樣性指數(shù)分別為PPB 72.86%，H 0.288 9，I 0.424 2；居群水平指數(shù)分別為，PPB 47.96%，H 0.186 1，I 0.273 9。
目前，分子標(biāo)記檢測遺傳多樣性的方法很多，如等位酶，RFLP，RAPD，AFLP，DALP等。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，同一物種采用不同的方法檢測其遺傳多樣性會得到不同的結(jié)果，這種差異是由所采用的檢測方法本身的靈敏度和其他一些因素決定的[19-20]。因此，要對一個(gè)物種的遺傳多樣性進(jìn)行評價(jià)，應(yīng)該建立在用同一方法對大量不同類群進(jìn)行分析總結(jié)的基礎(chǔ)之上。以往做過植物等位酶分析，為植物遺傳多樣性分析積累了較為豐富的資料，為判定某一特定植物遺傳多樣性的相對水平提供了依據(jù)[20-23]。
過去20年中，RAPD和AFLP等技術(shù)大量應(yīng)用于植物遺傳多樣性和居群遺傳結(jié)構(gòu)，由于技術(shù)自身存在缺陷等原因，例如RAPD分子標(biāo)記存在穩(wěn)定性不好，重復(fù)性差[24-27]；AFLP分子標(biāo)記不能確定連鎖程度和位點(diǎn)的獨(dú)立性，不能直接分開是選擇還是居群間隔離導(dǎo)致的遺傳變異[28]，而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力費(fèi)錢。
采用DALP分子標(biāo)記技術(shù)對金釵石斛的遺傳多樣性水平進(jìn)行評估，還需要用此方法對石斛屬、蘭科甚至更廣泛的類群作對比研究。
與用DALP標(biāo)記過檢測過的物種相比，金釵石斛其物種水平和居群水平的遺傳多樣性處于較低的水平[10-16， 18-20]。
4.3 金釵石斛的居群遺傳結(jié)構(gòu) 金釵石斛基因分化系數(shù)Gst 0.338 6。表明有66.14%的遺傳變異來自居群內(nèi)，33.86%的遺傳變異來自居群間，居群間存在較高水平的遺傳分化。
造成金釵石斛居群間的分化程度較高，而遺傳多樣性較低的因素可能是，金釵石斛分布范圍較廣，其數(shù)目巨大的微小種子可借助風(fēng)力或其他途徑傳播到很遠(yuǎn)的區(qū)域，在較連續(xù)的分布區(qū)域內(nèi)，金釵石斛的居群間可有較頻繁的基因流動。近年來，大規(guī)模的人工采集、生態(tài)環(huán)境的破壞、生境片段化，使得金釵石斛居群的個(gè)體數(shù)量急劇減少。這可能導(dǎo)致遺傳漂變和近交等不利因素的發(fā)生，必然致使金釵石斛居群遺傳多樣性降低，居群間遺傳分化加大。
金釵石斛具有較強(qiáng)的無性繁殖能力。在條件適宜的情況下，多年生的老莖上會萌發(fā)出許多新的幼小個(gè)體，新個(gè)體利用老莖的養(yǎng)分進(jìn)行生長發(fā)育，在老莖枯死后，這些小個(gè)體落入周圍的環(huán)境繼續(xù)生長，在老莖周圍形成無性繁殖系[29]。特別是在居群破碎，蟲媒傳粉不充分，不能很有效的進(jìn)行有性生殖時(shí)，這種克隆生長的習(xí)性尤為明顯。這也導(dǎo)致了遺傳多樣性的喪失和居群間的分化。
金釵石斛居群個(gè)體數(shù)在極短的時(shí)間內(nèi)迅速下降，個(gè)體所攜帶的等位基因可能只是原居群基因庫中很小的一次抽樣，當(dāng)它們得以恢復(fù)重建同類居群時(shí)，就會引發(fā)“奠基者效應(yīng)（founder effect），從而使該居群遺傳多樣性迅速下降。過度采挖后殘留下來的破碎居群，經(jīng)過一段時(shí)間的隔離，缺乏基因交流，在各自的小環(huán)境中繁衍進(jìn)化，加深了居群間的分化程度。
4.4 金釵石斛的保護(hù)策略 金釵石斛對生境要求嚴(yán)格、生長緩慢、有性生殖效率不高，人為掠奪采集和破壞更加劇了金釵石斛的瀕危。在本研究的7個(gè)居群中，思茅和騰沖居群的遺傳多樣性較為豐富，這與當(dāng)?shù)刈匀槐Ｗo(hù)區(qū)較為有效的管理和保護(hù)有一定的關(guān)系；在人為破壞比較嚴(yán)重的屏邊居群中，金釵石斛表現(xiàn)出了較低的遺傳多樣性水平。因此，建議對金釵石斛野生資源應(yīng)保護(hù)和恢復(fù)其棲息環(huán)境，采取措施幫助野生殘留居群恢復(fù)重建；積極開展種質(zhì)資源的收集保存工作，并對石斛屬植物進(jìn)行更全面深入的研究，為石斛資源的可持續(xù)利用提供理論指導(dǎo)和依據(jù)。
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Study on population genetic variation of Dendrobium nobile in
Yunnan by DALP
ZHANG Ming-yu， YU Hong YUAN Feng
（Yunnan Herbal Laboratory， Institute of Herb Biotic Resources， Yunnan University， Kunming 650091， China）
[Abstract] The Direct Amplification of Length Polymorphisms was applied to assess genetic diversity and structure of 7 populations of Dendrobium nobile， comparing one population of D.lituflorum.The five primer combinations were amplified to produce 140 clear bands， and 102 polymorphic bands had been detected with each pair of primer producing 20.4 polymorphic bands on average.At species level， the percentage of polymorphic bands （PPB） was 72.86%， the Nei′s gene diversity index （H） was 0.288 9， and the Shannon′s information index （I） was 0.424 2.At population level， the average PPB was 47.96%， H was 0.1861， and I was 0.273 9 in 7 populations.The coefficient of gene differentiation （Gst） was 0.338 6 among populations of D.nobile.It showed that 33.86% of the total genetic diversity was attributable to genetic differentiation among populations， while the rest 66.14% was resided between individuals within population.
第9篇：重復(fù)的遺傳學(xué)效應(yīng)范文
關(guān)鍵詞 核轉(zhuǎn)染儀 肝素酶基因 肝癌細(xì)胞
RNA干擾（RNA interferance，RNAi）是近些年在分子生物學(xué)中迅速發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)，是基因功能研究最常用手段之一[1]；它包括轉(zhuǎn)錄水平（Transcriptional gene silencing ，TGS）和轉(zhuǎn)錄后水平（post-transcriptional gene silencing， PTGS）2種基因沉默方式[2]。通常所說的RNAi指的是PTGS，通過基因編碼區(qū)設(shè)計(jì)的小分子RNA（siRNA）能與對應(yīng)的mRNA靶序列特異結(jié)合，并使靶序列降解，從而使基因沉默[1]。由于基因上游轉(zhuǎn)錄水平持續(xù)活躍，不停地產(chǎn)生大量mRNA，要使基因持久沉默，就得不停地給予外源性siRNA。因此，PTGS的干擾效率不高。研究發(fā)現(xiàn)植物細(xì)胞存在高效率的TGS現(xiàn)象，即在DNA水平上通過基因5’端啟動子區(qū)域DNA甲基化或組蛋白去乙?；问绞够蛴谰贸聊?；這種現(xiàn)象被稱為siRNA指導(dǎo)下的DNA甲基化（siRNA-direct DNA methylation）或組蛋白修飾[3，4]。2004年Kawasaki 等[5]首次發(fā)現(xiàn)在人細(xì)胞也存在TGS現(xiàn)象。理論上講，一次給予針對基因5’端啟動子的siRNA，就可使該基因由于表觀遺傳修飾而保持持久沉默[6～8]。因此，TGS相對于PTGS的研究更具有經(jīng)濟(jì)性和臨床應(yīng)用前景[9]。肝素酶基因（heparanase gene，HPA）位于人染色體4q 21.3，其5’端啟動子區(qū)域含有CpG島，表明基因的表達(dá)受甲基化等表觀遺傳學(xué)機(jī)制調(diào)控[10]；HPA在肝癌、乳腺癌、大腸癌、肺癌和淋巴瘤等多種腫瘤中都有高水平的表達(dá)[11～13]，主要參與腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲。然而，TGS的沉默對象是位于細(xì)胞核中的非編碼DNA調(diào)控序列，siRNA必須進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)才能發(fā)揮作用。近年由于核轉(zhuǎn)染技術(shù)發(fā)展，尤其是德國AMAXA公司研發(fā)的NucleofectorTM專利創(chuàng)新技術(shù)，它采用電穿孔技術(shù)與細(xì)胞類型特異的核轉(zhuǎn)染溶液結(jié)合方法，直接將DNA序列轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，即使是常規(guī)轉(zhuǎn)染無法轉(zhuǎn)染的原代培養(yǎng)細(xì)胞和不分裂細(xì)胞也可成功轉(zhuǎn)染，其轉(zhuǎn)染率可高達(dá)70%以上，速度快，轉(zhuǎn)染2h后就能發(fā)揮作用，操作簡單方便[14，15]。但目前尚未見該技術(shù)用于TGS研究，既往TGS研究采用常規(guī)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)。本研究采用HPA基因?yàn)槟Ｐ停容^核轉(zhuǎn)染儀輔助轉(zhuǎn)染技術(shù)和常規(guī)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)在肝素酶基因沉默效果和沉默維持時(shí)間上的差別。
1 材料與方法
1.1 材料
DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、含100 U/mL青霉素、100 U/InL鏈霉素的青鏈霉素混合液均購自Gibco公司，SMMC-7721細(xì)胞（中科院上海細(xì)胞所），NucleofectorTM電轉(zhuǎn)試劑盒（德國Amaxa公司），德國Amaxa公司單孔核電轉(zhuǎn)儀，型號2b（北京達(dá)科維生物公司提供），Trizol試劑（invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（fermentas公司），2×Taqmix（ABI公司），兔抗人肝素酶多克隆抗體、HPR標(biāo)記羊抗兔抗體（Santa公司），PVDF膜（ Santa 公司），發(fā)光試劑盒，Transwell小室（BD公司）；Lipofetmiane 2000試劑盒（美國Invitrogen）。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮中取出SMMC-7721細(xì)胞，42℃熱水迅速復(fù)蘇，用高糖DMEM加10%的血清和1%的青鏈霉素混合液，放入37℃、5%CO2、常規(guī)濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.2.2 干擾片段設(shè)計(jì) 針對肝素酶基因啟動子區(qū)，分別設(shè)計(jì)多個(gè)干擾片段（siRNA），在預(yù)實(shí)驗(yàn)中篩選出干擾效果較理想的siRNA；TGS的 siRNA為：GAGGAAGUGCUAGAGACUCU；同時(shí)對HPA基因編碼區(qū)設(shè)計(jì)RNAi片段：CCUUAAGAAGGCUGAUAUU（圖1），整個(gè)設(shè)計(jì)合成由美國BIOO公司協(xié)助完成，設(shè)計(jì)完成后的siRNA經(jīng)過DNAMAN軟件與原基因組BLAST以后，與肝素酶基因的啟動區(qū)完全匹配。
1.2.3 基因轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)組，核轉(zhuǎn)染儀組，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組及對照組（不含siRNA）。在轉(zhuǎn)染前1 天，將對數(shù)生長期的SMMC-7721細(xì)胞按l×106個(gè)鋪于10cm培養(yǎng)皿中，細(xì)胞生長至90%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，方法按照Amaxa電轉(zhuǎn)染試劑盒產(chǎn)品說明書進(jìn)行，即選擇多個(gè)參數(shù)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化好轉(zhuǎn)染參數(shù)，將培養(yǎng)在對數(shù)生長期的106個(gè)肝癌細(xì)胞與siRNA混合，加入轉(zhuǎn)染液，重懸細(xì)胞，放入轉(zhuǎn)染杯，在電轉(zhuǎn)染儀中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。脂質(zhì)體常規(guī)轉(zhuǎn)染采用Lipofetmiane 2000試劑盒，具體操作按說明書進(jìn)行。
1.2.4 RT-PCR 分別收集轉(zhuǎn)染后48h、72h和96h的細(xì)胞，trziol一步法分別提取細(xì)胞總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)為cDNA后，PCR檢測各組細(xì)胞肝素酶基因表達(dá)情況。HPA基因上游引物：ATGTGGAGGAGAAGTTACGG，下游引物：TGAGTTGGACAGATTTGGAA；PCR條件為94℃/ 3min； 94℃ /30s；55℃/ 30s；72℃ /45s，共32個(gè)循環(huán)，最后72℃ 延伸10min。
圖1 HPA基因啟動子siRNA設(shè)計(jì)示意圖
1.2.5 實(shí)時(shí)半定量RT-PCR HPA基因上游引物：GTGGTGATGAGGCAAGTATTC，下游引物：GTGGTGATGAGGCAAGTATTC。采用EverGreen I PCR試劑盒（Biotech）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光半定量PCR反應(yīng)，操作按說明進(jìn)行，一管中不加模板用作陰性對照。反應(yīng)液混勻后，置于SLAN熒光定量PCR儀中。設(shè)立程序：95℃ /5min預(yù)變性后，94℃/30s， 60℃退火45s，72℃延伸45s， 循環(huán)40次，最后72℃充分延伸10min。PCR反應(yīng)結(jié)束后從55℃到95℃按每級0.5℃遞增作出溶解曲線，分析每個(gè)PCR反應(yīng)的溶解曲線以確保PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。內(nèi)參β-actin作一相對標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)內(nèi)參和目的基因的Ct值計(jì)算該基因相對表達(dá)量。
1.2.6 Western blot檢測 將轉(zhuǎn)染后48h，72h和96h的細(xì)胞裂解，收集蛋白質(zhì)，Bradford法測定含量。蛋白變性后每孔上樣70μg，經(jīng)10%SDS一聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶封閉1h。用5%脫脂牛奶稀釋一抗（β-actin以1：2000稀釋，兔抗肝素酶抗體以1：500比例稀釋）4℃搖床孵育過夜，PBST洗膜3×10 min，加入相應(yīng)的二抗（PBST1：1000稀釋）室溫溫育1 h，PBST洗膜3×10 min，化學(xué)發(fā)光試劑檢測蛋白質(zhì)印跡，X線暗室曝光成像。
2 結(jié)果
2.1 實(shí)時(shí)半定量RT-PCR定量檢測核轉(zhuǎn)染儀和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)對基因沉默效果
定量檢測結(jié)果示：在轉(zhuǎn)染48h后，2種方法對HPA基因mRNA表達(dá)幾乎達(dá)到100%的抑制；72h后，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組HPA基因表達(dá)有所恢復(fù)，而核轉(zhuǎn)染組仍保持100%的抑制；在轉(zhuǎn)染96h后，2組HPA基因均恢復(fù)表達(dá)，表達(dá)相對量接近對照組的一半。（圖2）
2.2 Western雜交檢測核轉(zhuǎn)染組和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組對HPA基因沉默效果
western 雜交結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后48h，2組干擾細(xì)胞的HPA基因蛋白表達(dá)完全沉默；72h后，脂質(zhì)體組HPA基因蛋白再次表達(dá)，而核轉(zhuǎn)染組HPA仍保持沉默；96h后，2組細(xì)胞的HPA蛋白恢復(fù)表達(dá)（圖3）。
圖2 實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測核轉(zhuǎn)染組和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染48h、72h、96h后HPA表達(dá)情況
圖3 western blot 檢測核轉(zhuǎn)染組和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組分別在轉(zhuǎn)染后48h、72h、96h后，HPA表達(dá)情況
3 討論
惡性腫瘤細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移一直是腫瘤臨床治療關(guān)鍵和難點(diǎn)，而肝素酶基因被證明在腫瘤的侵潤轉(zhuǎn)移中起著重要作用[12]。隨著腫瘤發(fā)展分子機(jī)制闡明，腫瘤的基因治療成為目前研究重點(diǎn)之一；近年用RNAi技術(shù)在多種不同腫瘤細(xì)胞中成功干擾多種靶基因表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞生長，已成為目前腫瘤治療研究熱點(diǎn)[1]。這些基因除腫瘤基因，還包括抗凋亡分子、端粒酶、生長因子受體、某些信號分子等基因。應(yīng)用RNAi 技術(shù)，還可探索各種基因功能及相互作用，為篩選新的藥物靶基因提供便利。已有實(shí)驗(yàn)證明，通過RNAi沉默肝素酶基因，可以阻止部分腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[16]。
傳統(tǒng)的靶向腫瘤基因RNAi治療是建立在轉(zhuǎn)錄后水平上，其缺點(diǎn)是：基因的啟動子活躍，靶基因能被持續(xù)轉(zhuǎn)錄，要想使基因長期沉默，需要不間斷地給予siRNA。而目前由于用于人類腫瘤基因治療載體存在許多問題，建立長期穩(wěn)定的特異性在瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的治療基因載體并用于臨床治療尚不成熟。用于臨床上實(shí)驗(yàn)性治療藥物多為體外合成并經(jīng)化學(xué)修飾的寡核苷酸，不僅價(jià)格昂貴，半衰期短，且有一定細(xì)胞毒性；要使靶基因沉默，需長期給藥，不僅療效受到影響，毒性很大，也不經(jīng)濟(jì)。而轉(zhuǎn)錄水平的RNAi不僅誘導(dǎo)基因調(diào)控序列同源靶序列被降解，還可以誘導(dǎo)異染色質(zhì)形成，DNA甲基化，組蛋白修飾等表觀遺傳學(xué)改變，使基因不能轉(zhuǎn)錄；理論上講，一次給予針對5’端啟動子的siRNA就可使該基因永久沉默，因此對于轉(zhuǎn)錄水平的RNA干擾，有著更廣泛地應(yīng)用前景[9]。要實(shí)現(xiàn)TGS， 必須要將siRNA有效轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，本項(xiàng)研究是通過核轉(zhuǎn)染儀將設(shè)計(jì)在肝素酶5’端的siRNA轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞，以證實(shí)轉(zhuǎn)錄水平干擾的優(yōu)越性。
研究首先針對細(xì)胞核內(nèi)的啟動子區(qū)，設(shè)計(jì)siRNA靶點(diǎn)，同時(shí)對胞漿內(nèi)的mRNA區(qū)設(shè)計(jì)相應(yīng)siRNA靶點(diǎn)，通過PCR初步檢測發(fā)現(xiàn)，2組細(xì)胞在干擾發(fā)生48h后，基因同時(shí)都被沉默；72h時(shí)，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞基因沉默效果明顯下降，而核轉(zhuǎn)染組細(xì)胞基因沉默效果仍然很明顯，96h時(shí)，2組細(xì)胞的肝素酶基因再次同時(shí)表達(dá)出來，RT-PCR證實(shí)這個(gè)結(jié)果。從Western blot實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證明，核轉(zhuǎn)染技術(shù)的轉(zhuǎn)錄水平沉默肝素酶基因比脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)錄水平沉默肝素酶基因細(xì)胞，肝素酶的沉默時(shí)間維持更長些；但是96h的時(shí)候，2組肝素酶蛋白又再次表達(dá)。相對于脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)錄后基因沉默，核轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默維持時(shí)間相對更持久，但并未達(dá)到先前預(yù)期的基因永久沉默目的。
盡管本次實(shí)驗(yàn)從基因水平和蛋白水平都無法證實(shí)，TGS對基因有著永久沉默作用；但是相比于PTGS，TGS對基因沉默維持時(shí)間顯然有所延長。上述結(jié)果與理論上轉(zhuǎn)錄水平干擾能持久沉默基因的推測仍然有較大差距，其原因可能有：（1）細(xì)胞核轉(zhuǎn)染的效率；電轉(zhuǎn)染只有一少部分siRNA被轉(zhuǎn)染進(jìn)核中，多數(shù)siRNA還是留在胞漿內(nèi)被降解，可能會造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想。在實(shí)驗(yàn)中，用普通的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HPA調(diào)控區(qū)siRNA，TGS幾乎無任何基因沉默作用，而轉(zhuǎn)染編碼區(qū)siRNA， PTGS卻有明顯基因沉默效應(yīng)（結(jié)果未公布），說明TGS必須用有效的核轉(zhuǎn)染技術(shù)。（2）不同細(xì)胞或基因?qū)GS的效果不同。可能不同細(xì)胞或基因表達(dá)調(diào)控受多種機(jī)制影響，表觀遺傳學(xué)因素只是其中一種。（3）表觀遺傳學(xué)控制基因的表達(dá)是可逆的。
雖然如此，本實(shí)驗(yàn)為TGS在腫瘤基因治療中的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，至于TGS的作用機(jī)制，以及是否針對CpG島或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的RNAi更有效，一次RNAi導(dǎo)致的表遺傳學(xué)改變能維持多長時(shí)間（細(xì)胞能傳多少代），是否含有CpG島的基因更適合針對啟動子的RNAi等等，則需要更多實(shí)驗(yàn)加以論證。
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