代寫(xiě)情書(shū)精選(九篇)
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第1篇：代寫(xiě)情書(shū)范文
摘要：總體看來(lái)，研究者對(duì)浪漫抒情小說(shuō)在20－40年代流變的梳理顯得相對(duì)較少，其中有許多的問(wèn)題需要繼續(xù)探討，比如浪漫主義小說(shuō)為何在20年代走上全盛，在不同的年代各自有什么特點(diǎn)，這些問(wèn)題都亟待解決。本文試圖從橫縱坐標(biāo)圖中梳理出浪漫抒情小說(shuō)的特點(diǎn)，窺視其創(chuàng)作流變過(guò)程。一方面，從橫向看，浪漫抒情小說(shuō)的共同的特點(diǎn)，使其成為獨(dú)立的存在。縱向看，在不同時(shí)展也顯現(xiàn)出與其他流派的不同特點(diǎn)；另一方面，橫向軸上不同題材的浪漫抒情小說(shuō)之間也存在著異同，這也需要在時(shí)間的縱軸上仔細(xì)分析，以便把握它們的發(fā)展脈絡(luò)。
關(guān)鍵詞：浪漫抒情小說(shuō)；自我；田園
一方面，從橫向看，浪漫抒情小說(shuō)有許多獨(dú)特的創(chuàng)作方法及其他共同的特點(diǎn)，這使我們將它們歸結(jié)為浪漫抒情小說(shuō)這一派別，從而區(qū)別于其他流派，成為獨(dú)立的存在。最明顯的是區(qū)別于現(xiàn)實(shí)主義小說(shuō)的提出社會(huì)問(wèn)題激發(fā)思考，客觀敘述、典型塑造及布局嚴(yán)謹(jǐn)，浪漫主義的風(fēng)格特征是“自我小說(shuō)”(1)、感傷抒情、體式的散文化及詩(shī)化，尤其“在我國(guó)小說(shuō)的體式發(fā)展上具有極大的新鮮性”(2)。縱向看，浪漫抒情小說(shuō)在不同時(shí)展中顯現(xiàn)出與其他流派的不同特點(diǎn)；另一方面，橫向軸上不同題材的浪漫抒情小說(shuō)之間也存在著異同，這些不同則反映了浪漫抒情小說(shuō)自身的復(fù)雜多變性，這些不同，同樣需要我們?cè)跁r(shí)間的縱軸上仔細(xì)分析，以便把握它們的發(fā)展脈絡(luò)。本文以浪漫抒情小說(shuō)題材中比較具有代表性的自我和田園浪漫抒情小說(shuō)為例，時(shí)間上劃分為20年代前中期上延至清末民初、20年代末至30年、40年代三個(gè)階段，嘗試著從橫縱坐標(biāo)圖中梳理出浪漫抒情小說(shuō)的特點(diǎn)，窺視其創(chuàng)作流變過(guò)程。
一、自我的浪漫抒情小說(shuō)在20－40年代的新陳代謝
20年代前中期上延至清末民初的感傷的浪漫抒情小說(shuō)，要求個(gè)性解放尊崇自我價(jià)值而又遭到社會(huì)壓抑的年輕一代，在本國(guó)文學(xué)承傳和外國(guó)抒情文學(xué)的雙重影響下，用寫(xiě)作表達(dá)內(nèi)心激情，形成了獨(dú)特風(fēng)格。1、20世紀(jì)初西方世紀(jì)末文學(xué)思潮影響下自我的浪漫抒情小說(shuō)形成了感傷、憂(yōu)郁、頹廢的特點(diǎn)。比如郁達(dá)夫的《沉淪》；2、俄國(guó)多余人形象，這是俄國(guó)世紀(jì)末情緒的體現(xiàn)，在其影響下我國(guó)浪漫抒情小說(shuō)也帶有零余者的特點(diǎn)。比如郁達(dá)夫、郭沫若筆下的主人公，多是多余人；3、日本私小說(shuō)的自然主義式的自我袒露結(jié)合世紀(jì)末情緒和多余人氣質(zhì)，在此風(fēng)籠罩下的中國(guó)自我浪漫抒情小說(shuō)演化為感傷的自敘心理傾訴，常用日記體、書(shū)信體。這在郁達(dá)夫、郭沫若和其他創(chuàng)造社作家中有明顯都體現(xiàn)；4、中國(guó)古代文學(xué)感傷傳統(tǒng)和中國(guó)文人固有的抒情氣質(zhì)影響此時(shí)的中國(guó)自我浪漫抒情小說(shuō)，表現(xiàn)為常從古代文學(xué)中取材與意境。比如倪貽德《花影》、郭沫若《行路難》分別取意境于李后主的詞和李白的詩(shī)；5、加之封建王朝瀕臨末世使得20年代前中期上延至清末民初的自我浪漫抒情小說(shuō)有著悲涼感傷情調(diào)。比如蘇曼殊《斷鴻零雁記》。(3)種種因素最終促成20年代個(gè)人浪漫抒情小說(shuō)走向全盛。創(chuàng)造社的、淺草一沉鐘社的陳翔鶴、林如稷等“藝術(shù)派”作家為浪漫主義抒情小說(shuō)創(chuàng)作的主干；甚至少數(shù)文學(xué)研究會(huì)的作家也不乏浪漫抒情小說(shuō)的創(chuàng)作，如廬隱《海濱故人》王以仁的《孤雁》；還有新潮社時(shí)期的羅家倫。
20年代末至30年代堅(jiān)守自我的作家也不少，浪漫抒情小說(shuō)仍然綿延不絕。這一時(shí)期的自我的浪漫抒情小說(shuō)與前一個(gè)時(shí)期相比有許多異同。相同之處在于1、即使在30年代革命文學(xué)和普羅文學(xué)創(chuàng)作中，走向左翼，走向健康熱烈積極向上時(shí)，作家的自我情感也還是無(wú)法徹底回避的因素，感傷色調(diào)依然時(shí)隱時(shí)現(xiàn)。并在一定意義上反映著世紀(jì)末的某種病態(tài)。2、這一時(shí)代的感傷較之20年代的來(lái)自于作家對(duì)時(shí)代社會(huì)極不適應(yīng)的過(guò)敏反應(yīng)，仍舊比較明顯的反應(yīng)在30年代，這體現(xiàn)了20到30年代的傳承關(guān)系。這在丁玲的《沙菲女士的日記》和柔石的《二月》上有明顯的體現(xiàn)。3、30年代作家筆下具有20年代浪漫抒情氣質(zhì)的形象不勝枚舉；主要的不同：20年代末至30年代初，由于時(shí)代風(fēng)云的變幻，許多作家逐步轉(zhuǎn)向，紛紛從小我走向社會(huì)這個(gè)大我，浪漫抒情小說(shuō)面臨被檢討、批判、否定的命運(yùn)。20年代感傷的集中、典型，在30年代自我浪漫抒情小說(shuō)在時(shí)代因素影響下走向淡化，形成逐步斂縮的局面。20年代末至30年代的自我的浪漫抒情小說(shuō)更有自己的特色，作家像悖時(shí)的文人發(fā)出的病態(tài)。
30年代至40年代經(jīng)過(guò)戰(zhàn)火的磨煉，文學(xué)史上堅(jiān)守自我的作家仍占相當(dāng)?shù)谋戎亍Ｋ麄冎械牟簧偃藢?duì)于浪漫抒情依然持有濃厚的興趣，40年代的自我的浪漫抒情小說(shuō)雖然斂縮，但注定不斷延續(xù)。總特點(diǎn)是理性主義的發(fā)達(dá)。如在中國(guó)的現(xiàn)代派作家的筆下，雖主要反映現(xiàn)代性，但倒是充滿(mǎn)浪漫抒情情調(diào)。如無(wú)名氏《塔里的女人》、《北極風(fēng)情畫(huà)》，這些小說(shuō)中有些情節(jié)場(chǎng)景也寫(xiě)得很感傷，有五四式感傷氣質(zhì)，有浪漫抒情的情調(diào)。
二、田園的浪漫抒情小說(shuō)在20－40年代的新陳代謝
田園浪漫抒情小說(shuō)(包括鄉(xiāng)野浪漫抒情小說(shuō))，這一類(lèi)型的小說(shuō)與鄉(xiāng)土文學(xué)有著明顯的相似及不同之處。兩者聯(lián)系密切，糾纏發(fā)展，因而鄉(xiāng)土寫(xiě)實(shí)常常與田園浪漫抒情小說(shuō)相混淆，這需要我們認(rèn)真的理清它們之間的區(qū)別之處。
20年代前中期魯迅的作品《故鄉(xiāng)》傳達(dá)出的實(shí)際上就是浪漫的自然和自然人的觀念。許欽文前期的寫(xiě)作實(shí)際上是他開(kāi)手寫(xiě)鄉(xiāng)土文學(xué)前，在尋找一種精神家園，他們都為田園浪漫抒情小說(shuō)奠定了基礎(chǔ)。他們的作品類(lèi)似于鄉(xiāng)土文學(xué)，注重真，而其中美和善卻缺失。正式開(kāi)啟田園浪漫抒情小說(shuō)的是處在20年代的廢名，他的田園浪漫抒情小說(shuō)明顯突出特征是憂(yōu)傷與玄。另外的如郁達(dá)夫的《沉淪》，也有對(duì)自然的溢美之詞。
30年代鄉(xiāng)土文學(xué)中因傳達(dá)這種流行著的、感傷的懷鄉(xiāng)病而體現(xiàn)浪漫抒情風(fēng)格，但同時(shí)顯示出異色。20年代的鄉(xiāng)土文學(xué)基本上是現(xiàn)實(shí)主義風(fēng)格，30年代所寫(xiě)的田園抒情小說(shuō)以現(xiàn)代文明的弊端為參照來(lái)反觀心目中遙遠(yuǎn)的鄉(xiāng)村，常帶有一種主觀的理想的色彩，比如廢名、沈從文，他們是對(duì)田園浪漫抒情繼續(xù)與開(kāi)拓。帶著優(yōu)美、健康而理想的人生設(shè)計(jì)特點(diǎn)的田園浪漫抒情小說(shuō)。人們誤把“他們筆下的風(fēng)情畫(huà)面都被當(dāng)成了鄉(xiāng)土寫(xiě)實(shí)的緣故?！?4)所以把他們當(dāng)做鄉(xiāng)土寫(xiě)實(shí)的作家來(lái)看待，他們實(shí)際是浪漫抒情小說(shuō)發(fā)展的新的階段。在30年代中期達(dá)到頂峰，但同時(shí)也意味著走向衰退。20年代沒(méi)有家園，逃離家園，出去流浪，30年代回到家鄉(xiāng)，尋找失落的家園。小說(shuō)家們找回了過(guò)去的夢(mèng)，但發(fā)現(xiàn)這時(shí)的家園已經(jīng)不是自己心目中的理想的家園。夢(mèng)想已經(jīng)破滅，這是更進(jìn)一步的精神家園的失落。這兩個(gè)時(shí)代共同之處是作家所刻畫(huà)的人物一般都經(jīng)歷著漂泊、尋找、失落三部曲。
40年代的汪曾祺繼承接續(xù)、豐富和擴(kuò)展田園浪漫抒情小說(shuō)。后來(lái)他又創(chuàng)了尋根小說(shuō)的先聲。
第2篇：代寫(xiě)情書(shū)范文
l材料與方法
1．1實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地選擇
2010年7月一2010年11月，在廣東省汕尾市紅海灣鴻泰養(yǎng)殖場(chǎng)，從10口凡納濱對(duì)蝦高位精養(yǎng)池塘中隨機(jī)抽取6口池塘進(jìn)行采樣。各池塘面積約為(0．45土0．1)hm2。池底鋪設(shè)土工膜，無(wú)泥沙層，水深1．8～2．2m，養(yǎng)殖用海水經(jīng)沙濾井過(guò)濾所得。每口池塘配備12～15kw／hm2的增氧設(shè)備(增氧機(jī)和底部增氧曝氣管)。放養(yǎng)凡納濱對(duì)蝦∞f^妒e刀口P螂1，口刀，z口mef)蝦苗體長(zhǎng)(1．0士0．1)cm，放苗量為270萬(wàn)尾／h“。
1．2材料及方法
1．2．1樣品采集采樣時(shí)間和頻率按照養(yǎng)殖時(shí)間劃分。在第一批放苗的五口池塘中隨機(jī)選取卜3號(hào)3口池塘。從放苗日起，跟蹤其養(yǎng)殖全程，時(shí)間從2010年7月31日到同年11月24日，約14d取一次樣，跟蹤時(shí)長(zhǎng)116d。根據(jù)第一批的調(diào)查結(jié)果，在第二批放苗的5口池塘中隨機(jī)選取4—6號(hào)3口池塘從放苗后的第10天起，進(jìn)行養(yǎng)殖密集采樣跟蹤，時(shí)間從2010年9月18日到同年11月20日，采樣時(shí)間為7天1次，跟蹤時(shí)長(zhǎng)63d。第二批采樣池塘均因wSS暴發(fā)而中斷養(yǎng)殖。所取蝦樣均為活蝦，每次每塘隨機(jī)采集對(duì)蝦不少于15尾，分別采集對(duì)蝦的鰓和肌肉組織，用濃度為75％的酒精固定。
1．2．2DNA的提取將每次采集的15尾對(duì)蝦隨機(jī)分成3組，每組5尾。任選一組，并分別取5尾蝦的鰓或者肌肉組織混合成一個(gè)樣品，鰓組織樣品總質(zhì)量為(15士2)mg，肌肉組織樣品總克數(shù)為(20土3)mg。各組織樣品DNA采用“天根海洋動(dòng)物組織DNA提取試劑盒”(天根生物技術(shù)有限公司制造)提取。所提取的DNA樣于一20℃保存待測(cè)。
1．2．3Real．timePCR引物和探針引物和探針的選擇。根據(jù)DurandandLi曲tner【6J設(shè)計(jì)，由Invitrogen公司合成(表1)
1．2．4Real．timePcR反應(yīng)參照Li曲tIler等舊1建立的實(shí)時(shí)熒光定量PcR法檢測(cè)wSsV使用Eppendorf熒光定量PCR儀(EppendorfMastercy-clerRealplex)進(jìn)行定量PcR檢測(cè)。選取20“LPcR反應(yīng)體系：1O燦2xTaqManUniversalPCRMasterMix(TAKARA公司，代號(hào)DRR039A)，上下游引物各0．5燦(終濃度為10“m01／L)，探針0．5皿(終濃度為5“mol／L)，模板DNA2此，補(bǔ)充水至20此。PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃30s；95℃5s，55℃15s，72℃30s，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品重復(fù)4次，每批樣品設(shè)置空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照?？瞻讓?duì)照用滅菌超純水作模板，陽(yáng)性對(duì)照用已知病原蝦提取的DNA調(diào)整濃度后作模板。
1．2．5標(biāo)準(zhǔn)品的制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備根據(jù)Lightner[6]利用插入外源目的基因的方法得到純化陽(yáng)性質(zhì)粒DNA，其濃度為1．618×108copy／此。用10倍稀釋陽(yáng)性質(zhì)粒至7個(gè)梯度作模板并對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，其平均CT值依次為34．90、31．04、27．65、24．57、20．24、17．11、13．66，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖l所示，R2=0．9991。
2結(jié)果與分析
2．1第一批放苗1～4池塘養(yǎng)殖全程對(duì)蝦攜帶wSSv檢測(cè)結(jié)果
2．1．114—34池塘對(duì)蝦鰓組織中WSSV攜帶量在養(yǎng)殖全程中，14—3”池塘對(duì)蝦鰓組織中wsSV攜帶量的動(dòng)態(tài)變化如圖2所示。從圖中可以看出，3口池塘的對(duì)蝦苗種均攜帶wssv，且其攜帶量均達(dá)到了103copy幢以上。隨著養(yǎng)殖的進(jìn)行，對(duì)蝦鰓組織中wssV的攜帶量整體呈現(xiàn)波動(dòng)上升的趨勢(shì)。養(yǎng)殖前期上升幅度較小，最高攜帶量為1．o×105copy幢；到養(yǎng)殖60d左右，24、34池塘出現(xiàn)第一個(gè)波動(dòng)高峰，此時(shí)鰓中wssV攜帶量最高可達(dá)到3．O×107c叩y／g。隨后其病毒攜帶量有所下降；到養(yǎng)殖后期，1”一3“池塘的wssv攜帶量均有較大幅度的上升，均在養(yǎng)殖末期達(dá)到最大峰值。養(yǎng)殖全程中，14池對(duì)蝦鰓組織wssv攜帶量的波動(dòng)范圍為1．6×103—8．6×106c叩y恒，平均值1．1×106cdpy／g；2”池對(duì)蝦鰓組織wssV攜帶量的波動(dòng)范圍為1．9×10’~2．1×107c叩y儋，平均值4．4×106copy悖；34池對(duì)蝦鰓組織wssv攜帶量的波動(dòng)范圍為6．2×103～9．7×108copy／g，平均值1．1×108copy／g。
2．1．21L3”池塘對(duì)蝦肌肉組織中wsSv攜帶量在養(yǎng)殖全程中，1群一3j!j}池塘對(duì)蝦肌肉組織中wssV攜帶量如圖1所示，其動(dòng)態(tài)變化情況與鰓組織中的趨勢(shì)相似，均呈現(xiàn)波動(dòng)上升的趨勢(shì)，但整體低于鰓組織。結(jié)果顯示，14養(yǎng)殖池對(duì)蝦肌肉組織wssV攜帶量的波動(dòng)范圍為1．3×103～4．4×105copy／g，平均值3．2×105copy／g；24養(yǎng)殖池對(duì)蝦肌肉組織wssV攜帶量的波動(dòng)范圍為2．1×103～6．1×105copy／g，平均值2．8×105copy／g；34養(yǎng)殖池對(duì)蝦肌肉組織WssV攜帶量的波動(dòng)范圍為6．5x103～1．1×106copy／g，平均值3．3×105copy／g。1虻38池塘病毒含量(取對(duì)蝦鰓和肌肉組織帶毒量的平均值)，環(huán)境指標(biāo)及養(yǎng)殖環(huán)境狀況見(jiàn)表2。
2．2第二批放苗4L64池塘加密采樣對(duì)蝦攜帶WSSv的檢測(cè)結(jié)果
2．2．14牝礦池塘對(duì)蝦鰓組織wSSV攜帶量44—6“池塘對(duì)蝦鰓組織WSSv攜帶量在養(yǎng)殖過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化如圖2所示。從圖中可以看出，前期病毒攜帶量均較低，隨著養(yǎng)殖的進(jìn)行，3個(gè)池塘對(duì)蝦鰓組織中wssv攜帶量逐漸升高，30d左右各池出現(xiàn)第一個(gè)波動(dòng)高峰，wssV最高攜帶量為1．21×106copy／g，隨后有所穩(wěn)定和下降，但11月6日即養(yǎng)殖53d后，攜帶量快速增長(zhǎng)。其中58池塘攜帶量在5天之內(nèi)從2．3×105copy儋升高至8．2×1010copy／g，最終暴發(fā)wss，導(dǎo)致中斷養(yǎng)殖，最后一次采樣缺失：44、64池對(duì)蝦wSSV攜帶量在后兩次采樣中迅速增加，最后一次采樣11月20日(即養(yǎng)殖63d)時(shí)均達(dá)到各池檢測(cè)的最大值(分別為6×106copy／g和5×107c叩y／g)，雖未達(dá)到發(fā)病閾值但兩池最終也因暴發(fā)wsS而于11月27—30日停止養(yǎng)殖。調(diào)查結(jié)果顯示，在整個(gè)養(yǎng)殖過(guò)程中，48池對(duì)蝦鰓組織wssv攜帶量的波動(dòng)范圍為8．1×103～6×106copy／g，平均值8．6×105copy／g；5“養(yǎng)殖池對(duì)蝦鰓組織wSsV攜帶量的波動(dòng)范圍為1．7×104～8．2×1010copy／g，平均值7．0×109copy／g；6”養(yǎng)殖池對(duì)蝦鰓組織wSsv攜帶量的波動(dòng)范圍為5．7×103～5．0×107copy／g，平均值4．3×106copy／g。
2．2．24L6”池塘對(duì)蝦肌肉組織中WSSV攜帶量44—64池塘對(duì)蝦肌肉組織wSSv攜帶量在養(yǎng)殖過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化如圖2所示，其變化情況與鰓組織的趨勢(shì)相似，均隨養(yǎng)殖時(shí)間的進(jìn)行逐漸波動(dòng)上升，且無(wú)顯著性差異。調(diào)查結(jié)果顯示，4”池對(duì)蝦肌肉組織WSSV攜帶量的波動(dòng)范圍為8．1×103～9．4×107copy／g，平均值1．1×1017copy／g；5“池對(duì)蝦肌肉組織wSsV攜帶量的波動(dòng)范圍為1．7×104～1．2×1010copy／g，平均值1．1×109copy／g；6”池對(duì)蝦肌肉組織wSSv攜帶量的波動(dòng)范圍為5．7×103～5．5×105copy／g，平均值1．1×10’copy／g。4牝64池塘病毒含量(取對(duì)蝦鰓與肌肉組織帶毒量的平均值)，環(huán)境指標(biāo)及養(yǎng)殖環(huán)境狀況見(jiàn)表3。3討論TaqMan探針?lè)晒舛縋cR是實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real．timePCR)的一種，可以針對(duì)微量的病毒進(jìn)行檢測(cè)并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)病毒的復(fù)制情況，其特異性更強(qiáng)，準(zhǔn)確度更高，被廣泛用于微量病毒復(fù)制的定量研究[7]。本研究采取實(shí)時(shí)定量PcR—TaqMan探針?lè)ǎ瑢?duì)高密度精養(yǎng)池塘對(duì)蝦wssV攜帶量進(jìn)行跟蹤調(diào)查，以期能夠更加準(zhǔn)確的了解對(duì)蝦養(yǎng)殖過(guò)程中體內(nèi)wssv攜帶量的變化。本次檢測(cè)結(jié)果表明，被測(cè)對(duì)蝦苗種攜帶微量wSSV范圍在1．3×103～1．7×104copy儋。蝦苗攜帶病原體，說(shuō)明了苗種生產(chǎn)過(guò)程中的病害控制還需加強(qiáng)，對(duì)育苗場(chǎng)銷(xiāo)售的苗種病害監(jiān)控還需嚴(yán)格【8J。整個(gè)檢測(cè)結(jié)果表明，對(duì)蝦鰓組織中的wssV攜帶量整體多于肌肉組織，且兩者變動(dòng)趨勢(shì)一致，但沒(méi)有顯著性差異(尸>0．05)。在對(duì)14—3“池塘整個(gè)養(yǎng)殖過(guò)程的調(diào)查中，wssV攜帶量在養(yǎng)殖前期(47d前)都有不同程度的增加，但均處于一個(gè)較穩(wěn)定的水平，wsSV拷貝數(shù)總體保持在104copy／g左右，個(gè)別值高于105copy／g；養(yǎng)殖中后期(60～116d)攜帶量呈現(xiàn)波動(dòng)上升的趨勢(shì)，并在最后一次采樣中達(dá)到相對(duì)最大值。根據(jù)1“一34池塘中對(duì)蝦體內(nèi)wssv前期攜帶情況的調(diào)查，對(duì)第二批采樣的4虻64號(hào)3口池塘進(jìn)行密集采樣，縮短了采樣時(shí)間，增加了采樣次數(shù)，以期更好的反應(yīng)wssv的變化規(guī)律及其受各種環(huán)境因素影響所表現(xiàn)出的動(dòng)態(tài)變化。在對(duì)4牝64池塘養(yǎng)殖的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，這3口池塘對(duì)蝦攜帶wssV的情況與1L38池塘較為相似，前期病毒含量有一定程度的上升，但均處于一個(gè)較穩(wěn)定的水平，除個(gè)別池塘外，wssv拷貝數(shù)多保持在105copy／g以下。然而53d后急劇上升，其中5”池塘升高至109copy／g以上，導(dǎo)致wSS暴發(fā)。44和64池塘也緊急收獲，致使養(yǎng)殖中斷。
第3篇：代寫(xiě)情書(shū)范文
1、名稱(chēng)
2、申請(qǐng)?jiān)?/p>
3、申請(qǐng)款額
4、借款后保證履行的義務(wù)
5、落款
貧困證明格式
xx-xx(學(xué)校)：
貴校學(xué)生xx-x其家長(zhǎng)屬本地居民，家庭基本情況如下：一、家庭人口x人，家庭成員組成：
一、家庭年收入約000元
二、主要收入來(lái)源：xx-xxx-xxx-xxx(填寫(xiě))
三、目前家庭主要困難:
(比如家庭成員是否有重病醫(yī)療開(kāi)支是否較大，是否有殘疾，收入來(lái)源是否單一，勞動(dòng)力是否較少)
確屬貧困家庭。特此證明。
村委會(huì)(街道居委會(huì))鄉(xiāng)、鎮(zhèn)(含)或縣區(qū)政府民政部門(mén)
或家庭聯(lián)系人所在街道以上民政部門(mén)
單位蓋章蓋章蓋章
年月日年月日年月日
蓋章單位聯(lián)系電話(huà)：000
申請(qǐng)書(shū)范文：
江西省農(nóng)村信用社：
我是江西科技師范學(xué)院中文系03級(jí)的貧困學(xué)生，來(lái)自九江市的一個(gè)偏僻農(nóng)村?，F(xiàn)家有6人，爺爺、奶奶、爸爸、媽媽、妹妹和我。爺爺、奶奶年老在家，妹妹在縣城讀高中，爸爸媽媽在家務(wù)農(nóng)，且媽媽體弱多病，全家的開(kāi)支主要靠農(nóng)作物。由于家鄉(xiāng)田少人多，加上去年又遇洪水，農(nóng)作物欠收，全家人均收入不足400元。我進(jìn)大學(xué)時(shí)的學(xué)費(fèi)大部分是靠親戚朋友借來(lái)的，今年要把學(xué)費(fèi)交齊就更加困難了。為了不因經(jīng)濟(jì)困難而影響自己的學(xué)業(yè)，能及時(shí)、足額地把所欠學(xué)費(fèi)交清，于是，我特向貴社提出助學(xué)貸款。我借款的額度是6000元，計(jì)劃畢業(yè)后4年內(nèi)還清本息。我父母也同意我貸款，并同意承擔(dān)連帶保證責(zé)任。貸款后，我保證履行還貸義務(wù)，按時(shí)歸還貸款本息。同時(shí)，繼續(xù)努力學(xué)習(xí)，爭(zhēng)取以?xún)?yōu)良的成績(jī)來(lái)回報(bào)省農(nóng)村信用社對(duì)我的關(guān)心和扶持。望省農(nóng)村信用社批準(zhǔn)為盼。
申請(qǐng)人：×××
年 月 日
貧困證明范文：
茲有我鄉(xiāng)(鎮(zhèn))(居委會(huì)等)×××(父母親姓名)之子(女)×××(學(xué)生姓名),于××年××月考入貴校學(xué)習(xí).由于×××原因(每個(gè)家庭的具體原因),導(dǎo)致家庭經(jīng)濟(jì)困難,希望學(xué)校,銀行能為其提供國(guó)家助學(xué)貸款,幫助其順利完成學(xué)業(yè).
第4篇：代寫(xiě)情書(shū)范文
【關(guān)鍵詞】 低聚原花青素;1型糖尿病;血脂;胰島素
心血管并發(fā)癥是糖尿病(diabetes mellitus，dm)的主要并發(fā)癥和致死原因，而脂代謝異常是糖尿病患者發(fā)生心血管并發(fā)癥的重要危險(xiǎn)因素[1]。wWw.133229.Com天然抗氧化劑低聚原花青素(oligomeric proanthocyanidin，opc) 由于具有降血糖、降血脂及免疫調(diào)節(jié)等作用和高效、低毒、高生物利用率等特點(diǎn)而受到醫(yī)藥界的廣泛重視[2，3]，本文研究opc對(duì)1型糖尿病(type1 diabetes mellitus，t1dm)小鼠血脂代謝以及胰島素表達(dá)水平的影響，為opc藥物開(kāi)發(fā)和應(yīng)用于糖尿病及其并發(fā)癥的防治提供科學(xué)依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 主要試劑與儀器 opc:由葡萄籽和松樹(shù)皮經(jīng)紅酒萃取，美國(guó)greensboro公司產(chǎn)品;鏈脲佐菌素(streptozotocin，stz)：美國(guó)sigma公司;accuchek active型血糖儀及血糖測(cè)試條：德國(guó)roche診斷有限公司;modular pp全自動(dòng)生化分析儀及酶法檢測(cè)配套試劑盒，包括總膽固醇(tc)檢測(cè)試劑盒(chodpap法)、甘油三酯(tg)檢測(cè)試劑盒(gpopap法)、高密度脂蛋白膽固醇(hdlc)及低密度脂蛋白膽固醇(ldlc)檢測(cè)試劑盒(酶直接法)：德國(guó)roche公司;兔抗小鼠胰島素多克隆抗體(antiinsulin)、過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素(streptavidin peroxidase，sp)試劑盒：北京博奧森生物技術(shù)有限公司;組織切片機(jī)、顯微照相裝置：德國(guó)萊卡公司。
1.1.2 動(dòng)物 健康雄性昆明小鼠60只，體質(zhì)量26～30g，由長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.2 方法
1.2.1 糖尿病模型制作[4，5] 用ph4.4的0.1mol/l枸櫞酸鈉緩沖液新鮮配制stz溶液，按45mg/kg每日給50只小鼠行腹腔注射，連續(xù)5d。注射后小鼠自由飲水、進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料;每周1次采尾靜脈血測(cè)定小鼠全血血糖值，空腹血糖值在12mmol/l以上的小鼠為糖尿病模型。
1.2.2 動(dòng)物分組與opc給藥 stz末次注射后2周，取40只糖尿病小鼠分為4組，每組10只，每天上午禁食2h后灌胃給藥：①opc低劑量組：opc粉劑溶于蒸餾水按50mg/kg體質(zhì)量給藥;②opc中劑量組：opc 100mg/kg體質(zhì)量;③opc高劑量組：opc 150mg/kg體質(zhì)量;④糖尿病模型對(duì)照組和作為⑤組的正常對(duì)照小鼠(10只)灌胃等容量蒸餾水。
1.2.3 主要觀測(cè)指標(biāo) 試驗(yàn)過(guò)程中注意觀察動(dòng)物飲水量、進(jìn)食量、尿量和體質(zhì)量的變化及糖尿病癥狀表現(xiàn);4周末小鼠空腹摘眼球取血，3000rmp/min離心分離血清，按試劑盒要求操作，檢測(cè)血清tc、tg、hdlc、ldlc含量;處死小鼠取胰腺標(biāo)本，4%多聚甲醛固定、石蠟包埋切片、脫蠟水化、微波抗原修復(fù)后，按sp試劑盒要求進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色(抗小鼠胰島素抗體工作濃度為1∶300)、dab顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、透明，中性樹(shù)脂封片，最后顯微鏡觀察、拍照。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組間差異性檢驗(yàn)用spss11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。p<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
2 結(jié) 果
2.1 opc對(duì)dm小鼠癥狀的影響 試驗(yàn)過(guò)程中觀察到t1dm模型組多飲、多食、多尿、體質(zhì)量減輕等糖尿病癥狀典型并在試驗(yàn)過(guò)程中加重，而opc各組以上癥狀明顯較輕且體質(zhì)量仍有緩慢增加，表明opc具有緩解和改善糖尿病癥狀的作用。
2.2 opc對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血脂的影響 糖尿病模型組表現(xiàn)為高血脂癥，與正常組相比，血清tc、tg、ldlc顯著增高(p< 0.01，p <0.05)，hdlc降低但不具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05);與dm組比，opc組血清tc、tg、ldlc降低(p< 0.01，p<0.05)，表明opc主要降低tc、tg、ldlc，并以中、高劑量作用較大，但對(duì)hdlc的影響不明顯，見(jiàn)表1。 表1 opc對(duì)糖尿病小鼠血脂含量的影響注：與正常對(duì)照組比較，*p<0.05，**p<0.01;與模型對(duì)照組比較，p<0.01，p<0.01。
2.3 胰腺免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 顯微鏡下可見(jiàn)正常小鼠胰腺組織胰島數(shù)目多，呈圓形或橢圓型，結(jié)構(gòu)完整;t1dm組胰島數(shù)目明顯減少，形態(tài)結(jié)構(gòu)改變甚至被破壞， 有不同程度的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。(第89頁(yè)彩色圖版ⅰ之)圖1示正常對(duì)照組胰島結(jié)構(gòu)完整，胰島細(xì)胞呈深棕色，著色部位在胞漿，胰島素高表達(dá);(第89頁(yè)彩色圖版ⅰ之)圖2示模型組胰島結(jié)構(gòu)破壞，多量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，僅少量胰島細(xì)胞著色，胰島素表達(dá)明顯減少;(第89頁(yè)彩色圖版ⅰ之)圖3示opc組，胰島結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，胰島細(xì)胞著色淺但著色細(xì)胞明顯多見(jiàn)，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)較少，表明由stz誘導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)有所減輕，胰島素分泌增加。
3 討 論
stz小劑量多次注射stz選擇性破壞動(dòng)物胰島細(xì)胞， 使之釋放自身抗原成分刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生自身抗體，胰島b細(xì)胞進(jìn)行性損害，胰島素合成受阻、缺乏， 導(dǎo)致自身免疫性1型糖尿病的發(fā)生。而胰島素不足，脂肪組織攝取葡萄糖及從血中移出甘油三酯減少，脂肪合成減少;脂蛋白酯酶活性低下，血游離脂肪酸和甘油三酯濃度升高則引起糖尿病的脂代謝紊亂[6] 。本試驗(yàn)表明，糖尿病小鼠脂代謝明顯異常，tc、tg和ldlc顯著升高，hdlc也有降低;opc早期用藥能顯著降低糖尿病小鼠血中甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇，改善糖尿病小鼠的脂代謝異常。其作用機(jī)理可能是通過(guò)對(duì)糖尿病小鼠胰島β細(xì)胞的修復(fù)作用，促進(jìn)胰島素分泌功能，從而起到減輕小劑量多次注射stz所誘導(dǎo)的胰島自身免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)脂代謝和改善癥狀的作用。由于脂代謝紊亂是糖尿病腎病和心血管病等并發(fā)癥的高危因素，糾正糖脂代謝紊亂是減少和治療糖尿病并發(fā)癥的關(guān)鍵[1] ，因此opc的以上作用在減少糖尿病并發(fā)癥，尤其是心血管并發(fā)癥方面可能具有重要意義。opc目前主要用于保健品，但其作為降糖[7]、降脂及免疫調(diào)節(jié)的抗氧化藥物用途方面的研究應(yīng)用正在引起關(guān)注。鑒于我國(guó)的opc資源豐富，而糖尿病及并發(fā)癥發(fā)生率高，我們的研究對(duì)opc的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和應(yīng)用于防治糖尿病及其并發(fā)癥方面具有積極作用。
【參考文獻(xiàn)】
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第5篇：代寫(xiě)情書(shū)范文
【摘要】 目的 觀察青秦液對(duì)高尿酸血癥大鼠尿酸代謝及相關(guān)酶活性的影響。方法 將70只Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽(yáng)性藥組及青秦液大、中、小劑量組。采用灌服腺嘌呤及乙胺丁醇進(jìn)行造模。陽(yáng)性藥組按0.09 mg/kg體重灌服秋水仙堿；大劑量組給予5 g/(kg·d)青秦液灌胃，中劑量組給予2.5 g/(kg·d)青秦液灌胃；小劑量組予1.25 g/(kg·d)青秦液灌胃。采用磷鎢酸法測(cè)定血尿酸和尿尿酸，采用酶比色法測(cè)定黃嘌呤氧化酶(XOD)和腺苷脫氨酶(ADA)的含量。結(jié)果 秋水仙堿及青秦液均具有明顯降低高尿酸血癥大鼠血尿酸水平的作用，但二者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；在降低高尿酸血癥大鼠血ADA活性作用方面，陽(yáng)性藥組及青秦液大、中、小劑量組均明顯低于模型組(P＜0.05，P＜0.01)，且青秦液中、小劑量組大鼠血ADA含量明顯低于陽(yáng)性藥組(P＜0.05)；陽(yáng)性藥組及青秦液大、中、小劑量組大鼠血XOD含量均明顯低于模型組(P＜0.05，P＜0.01)。結(jié)論 青秦液具有明顯降低高尿酸血癥大鼠血尿酸水平及血ADA、XOD活性的作用；在降低高尿酸血癥大鼠血ADA活性作用方面，青秦液中、小劑量組明顯優(yōu)于陽(yáng)性藥組。
【關(guān)鍵詞】 青秦液；高尿酸血癥；尿酸代謝；代謝酶；大鼠
Abstract：Objective To observe the effect of Qingqinye on hyperuricemia uric acid metabolism and related enzymes activity. Methods Seventy Wistar rats were pided into normal group， model group， positive medicine group， Qingqinye high dosage group， Qingqinye middle dosage group and Qingqinye low dosage group. Model was made with adenine and ethambutol by gavage. Colchicine 0.09 mg/(kg·d) were administered to the rats of positive medicine group by gavage. Rats of Qingqinye high dosage group were administered Qingqinye 5 g/(kg· d)， middle dosage group were 2.5 g/(kg·d) and low dosage group were 1.25 g/kg·d by gavage. The level of serum uric acid and urinary uric acid were determined by phosphotungstic acid method. The level of XOD and ADA were determined by enzymic colorimetric method. Results Colchicine and Qingqinye significantly lowered serum uric acid level of hyperuricemia rats， while there was no significant statistical difference between them (P＞0.05). Positive medicine group， Qingqinye high dosage group， Qingqinye low dosage group and Qingqinye middle dosage group reduced blood ADA activity and better than model group (P＜0.05， P＜0.01)， what’s more， Qingqin ye middle dosage group and Qingqinye low dosage group were obviously better than positive medicine group in this respect (P＜0.05). Positive medicine group， Qingqinye middle dosage group， Qingqinye low dosage group， Qingqinye high dosage group were better than model group in reducing blood XOD activity (P＜0.05， P＜0.01). Conclusion Qingqinye can decrease the level of serum uric acid， ADA and XOD activity in rats hyperuricemia model. Qingqinye middle dosage group and Qingqinye low dosage group were better than positive medicine group in reducing blood ADA activity.
Key words： Qingqinye；hyperuricemia；uric acid metabolism；metabolic enzymes；rat
高尿酸血癥屬于復(fù)雜的多基因遺傳病?，F(xiàn)已研究證明，嘌呤代謝過(guò)程中某些酶發(fā)生基因突變，致酶活性改變，使體內(nèi)
的尿酸生成過(guò)多，或清除過(guò)低，引發(fā)高尿酸血癥。青秦液是由青蒿、秦艽、秦皮、土茯苓、車(chē)前子、虎杖、蘇木、等組成的純中藥制劑，為臨床經(jīng)驗(yàn)方。臨床觀察結(jié)果顯示，可以明顯改善高尿酸血癥血尿酸及尿尿酸水平并能調(diào)節(jié)高尿酸血癥相關(guān)酶的活性。為進(jìn)一步明確其作用機(jī)制，筆者進(jìn)行了此項(xiàng)研究。
1 實(shí)驗(yàn)材料
1.1 動(dòng)物
健康雄性Wistar大鼠70只，體重(250±10)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京) 2002-0003。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。
1.2 藥物
青秦液藥物組成：青蒿15 g，秦艽15 g，秦皮10 g，土茯苓15 g，車(chē)前子15 g，虎杖15 g，蘇木8 g，忍冬藤25 g，黃柏8 g，蒼術(shù)8 g。上述藥物由北京同仁堂有限公司提供，共煎煮2次。合并2次藥液，濃縮成2.2 g原藥材/mL，4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。腺嘌?美國(guó)Amresco，批號(hào)0183)；乙胺丁醇，杭州民生藥業(yè)集團(tuán)有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字：H33021602)。秋水仙堿，昆明制藥集團(tuán)有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字：H53021389)。
1.3 試劑
尿酸試劑盒(批號(hào)20070809)、黃嘌呤氧化酶(XOD)試劑盒(批號(hào)20070711)、腺苷脫氨酶(ADA)試劑盒(批號(hào)20070712)，均由南京建成生物工程研究所提供。
2 實(shí)驗(yàn)方法
2.1 分組、造模及給藥
將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為正常組(10只)、模型組(12只)、陽(yáng)性藥組(12只)、青秦液大劑量組(12只)、青秦液中劑量組(12只)、青秦液小劑量組(12只)。除正常組外，各組大鼠每日上午按0.2 g/kg體重灌服腺嘌呤及按0.25 g/kg體重灌服乙胺丁醇進(jìn)行造模[1]。
陽(yáng)性藥組每日下午按0.09 mg/kg體重灌服秋水仙堿；青秦液大劑量組每日下午按5 g原藥材/kg體重灌服青秦液，青秦液中劑量組每日下午按2.5 g原材料/kg體重灌服青秦液，青秦液小劑量組每日下午按1.25 g原藥材/kg體重灌服青秦液，正常組灌服等容量蒸餾水。
2.2 指標(biāo)檢測(cè)
第14、21、28日各組大鼠空腹眼眥采血，每只0.5 mL， 5 000 r/min離心10 min，分離血清，采用磷鎢酸法測(cè)各組大鼠的血尿酸值，第21天將各組大鼠留尿3 h，尿液采用磷鎢酸法測(cè)尿尿酸值。具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。同時(shí)對(duì)第28天采集的血清用酶比色法檢測(cè)血清中XOD和ADA的含量，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有部分大鼠死亡脫落。
3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)均用x±s表示。均值之間比較采用t檢驗(yàn)。
4 結(jié)果
(見(jiàn)表1～表3)表1 青秦液對(duì)高尿酸血癥大鼠血尿酸的影響(略)注：與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與正常組比較，**P＜0.01(下同)表2 青秦液對(duì)高尿酸血癥大鼠尿尿酸的影響(略)表3 青秦液對(duì)高尿酸血癥大鼠血ADA及XOD的影響(略)
5 討論
隨著基因分子生物學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)的深入發(fā)展，對(duì)本病病理機(jī)制有了全新的認(rèn)識(shí)。研究發(fā)現(xiàn)，高尿酸血癥病理機(jī)制與基因遺傳有關(guān)。尿酸是由體內(nèi)合成或核酸分解代謝產(chǎn)生，占體內(nèi)總尿酸的80%，從含嘌呤或核蛋白的食物中核苷酸分解占20%。參與尿酸代謝的嘌呤核苷酸有次黃嘌呤核苷酸(GMP)。研究表明，嘌呤代謝過(guò)程中某些酶發(fā)生基因突變，致酶活性改變，最終使體內(nèi)尿酸生成過(guò)多。嘌呤代謝催化酶發(fā)生缺陷主要包括：①磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRS)。嘌呤代謝過(guò)程中PRS活性過(guò)高可加速核糖焦磷與嘌呤核苷酸的合成，從而導(dǎo)致體內(nèi)尿酸生成過(guò)多。研究表明，鼠肝臟的PRS是由催化亞基PRS1、PRS2(34KD)和結(jié)合亞基PAP39(39KD)及PAP41 (41KD)組成的四聚體，形成PRS家族，結(jié)合亞基PAPs總的氨基酸序列與催化亞基略有不同，形成PAPs亞家族，可抑制機(jī)體催化亞基的作用。人PRS的結(jié)構(gòu)與鼠相似，有研究發(fā)現(xiàn)，編碼PRS的PRPs基因發(fā)生突變，可導(dǎo)致嘌呤核苷酸反饋抵抗的PRS活性增高。②次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核苷酸轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)。
HGPRT基因發(fā)生突變可致HGPRT活性降低，從而導(dǎo)致鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)化為鳥(niǎo)嘌呤核苷酸和次黃嘌呤轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤核苷酸減少，以致后兩者的嘌呤代謝反饋減弱，使代謝終產(chǎn)物尿酸升高。迄今已發(fā)現(xiàn)HGPRT基因編碼區(qū)1～9外顯子至少存在2 000種突變，這些突變可產(chǎn)生單純高尿酸血癥及高尿酸血癥合并復(fù)雜的神經(jīng)、行為障礙(Lesch-Nyhan綜合征)等不同的疾病形式。③亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)。目前研究證實(shí)，僅有1%～2%的原發(fā)性高尿酸血癥/痛風(fēng)與MTHFR及PRS等酶缺陷有關(guān)。近年通過(guò)對(duì)代謝綜合征相關(guān)基因多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因c677t突變與高尿酸血癥有關(guān)，是高尿酸血癥的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。此外，腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、黃嘌呤氧化酶、谷胱甘肽還原酶、葡萄糖-6-磷酸酶等酶的異常也與高尿酸血癥的發(fā)病有關(guān)[2]。
青秦液為純中藥制劑，具有清熱解毒、化瘀止痛功效，臨床對(duì)高尿酸血癥或急性痛風(fēng)發(fā)作均有良好的治療效果，能有效降低患者血尿酸水平，并有消腫止痛改善臨床癥狀的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，青秦液改善血尿酸水平、治療高尿酸血癥及其急性關(guān)節(jié)炎病理?yè)p傷的作用機(jī)制在于能有效抑制炎性介質(zhì)的過(guò)度釋放，減少炎癥反應(yīng)過(guò)程中的免疫損傷，以及調(diào)節(jié)血尿酸代謝過(guò)程中相關(guān)酶的分泌水平，從而達(dá)到糾正高尿酸狀態(tài)的目的。青秦液對(duì)ADA、XOD的作用機(jī)制及對(duì)其他相關(guān)酶作用效果和機(jī)制仍在研究中。
參考文獻(xiàn)
第6篇：代寫(xiě)情書(shū)范文
[關(guān)鍵詞] 肺炎支原體； 代謝組學(xué)； 超高效液相色譜飛行時(shí)g質(zhì)譜； 模式識(shí)別
Serum metabonomics in mice infected with mycoplasma
pneumoniae by UPLCQTOFMS
WEI Wenfeng， CHU Yantao， LIU Ye， HUO Jinhai， WANG Weiming*
（Heilongjiang Academy of Chinese Medical Sciences， Harbin 150036， China）
[Abstract] Ultra high performance liquid chromatography coupled with tandem quadrupole time of flight mass spectrometry（UPLCQTOFMS） was applied to metabonomics study in BALB/c mice infected with mycoplasma pneumoniae（MP） to analyze the changes in serum endogenous metabolites， identify potential biomarkers associated with mycoplasma pneumoniae pneumonia（MPP）， analyze the metabolic pathway and explore the pathogenic mechanism of MPP. The BALB/c mice were inoculated with MP by repeated intranasal infectious routes to establish MPP models， and the results of the lung tissue biopsy， IgM and mycoplasma nucleic acid content determination showed that the models of MP in BALB/c mice were successfully established. UPLCQTOFMS was used to analyze the serum metabolic profiling of BALB/c mice infected with MP， and then principal component analysis（PCA） was combined with orthogonal partial least squares discriminant analysis（OPLSDA） for data processing. The results showed that there were significant differences in serum metabolic profile between the MP infected mice and the normal mice. Fortyseven potential biomarkers such as ornithine， cortisol， vitamin A and tryptophan were screened out by database searching and MS information matching. These potential biomarkers related to 17 metabolic pathways including retinol metabolism， arginine and proline metabolism， steroid hormone synthesis and so on. The metabonomic research method for serum of mice infected with mycoplasma pneumoniae based on UPLCQTOFMS was established in this study. The metabolic changes of endogenous small molecules in mice infected with MP were reflected in the overall level， laying the foundation for the selection and evaluation of MPP drugs.
[Key words] mycoplasma pneumonia； metabolomics； ultraperformance liquid chromatography coupled with quadrupole timeofflight mass spectrometry； pattern recognition
肺炎支原體（mycoplasma pneumonia，MP）是引起呼吸道疾病和全身性病變的重要致病菌之一，可引起肺炎支原體肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）。它是學(xué)齡前兒童和青少年時(shí)期最常見(jiàn)的肺炎之一，發(fā)病率為19.6%～21.9%，呈逐年增加趨勢(shì)[1]。小兒肺結(jié)構(gòu)發(fā)育不完善，經(jīng)過(guò)反復(fù)感染后，極易受損。MP主要通過(guò)飛沫傳播，引起上呼吸道和肺部感染，同時(shí)引起腦炎、 心肌炎、 肝炎、 關(guān)節(jié)炎等肺外組織或器官的病變。臨床表現(xiàn)多種多樣，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)暴發(fā)型肺炎，發(fā)展迅速，最終因呼吸衰竭而死亡[2]。
MPP臨床檢測(cè)主要利用病原體培養(yǎng)法和血清學(xué)檢測(cè)確證。病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率低，病原體培養(yǎng)結(jié)果明顯滯后，并且每種診斷都有其局限性，臨床上常采用多種檢測(cè)手段聯(lián)合應(yīng)用的方式，但是仍有高達(dá)40%～50%的社區(qū)獲得性肺炎不能確定相關(guān)病原體，嚴(yán)重影響早期的抗菌藥物選擇[3]。代謝組學(xué)從整體觀出發(fā)，以機(jī)體代謝物組變化為載體，以時(shí)空動(dòng)態(tài)性和全局性觀點(diǎn)，試圖全面解析疾病對(duì)機(jī)體的影響[4]。代謝組學(xué)技術(shù)已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型評(píng)價(jià)中展現(xiàn)了其特色和優(yōu)勢(shì)[56]，但目前關(guān)于支原體肺炎代謝組學(xué)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。
本研究利用代謝組學(xué)研究方法，以MP感染小鼠血清為研究對(duì)象，采用UPLCQTOF 液質(zhì)分析，并通過(guò)化學(xué)計(jì)量學(xué)模式識(shí)別的方法，發(fā)現(xiàn)潛在的生物標(biāo)志物（potential biomaker）并鑒定，解析代謝通路。從代謝組學(xué)角度闡明MPP的致病機(jī)制，為其有效防治提供新理論，促進(jìn)治療MPP藥物的篩選和開(kāi)發(fā)。
1 材料
ACQUITYTM UPLC液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；Sciex 5600+型質(zhì)譜儀（美國(guó)AB Sciex公司）；IKA MS3 digital渦旋振蕩器（廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司）；DH5000型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒儀器有限公司）；LDZX75KB型立式蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；DLCJ1N型超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；ST16R型高速低溫離心機(jī)（美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）。
肺炎支原體國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株FH（ATCC15531，美國(guó)菌種保藏中心）；PPLO培養(yǎng)基（碧迪醫(yī)療器械有限公司）；乙醚（分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；核酸定量檢測(cè)試劑盒（廣州中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司）；甲醇（色譜級(jí)，Merck公司）；乙腈（色譜級(jí)，Merck公司）；甲酸（色譜級(jí)，Thermo Scientific）；屈臣氏蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。
BALB/c雄性小鼠20只，SPF級(jí)，體重（20±2）g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)SCXK（京）2012001。飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，環(huán)境溫度 （20±2） ℃，相對(duì)濕度 （50±20）%。
2 方法
2.1 支原體培養(yǎng)與造模方法 支原體培養(yǎng)參見(jiàn)文獻(xiàn)[7]。小鼠支原體肺炎模型采用支原體滴鼻感染方法，將20只BALB/c小鼠隨機(jī)分為空白組和模型組，每組10只，乙醚麻醉，模型組取MP培養(yǎng)液20 μL緩慢滴入BALB/c小鼠鼻孔內(nèi)，每日1次，連續(xù)感染3 d?？瞻捉M給予無(wú)MP的培養(yǎng)液。
2.2 樣品采集與預(yù)處理 小鼠于造模結(jié)束后24 h采集穎荊采集前禁食12 h，各組由眼眶取血，血液靜置1 h后于3 000 r?min-1離心10 min取血清，-80 ℃凍存。取血后處死小鼠，剪取左肺組織10%甲醛固定，用以病理切片觀察；剪取右肺組織用于支原體核酸定量檢測(cè)。
HE 染色實(shí)驗(yàn)：取甲醛固定的肺組織，用乙醇梯度脫水，二甲苯透明2 次，放入石蠟內(nèi)進(jìn)行包埋。蠟塊修好后固定于石蠟切片機(jī)上切片，將完全展開(kāi)的蠟片貼附于清潔載玻片上，常規(guī)HE 染色，在顯微鏡下進(jìn)行MP 特異性病變間質(zhì)性肺炎的病理組織學(xué)檢查。
血清IgMMP測(cè)定：取各組血清樣品，同時(shí)設(shè)定對(duì)照孔和標(biāo)準(zhǔn)樣品孔，每孔加入50 μL樣品，50 μL IgM結(jié)合物，室溫孵育1 h，洗去孔內(nèi)液體，加入100 μL底物，室溫孵育30 min，加入100 μL終止液，于450 nm下讀取吸光度值。
支原體核酸含量測(cè)定：取肺組織100 mg加入100 μL純水，勻漿，吸取20 μL，加入等量DNA提取液，100 ℃保溫10 min，8 000 r?min-1離心5 min，取上清液2 μL用于測(cè)定，同時(shí)設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣本、質(zhì)控樣本，測(cè)試方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)定相關(guān)程序。
代謝組學(xué)樣本測(cè)定：每個(gè)樣本取100 μL血清，加400 μL甲醇，渦旋30 s，4 ℃條件下13 000 r?min-1離心10 min，取上清液用于代謝組學(xué)分析。
2.3 色譜條件 Waters Acquity UPLC BEH C18 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相0.1%甲酸水（A）0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫，0～3 min，95%～40%A，3～4 min，40%A，4～9 min，40%～0%A，流速0.3 mL?min-1； 柱溫50 ℃；樣品倉(cāng)溫度4 ℃；進(jìn)樣量3 μL；色譜儀流出液不分流直接注入質(zhì)譜儀進(jìn)行正負(fù)離子掃描檢測(cè)。
2.4 質(zhì)譜條件 采用ESI離子源，離子化模式為電噴霧正、負(fù)離子模式，正離子掃描模式參數(shù)：離子源電壓5 500 V；離子源溫度550 ℃；霧化氣55 psi（1 psi=6.895 kPa）；輔助氣55 psi；氣簾氣35 psi；去簇電壓80 V；碰撞能量35 eV；碰撞能量擴(kuò)展15 eV；TOFMS掃描范圍80～1 500；Product Ion掃描范圍50～1 500。掃描方式：IDA設(shè)置響應(yīng)值超過(guò)100 cps的8個(gè)最高峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，并開(kāi)啟動(dòng)態(tài)背景扣除（DBS）。Analyst TF 1.6 software采集工作站；采用AB Sciex公司的CDS質(zhì)量校正系統(tǒng)在線(xiàn)校正。負(fù)離子掃描模式：離子源電壓-4 500 V；去簇電壓（DP）-80 V；碰撞能量（CE）-35 eV；其余參數(shù)同正離子掃描模式。
2.5 數(shù)據(jù)處理 將所有生物樣本的UPLCMS數(shù)據(jù)導(dǎo)入MarKerview軟件，進(jìn)行峰匹配、峰對(duì)齊、峰提取和歸一化處理，進(jìn)而進(jìn)行主成分分析（PCA）及正交偏最小二乘法判別分析（OPLSDA），并采用正交信號(hào)校正技術(shù)過(guò)濾變量信息，通過(guò)代謝軌跡變化趨勢(shì)分析模型組與空白組的差異，確定主成分和潛在生物標(biāo)志物（Marker）。利用QTOF測(cè)定各Marker的精確相對(duì)分子質(zhì)量，對(duì)所篩查的具有顯著性差異的代謝物進(jìn)行分析，計(jì)算其可能的分子式。再通過(guò)分子式檢索Human Metabolome Database（HMDB）數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)品確證的方式，鑒定潛在生物標(biāo)志物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。通過(guò)檢索代謝途徑數(shù)據(jù)庫(kù)KEGG和MetPA，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)、生物化學(xué)及分子生物學(xué)知識(shí)，探討潛在生物標(biāo)志物相關(guān)生物學(xué)意義。
3 結(jié)果
3.1 小鼠肺組織病理變化 小鼠肺組織病理切片評(píng)分系統(tǒng)由1 個(gè)0～26分的可數(shù)評(píng)分組成[8]，5 個(gè)分類(lèi)評(píng)價(jià)系統(tǒng)由管腔周?chē)?rùn)而致的細(xì)支氣管和支氣管數(shù)目、管腔周?chē)?rùn)的程度、管腔內(nèi)滲出的嚴(yán)重度、血管周?chē)?rùn)的頻度、實(shí)質(zhì)性肺炎的嚴(yán)重度合并后記分，每張切片選擇5 個(gè)視野評(píng)分?？瞻捉M支氣管、肺泡、血管等無(wú)明顯病變，上皮細(xì)胞狀態(tài)良好，肺組織中未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組支氣管中度改變，官腔有大量分泌物，肺泡上皮壞死，彌漫性細(xì)胞浸潤(rùn)，邊緣模糊，病變面積較大，肺泡腔內(nèi)伴以淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，嚴(yán)重者伴有紅細(xì)胞滲入（表1，圖1）。
3.2 血清IgM與MP核酸定量 與空白組相比，模型組血清IgM含量極顯著升高（P
3.3 小鼠血清代謝組學(xué)分析 采用UPLCMS進(jìn)行血清樣本的分離與數(shù)據(jù)采集，將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入MarkerView軟件進(jìn)行PCA無(wú)監(jiān)督分析（圖4），在正離子2個(gè)主成分（PC1：82.2；PC2：4.6）和負(fù)離子2個(gè)主成分（PC1：56.1；PC2：11.2）構(gòu)建的得分圖可直觀看出，空白組與模型組有顯著分開(kāi)趨勢(shì)。為進(jìn)一步區(qū)分不同組別差異，對(duì)2組血清代謝物進(jìn)行有監(jiān)督的OPLSDA分析（圖5），正離子模式的模型參數(shù)為R2=0.959 5，Q2=0.880 9，負(fù)離子模型參數(shù)為R2=0.986 2，Q2=0.961 4，參數(shù)顯示所構(gòu)建模型有效，可用于后續(xù)組間差異成分的尋找及分析。結(jié)合MarkerView軟件中t檢驗(yàn)包篩選在2組中有顯著性差異（P1.5倍，篩選出對(duì)分型貢獻(xiàn)較大且具有顯著性差異的離子作為潛在的生物標(biāo)志物進(jìn)行分析鑒定（圖6）。
3.4 MPP潛在生物標(biāo)志物鑒定 潛在標(biāo)志物的鑒定方法為通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜信息確定相對(duì)分子量， 利用二級(jí)質(zhì)譜信息獲得其結(jié)構(gòu)碎片信息。通過(guò)HMDB，KEGG，METLIN等多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，共推斷出47個(gè)生物標(biāo)志物，并列舉了各生物標(biāo)志物在空白組和模型組中的表達(dá)水平。與空白組相比，模型組代謝物水平升高的有20種，降低的有27種（表2）。
3.5 代謝通路分析 應(yīng)用MetPA網(wǎng)站構(gòu)建分析代謝通路，并選擇小鼠物種，將推斷的47個(gè)代謝物的HMDB編號(hào)輸入進(jìn)行代謝通路分析（圖7）。利用拓?fù)浞治?，代謝通路影響的臨界值設(shè)置為0.01，大于這個(gè)值將選擇作榍痹詰墓丶代謝通路（表3）。與支原體肺炎相關(guān)的代謝通路共涉及視黃醇代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、甾類(lèi)激素合成、色氨酸代謝、嘌呤代謝等17個(gè)代謝途徑。
3.6 生物標(biāo)志物與生化病理指標(biāo)的相關(guān)性分析 選取OPLSDA中Fold Change>2的差異變量化合物與IgM含量、MP含量及病理切片中病變面積總分進(jìn)行相關(guān)性分析，找出代謝物與病理生化指標(biāo)的相關(guān)性并列出相關(guān)系數(shù)（表4）。結(jié)果表明，5羥吲哚乙酸、2氨基辛酸、賴(lài)氨酸、L色氨酸與MP含量有極度相關(guān)性，D2羥谷氨酸、賴(lài)氨酸、L色氨酸、對(duì)甲酚與病理面積總分有極度相關(guān)性，D2羥谷氨酸、2氨基辛酸、賴(lài)氨酸與IgM含量極度相關(guān)。
4 討論
經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)摸索，本研究從生化指標(biāo)和肺組織病理指標(biāo)判斷，MPP模型動(dòng)物造模成功，進(jìn)一步利用代謝組學(xué)方法結(jié)合UPLCQTOFMS技術(shù)，研究MPP小鼠血清內(nèi)源性代謝物的變化規(guī)律。本課題組已熟練掌握肺炎支原體培養(yǎng)、測(cè)定及滴鼻感染小鼠的造模方法[8]，經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)摸索確定了肺炎支原體感染小鼠的劑量。在UPLCQTOFMS測(cè)定中，每間隔5個(gè)樣品進(jìn)樣1個(gè)QC樣品，選取QC樣品中不同保留時(shí)間段內(nèi)響應(yīng)值高的5個(gè)化合物質(zhì)控分析，選取化合物的保留時(shí)間及峰面積的RSD均小于1.0%，保證此評(píng)價(jià)方法的可靠性。利用模式識(shí)別的數(shù)據(jù)處理方式初步判定47個(gè)生物標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)其中對(duì)正常組和模型組區(qū)分貢獻(xiàn)較大的代謝物涉及了17條代謝通路。
維生素A（VA）涉及到視黃醇代謝，對(duì)維持視覺(jué)并促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用，另外可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)[9]。VA的缺乏可引起氣管、支氣管上皮細(xì)胞發(fā)育受阻，細(xì)胞脫落，氣道上皮完整性遭到破壞。本研究中，模型組VA水平降低，提示MPP可引起VA水平下降，進(jìn)而導(dǎo)致氣道上皮完整性的破壞和機(jī)體免疫功能下降。
鳥(niǎo)氨酸和乙酰氨基丁酸涉及精氨酸和脯氨酸代謝，本研究中模型組小鼠的鳥(niǎo)氨酸水平降低，鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)化作用增強(qiáng)，乙酰氨基丁酸水平降低，說(shuō)明聚肽類(lèi)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化的作用下降，提示腐胺等聚肽類(lèi)水平升高，直接或間接影響細(xì)胞的pH[10]。文獻(xiàn)報(bào)道，在小鼠哮喘模型的肺組織中聚肽類(lèi)水平有所增加。同時(shí)因?yàn)閂A的缺乏，氣道上皮的損傷和脫落，炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)等，氣道壁結(jié)構(gòu)易發(fā)生改變，氣道動(dòng)力出現(xiàn)滯緩，在一定程度上導(dǎo)致了支原體肺炎患者的哮喘癥狀。
色氨酸涉及色氨酸代謝，體內(nèi)氨基酸作為蛋白質(zhì)合成原料及分解代謝產(chǎn)物，參與多種生理和病理過(guò)程，其水平的高低往往可以反映機(jī)體的代謝情況。色氨酸是人體必需氨基酸之一，在肝臟以外，色氨酸主要通過(guò)降解為犬尿氨酸進(jìn)行代謝，該過(guò)程受吲哚胺2，3雙加氧酶（IDO）影響，IDO是色氨酸犬尿氨酸轉(zhuǎn)化途徑的限速酶，炎癥因子干擾素γ（IFNγ）是其誘導(dǎo)劑[11]。本研究中，模型組色氨酸水平降低，加速了色氨酸犬尿氨酸途徑，提示機(jī)體炎癥明顯。
次黃嘌呤和尿酸涉及嘌呤代謝，嘌呤是動(dòng)物基因結(jié)構(gòu)的一部分，在機(jī)體中起著代謝調(diào)節(jié)、能量供應(yīng)等重要作用。次黃嘌呤和尿酸是腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的代謝產(chǎn)物，其中，次黃嘌呤來(lái)自一磷酸腺苷的分解代謝，該過(guò)程受氧氣含量影響較大，缺氧時(shí)，一磷酸腺苷會(huì)加速分解，導(dǎo)致次黃嘌呤含量在血中增加[12]。本研究中，模型組次黃嘌呤和尿酸含量升高，可能由于肺組織充血、水腫等，導(dǎo)致氣管和支氣管管壁增厚，管腔變得狹窄，進(jìn)而影響通氣，同時(shí)肺泡腔因?yàn)闈B出阻礙氣體交換，從而引起缺氧環(huán)境而致。
綜上所述本研究采用UPLCQTOFMS技術(shù)結(jié)合模式識(shí)別數(shù)據(jù)分析手段，進(jìn)行了小鼠支原體肺炎的血清代謝組學(xué)研究。共標(biāo)識(shí)了47種生物標(biāo)志物，并且呈現(xiàn)一定的上調(diào)或下調(diào)趨勢(shì)，這些生物標(biāo)志物涉及17條代謝通路，其中視黃醇代謝、精氨酸與脯氨酸代謝、甾類(lèi)激素合成等代謝途徑與肺組織損傷、炎癥反應(yīng)、免疫抑制有密切關(guān)聯(lián)。本研究從整體水映了支原體肺炎內(nèi)源性小分子的代謝變化，有助于MPP代謝網(wǎng)絡(luò)的全面構(gòu)建及疾病診斷，為抗MPP藥物的選擇與評(píng)價(jià)奠定了基礎(chǔ)。
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