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【摘要】
目的利用膜分離技術(shù)分離純化白藜蘆醇，減少污染。方法虎杖苷液態(tài)發(fā)酵后濃縮，用60%的乙醇以1∶8的料液比在常溫下提取，過(guò)濾得到濾液，然后將濾液用兩級(jí)膜進(jìn)行處理，用高效液相色譜（HPLC）法檢測(cè)白藜蘆醇的純度。結(jié)果經(jīng)微濾膜處理后白藜蘆醇的純度達(dá)30.5%，再經(jīng)超濾膜處理，純度達(dá)55.8%。結(jié)論該方法可降低生產(chǎn)成本，不使用有毒有害的溶劑，實(shí)現(xiàn)清潔生產(chǎn)。
【關(guān)鍵詞】 膜分離技術(shù)； 白藜蘆醇； 清潔生產(chǎn)
Abstract：ObjectiveThe membrane separation technology used in the purification of resveratro and reducing pollution were studied. Methods After liquid state fermentation， resveratro was extracted by 60% ethanol at room temperature， solid/liquid ratio 1:8， the filtrate was obtained by filtering， and dealt it with two membrane equipments ， the purity of resveratrol was detected by HPLC . ResultsThe purity of Resveratro reached 30.5% after the microfiltration membrane， and after the ultrafiltration membrane the purity of resveratro could reach 55.8%.ConclusionThis method can reduce the cost of production without toxic and harmful solvents and it can realize clean production.
Key words：Membrane separation technology； Resveratro； Clean production
虎杖苷是蓼科蓼屬虎杖干燥根莖中的一種有效成分，也可稱(chēng)為白藜蘆醇苷。虎杖苷在植物中分布廣，含量高，具有較強(qiáng)的生物活性?；⒄戎械幕⒄溶盏暮吭?%左右［1］。白藜蘆醇也是虎杖的有效成分之一，其含量在0.1%～0.2%之間，屬于多酚類(lèi)化合物。白藜蘆醇有化學(xué)抗癌活性，同時(shí)具有抑制血小板凝聚、保護(hù)缺血器官、抗氧化及抑菌等重要的作用［2］，是目前世界上一種最新的藥用保健活性物質(zhì)。目前，該產(chǎn)品國(guó)際市場(chǎng)需求量大，具有良好的市場(chǎng)前景。傳統(tǒng)純化白藜蘆醇的方法主要是大孔樹(shù)脂吸附，這種方法主要存在原料消耗大、產(chǎn)品純度不高、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、使用有毒化學(xué)物質(zhì)多、污染大等缺點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)利用膜分離技術(shù)純化白藜蘆醇。報(bào)道如下。
1 材料和方法
1.1 儀器、原料、試劑和設(shè)備虎杖苷粗提物（粉末狀，虎杖苷含量14.78%）；白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品（成都思科華有限責(zé)任公司）；乙醇（工業(yè)純）；HPLC：戴安VWD3100(配有：紫外檢測(cè)器單通道LPG3400四元梯度泵真空脫氣機(jī)自動(dòng)進(jìn)樣器柱溫箱浙大化學(xué)工作站)； AN0298分析天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）； 膜設(shè)備HGDM-1（湖北工業(yè)大學(xué)膜技術(shù)研究所研制）； 膜設(shè)備HGDM-2（湖北工業(yè)大學(xué)膜技術(shù)研究所研制）。
1.2 方法
1.2.1 白藜蘆醇的HPLC法檢測(cè)色譜柱C18柱（4.6 mm×150 mm）， 柱溫25 ℃；流動(dòng)相甲醇-水為40∶60；流速1 ml/min；進(jìn)樣量20 μl；檢測(cè)波長(zhǎng)305 nm。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣的峰面積和進(jìn)樣濃度作回歸曲線，白藜蘆醇的回歸方程為Y = 1.40×108X +1.21×104，相關(guān)系數(shù)r=0.999 913，在20 ～100 μg/ml范圍內(nèi)和峰面積呈線性關(guān)系；虎杖苷的回歸方程為Y=9.61×107X-1.84×105，相關(guān)系數(shù)為r＝0.999 82，在20 ～100 μg/ml范圍內(nèi)和峰面積呈線性關(guān)系。
1.2.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程白藜蘆醇分離純化流程見(jiàn)圖1。
圖1 兩級(jí)膜分離純化白藜蘆醇流程圖（略）
虎杖苷液態(tài)發(fā)酵后濃縮，用60%的乙醇以1∶8的料液比在常溫下提取，過(guò)濾得到濾液，然后將濾液連續(xù)投入微濾膜裝置中，收集其濾液，再將濾液投入超濾膜裝置中，收集其濾液。超濾膜的濃縮液中含有大黃素，可以回收利用。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中分別記錄時(shí)間、操作壓力、溫度、膜通量等數(shù)據(jù)。
1.2.3 膜的清洗本實(shí)驗(yàn)完成后，微濾膜和超濾膜需要清洗，以恢復(fù)膜的水通量。先用復(fù)合清洗劑清洗 ，然后用次氯酸鈉漂洗，最后用清水洗至中性。觀察膜清洗前后的通量變化情況。
2 結(jié)果
2.1 微濾膜除雜的結(jié)果取物料5 kg進(jìn)行提取，得到提取液79 kg。取一定量的提取液烘干，再用HPLC檢測(cè)，白藜蘆醇的純度為8.7%。將提取液連續(xù)投入微濾膜裝置中，出料71.4 kg，用時(shí)5.88 h，平均通量為60.70 L·m-2·h-1。我們考察了微濾膜在進(jìn)口壓力為0.9 MP，出口壓力為0.7 MP，操作溫度控制在45℃左右，流速為4.0 m/s的條件下，膜通量隨時(shí)間的變化關(guān)系。見(jiàn)圖2。
由圖2可以看出，開(kāi)始運(yùn)行時(shí)，膜的通量為124.2 L·m-2·h-1，由于冷的料液的加入，系統(tǒng)的溫度有所降低，所以通量有所下降。隨著運(yùn)行時(shí)間的延長(zhǎng)，溫度恒定，由于濾餅的形成和膜的壓實(shí)作用或膜被污染、膜孔被堵塞，造成水通量開(kāi)始慢慢衰減。衰減到一定程度后，由于膜表面形成了穩(wěn)定的凝膠層，通量趨于穩(wěn)定。停機(jī)時(shí)通量為47.3 L·m-2·h-1。
微濾膜主要是截留脂肪、蛋白等一些大分子雜質(zhì)。取一定量的濾液烘干，再用HPLC檢測(cè)，白藜蘆醇的純度為30.5%，白藜蘆醇的純度得到了提高。
2.2 超濾膜濃縮分離的結(jié)果將微濾膜得到的濾液71.4 kg連續(xù)加入超濾膜裝置中，出料60.9 kg，耗時(shí)3.2 h，平均通量為11.08 L·m-2·h-1。我們研究了超濾膜在進(jìn)口壓力為1.5 MP，出口壓力為1.42 MP，操作溫度控制在40℃左右，流速為3.5 m/s的條件下膜通量隨時(shí)間變化的規(guī)律。結(jié)果見(jiàn)圖3。
圖2 微濾膜通量隨時(shí)間的變化曲線（略）
圖3 超濾膜通量隨時(shí)間的變化曲線（略）
由圖3可以看出，開(kāi)始運(yùn)行時(shí)，膜的通量為15.9 L·m-2·h-1 ，隨著運(yùn)行時(shí)間的延長(zhǎng)，膜被污染，膜孔被堵塞，通量持續(xù)下降，80 min后，通量衰減比較緩慢，停機(jī)時(shí)的通量為9 L·m-2·h-1。取一定量的濾液烘干，再用HPLC檢測(cè)，白藜蘆醇的純度為55.8%。
2.3 膜的清洗結(jié)果結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 膜清洗結(jié)果（略）
由表1可以看出膜清洗后的通量可以恢復(fù)到99%以上，所以可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)生產(chǎn)。
2.4 精制將超濾膜的濾液進(jìn)行濃縮，回收酒精，將濃縮液用石油醚萃取再結(jié)晶，此時(shí)白藜蘆醇的純度可以達(dá)到95%以上。
3 結(jié)論
膜分離技術(shù)是21世紀(jì)的一項(xiàng)高新技術(shù)，包括微濾、超濾、納濾、電滲析、反滲透、膜電解、膜蒸餾、膜萃取等各種技術(shù)［3］，具有能耗低、操作溫度低、無(wú)相變、不改變體系的化學(xué)性質(zhì)，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、占地小、操作簡(jiǎn)便易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、污染小等優(yōu)點(diǎn)。
提取液烘干后，白藜蘆醇的純度為8.7%，采用微濾膜對(duì)其進(jìn)行除雜處理，白藜蘆醇純度達(dá)到了30.5%。整個(gè)運(yùn)行過(guò)程中，膜通量較高，平均通量為60.7 L·m-2·h-1。
采用超濾膜對(duì)微濾膜濾液進(jìn)行濃縮分離處理，得到的白藜蘆醇的純度為55.8%。整個(gè)運(yùn)行過(guò)程中，膜保持良好的通量，平均通量為11.08 L·m-2·h-1。
微濾膜和超濾膜經(jīng)清洗后，膜通量恢復(fù)到原來(lái)的99%以上。
整個(gè)過(guò)程無(wú)廢水產(chǎn)生，能耗低，可降低生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)清潔生產(chǎn)的目的。
參考文獻(xiàn)
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【關(guān)鍵詞】
虎杖；白藜蘆醇；提取分離；研究
虎杖為蓼科植物虎杖的根莖，主要含有[1]蒽醌類(lèi)、二苯乙烯類(lèi)、水溶性多糖和鞣質(zhì)等成份。白藜蘆醇和白黎蘆醇苷是虎杖的主要功效成分。白藜蘆醇作為一類(lèi)親脂性多酚物質(zhì)，具有抗血小板凝聚，保護(hù)肝臟，抗腫瘤活性等藥理作用，特別是對(duì)心腦血管系統(tǒng)具有較強(qiáng)的藥理活性。本實(shí)驗(yàn)采用酶法實(shí)驗(yàn)，對(duì)虎杖中的白藜蘆醇進(jìn)行提取分離，本研究旨在為虎杖開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。
1儀器與試藥
1.1儀器Agilent1100高效液相色譜儀；AG285分析天平；KS-600d超聲清洗器；Delta320pH計(jì)；HHW420型三用恒溫水箱。
1.2試藥虎杖粉末，批號(hào)：20060829；纖維素酶，批號(hào)：F20071116；植物水解酶、植物提取酶；白藜蘆醇對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：1535-200001，純度：99.5%；甲醇、乙醇、磷酸、磷酸二氫鉀（分析純）；乙腈（色譜純）；蒸餾水。
2方法與結(jié)果
2.1白藜蘆醇的測(cè)定方法
色譜條件色譜柱ODSC18；流動(dòng)相乙腈∶水（0.02%磷酸）30∶70；流速1ml/min；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)303nm；20μl進(jìn)樣環(huán)。理論塔板數(shù)不低于3000；分離度大于1.5。精密稱(chēng)取干燥白藜蘆醇對(duì)照品330μg，置10ml容量瓶中加甲醇制成濃度33μg/ml的溶液作為對(duì)照品溶液[2]。
2.2單因素考察①試樣的制?。壕芊Q(chēng)取虎杖粉末若干份，每份約0.1g，再每份加入pH=5.0緩沖鹽溶液5ml。搖勻，在45℃酶解18h后，加入20ml95%乙醇超聲提取30min，取出放冷，定容至25ml，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液。②酶種類(lèi)的篩選：取試樣3份，1份不加酶，其他2份分別加入10mg纖維素酶和植物水解酶，并按色譜條件進(jìn)行測(cè)定，對(duì)于沒(méi)有加入任何酶的試樣，虎杖中白藜蘆醇含量為1.8/mg/g-1，加入纖維素酶試樣中白藜蘆醇含量為4.6/mg/g-1，加入植物水解酶的試樣中白藜蘆醇含量為9.1/mg/g-1。由測(cè)定結(jié)果可知，植物水解酶處理效果最好，白藜蘆醇含量最高，與不加入任何酶的試樣相比較，白藜蘆醇含量提高了4倍。③溫度的選擇：酶的活性與溫度有關(guān)，各種酶的溫度需求不同。一般來(lái)說(shuō)[3]，溫度越高，酶的反應(yīng)速度越快，但當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，部分酶可能會(huì)失去活性，一般酶的酶解溫度是在30℃～60℃左右，故在實(shí)驗(yàn)中分別選取30℃、40℃、50℃和60℃四個(gè)溫度段。取試樣4份試樣，分別置于不同的溫度段中，30℃時(shí)，白藜蘆醇回收率為0.82%；40℃時(shí)，白藜蘆醇回收率為1.57%；50℃時(shí)，白藜蘆醇回收率為1.49%；當(dāng)是60℃時(shí)，白藜蘆醇回收率為1.31%，由此可見(jiàn)，酶解的最適宜溫度為40℃左右。④酶解時(shí)間的選擇：根據(jù)酶的活性及溫度需求，還要找出酶解的時(shí)間。取4份試樣，分別進(jìn)行3h，5h，7h，9h時(shí)間的酶解，經(jīng)過(guò)不同的時(shí)間段后，3h后的白藜蘆醇回收率為0.52%，5h后的白藜蘆醇回收率為1.32%；7h后的白藜蘆醇回收率為1.79%；9h后的白藜蘆醇回收率為1.38%，由以上數(shù)據(jù)可知，酶解最適宜的時(shí)間為7h。⑤酶解pH值及酶量的選擇：采用以上的方法步驟，實(shí)驗(yàn)后通過(guò)數(shù)據(jù)分析可知，虎杖專(zhuān)用酶最適酶解pH=3.0，酶含量為原藥材的30.0%。
3討論
近年來(lái)，隨著科技及研究的不斷進(jìn)展，人們對(duì)虎杖白藜蘆醇提取分離已取得了一定的進(jìn)展，一些新的技術(shù)和手段不斷應(yīng)用于這一領(lǐng)域，為白藜蘆醇提取提供了更科學(xué)的方法[4]。本試驗(yàn)采用的白藜蘆醇測(cè)定方法，條件比較穩(wěn)定，分離效果好，可用于虎杖及其制劑的含量測(cè)定。
參考文獻(xiàn)
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[關(guān)鍵詞] 4-羥基白藜蘆醇甲基化物；3，4，5-三甲氧基苯甲酸；格利雅試劑；縮合反應(yīng)
[中圖分類(lèi)號(hào)] R944.4 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2012）12（c）-0030-02
白藜蘆醇（resveratrol，3，4′，5-trihydroxy-trans-stilbene）即反式3，4′，5-三羥基茋，廣泛存在于虎杖、葡萄、花生等多種植物中。白藜蘆醇作為一種重要的植物抗毒素，具有抗菌、抗氧化、抗癌、抗血小板凝聚、抗艾滋病等活性[1-5]，被譽(yù)為繼紫杉醇后的第二大抗癌藥物。4-羥基白藜蘆醇（4-hydroxy resveratrol，3，4，5，4＇-四甲氧基二苯乙烯）是白藜蘆醇的羥基衍生物，實(shí)驗(yàn)證明4-羥基白藜蘆醇對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用[6-7]，且抗氧化活性遠(yuǎn)強(qiáng)于白藜蘆[8-10]，目前尚無(wú)天然動(dòng)植物提取4-羥基白藜蘆醇的報(bào)道，因此化學(xué)合成成為了制備4-羥基白藜蘆醇與其衍生物的重要方法[10-12]。但是由于多羥基的存在不易保存，一般將其進(jìn)行甲基化修飾，增強(qiáng)穩(wěn)定性，增大其生物利用度。
茋類(lèi)化合物合成方法主要有經(jīng)三苯基膦的烯烴化反應(yīng)[13]、以對(duì)甲氧基苯乙烯和3，4，5-三甲氧基苯基四氟化硼重氮鹽經(jīng)鈀催化的芳基化反應(yīng)[10]等，具有原料價(jià)格昂貴、來(lái)源不易、反應(yīng)條件苛刻、溶劑毒性大等缺點(diǎn)。本文以3，4，5-三甲氧基苯甲酸為原料，通過(guò)還原、鹵代制備3，4，5-三甲氧基氯芐，氯芐制成格利雅試劑與大茴香醛縮合制備了4-羥基白藜蘆醇的四甲基化衍生物，該路線中試劑原料均價(jià)廉易得，反應(yīng)操作簡(jiǎn)單，條件溫和。合成路線見(jiàn)圖1。
1 儀器與試藥
1.1 儀器
旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52A；循環(huán)式真空泵；X-4數(shù)字顯示顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀；ZF7三用紫外分析儀；WQF-200型傅里葉變換紅外光譜儀）；H-NMR（Varian Mercury 400核磁共振儀）；MS（Kratos MS-80型質(zhì)譜儀）。
1.2 原料與試劑
3，4，5-三甲氧基苯甲酸（張家界貿(mào)源化工有限公司）；大茴香醛，BF3/Et2O（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；NaBH4（天津市福晨化學(xué)試劑廠）；鎂（湖南匯虹試劑有限公司）；SOCl（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑均為分析純。
2 方法與結(jié)果
2.1 3，4，5-三甲氧基氯芐（3）的制備
參照文獻(xiàn)[11-12]制備化合物（4）與（3）。3，4，5-三甲氧基苯甲醇（4）的收率為92.1%，折光率為1.514；IR：3 422.00（O-H），2 940.81（C=C-H），1 593.39（C=C），1 236.50（C-O-C），1 127.03（C-O），1 061.9伯醇（C-O），829.20（1，2，3，5-四取代）。3，4，5-三甲氧基氯芐（3）的收率為94.2%，mp.59～60℃（文獻(xiàn)58～61℃）；1H-NMR（CDCl3，300 MHz），86.60（S，2H），4.42（S，2H），3.88（S，6H），3.85（S，3H）。
2.2 3，4，5-三甲氧基苯甲基氯化鎂（2）的制備
250 mL的三口燒瓶通入氮?dú)馐蛊績(jī)?nèi)空氣排盡，加入鎂條碎片（1.2 g，0.05 mol），再加少量無(wú)水四氨呋喃（THF）覆蓋鎂條，加入碘晶一粒，至溶液微沸，加入3，4，5-三甲氧基氯芐的無(wú)水THF溶液，反應(yīng)2 h，溶液呈灰綠色體系?；揖G色體系即3，4，5-三甲氧基苯甲基氯化鎂THF溶液 。
2.3 3，4，5，4＇-四甲氧基二苯乙烯（1）的合成
不經(jīng)分離，在3，4，5-三甲氧基苯甲基氯化鎂THF溶液中加入對(duì)甲氧基苯甲醛2.0 g，氮?dú)獗Ｗo(hù)，反應(yīng)1 h，加硫酸，加熱至沉淀溶解，二氯甲烷萃取，飽和碳酸氫鈉、飽和食鹽水洗滌，干燥，抽濾，濾液旋蒸除去溶劑，得白色產(chǎn)品，產(chǎn)品經(jīng)柱層析得白色結(jié)晶3，4，5，4＇-四甲氧基二苯乙烯1.27 g，收率18.4%。mp.159℃（文獻(xiàn)157℃）。1H-NMR（CDCl3）：δ 7.43～7.46（d，2H），7.0（d，1H），6.95～6.87（m，3H），6.72（s，2H），3.91（s，6H），3.87（s，3H），3.83（s，3H）；13C-NMR（CDCl3）：δ159.3， 153.4， 137.6，133.5，130.0，127.8，127.6，126.6，114.2，103.3，61.0，56.1，55.3；MS m/z 301。
3 討論
本文以廉價(jià)的3，4，5-三甲氧基苯甲酸為原料，通過(guò)還原、鹵代制備3，4，5-三甲氧基氯芐，再經(jīng)制備格利雅試劑與大茴香醛縮合制備了目標(biāo)化合物4-羥基白藜蘆醇的四甲基化衍生物，總收率15.96% 。該路線能順利實(shí)現(xiàn)4-羥基白藜蘆醇甲基化物的全合成，原料價(jià)廉易得，反應(yīng)條件溫和，操作簡(jiǎn)便。但是（1）的合成收率較低，可能是鹵代烴較活潑，在制備格利雅試劑時(shí)會(huì)生成偶聯(lián)副產(chǎn)物導(dǎo)致。該路線能為全合成4-羥基白藜蘆醇的甲基化物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
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[關(guān)鍵詞]白藜蘆醇；乙醇；自發(fā)運(yùn)動(dòng)；應(yīng)激反應(yīng)；行為
[中圖分類(lèi)號(hào)] R-332 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）08（b）-0015-04
乙醇是一種水溶性以及脂溶性都非常好的極性小分子，對(duì)包括血-腦脊液屏障在內(nèi)的各種生物膜都具有很強(qiáng)的穿透力，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的功能有顯著影響。動(dòng)物研究實(shí)驗(yàn)表明，乙醇對(duì)機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力、感覺(jué)能力乃至包括學(xué)習(xí)和記憶在內(nèi)的高級(jí)認(rèn)知功能都有損傷作用[1-4]。
斑馬魚(yú)是一種在發(fā)育生物學(xué)以及遺傳學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用的模式生物，近年來(lái)在神經(jīng)藥理學(xué)研究中的應(yīng)用也逐漸增多。急性乙醇處理對(duì)斑馬魚(yú)的神經(jīng)系統(tǒng)功能以及相關(guān)的行為學(xué)指標(biāo)也有顯著的影響[5-7]。
白藜蘆醇是一種主要來(lái)源于花生、葡萄、藍(lán)莓、虎杖等植物的天然多酚類(lèi)化合物，有明顯的生物活性，具有保護(hù)心血管系統(tǒng)、延緩衰老以及抗癌等功效，同時(shí)對(duì)于乙醇導(dǎo)致的肝臟以及神經(jīng)系統(tǒng)損傷具有一定的緩解作用[8-10]。
本研究以新興模式生物斑馬魚(yú)作為研究對(duì)象，探討白藜蘆醇處理對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)在急性乙醇作用下自發(fā)運(yùn)動(dòng)、受激運(yùn)動(dòng)的影響。
1材料和方法
1.1動(dòng)物
野生型AB型斑馬魚(yú)來(lái)源于復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院轉(zhuǎn)化中心，按照Westerfield所著的書(shū)[11]中的方法進(jìn)行養(yǎng)殖和繁殖，室溫和水溫均為（28.5±0.5）℃，每日14 h光照，10 h黑暗循環(huán)（亮燈時(shí)間：8∶00，暗燈時(shí)間：22：00）。
1.2試劑
乙醇為優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑；白藜蘆醇購(gòu)自Vetec公司；鏈霉蛋白酶購(gòu)自羅氏公司。
1.3藥物制備
1.3.1鏈霉蛋白酶制備 取1 g鏈霉蛋白酶，用22.2 ml的滅菌水溶解于50 ml離心管，密封試管，置于37℃水浴45 min，輕柔震蕩，制得濃度為45 mg/ml的鏈霉蛋白酶，分裝置于超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.2乙醇溶液制備 分別量取乙醇0.2、0.4、0.8 ml，均使用系統(tǒng)水定容至20 ml，制得濃度（v/v%）為1.0%、2.0%、4.0%的乙醇溶液。
1.3.3白藜蘆醇溶液制備 電子天平稱(chēng)取白藜蘆醇粉末0.030 g，使用系統(tǒng)水定容至1 L，制得濃度為0.03 g/L的白藜蘆醇溶液。
1.4儀器
電子天平：德國(guó)Sartorius公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司；體視顯微鏡：德國(guó)Zeiss公司；斑馬魚(yú)行為學(xué)分析系統(tǒng)：法國(guó)ViewPoint公司；細(xì)胞培養(yǎng)TC24孔板（每孔半徑r=8 mm）：上海吉泰遠(yuǎn)成生物科技有限公司。
1.5白藜蘆醇預(yù)處理
取自然繁殖的0 dPF魚(yú)卵若干顆，用鏈霉蛋白酶進(jìn)行脫膜處理。取成功脫模且狀態(tài)良好的魚(yú)卵300顆并均分為兩組，即白藜蘆醇處理組和白藜蘆醇非處理組。白藜蘆醇處理組魚(yú)卵使用0.03 g/L的白藜蘆醇溶液從0 dPF養(yǎng)殖到4 dPF，再將0.03 g/L的白藜蘆醇溶液換成系統(tǒng)水，養(yǎng)殖至5 dPF。白藜蘆醇非處理組魚(yú)卵使用系統(tǒng)水從0 dPF養(yǎng)殖到5 dPF。
1.6行為學(xué)檢測(cè)
將幼魚(yú)轉(zhuǎn)移至24孔板中，每孔1條幼魚(yú)。向孔中加入1 ml不同濃度的乙醇溶液（0.0%、0.5%、1.0%、2.0%）。將24孔板放入行為學(xué)分析系統(tǒng)箱體中。
1.7開(kāi)放曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)
斑馬魚(yú)幼魚(yú)可以在每個(gè)孔中自由游動(dòng)，由箱體內(nèi)攝像機(jī)記錄每個(gè)孔中斑馬魚(yú)幼魚(yú)的游動(dòng)軌跡。實(shí)驗(yàn)周期設(shè)置為40 min，分別是1～25 min處于光照適應(yīng)期（正常環(huán)境）、26～30 min處于光照測(cè)試期（正常環(huán)境）、31～35 min處于黑暗期、36～40 min光照恢復(fù)（正常環(huán)境）。光照期：光照強(qiáng)度為100 Lux；黑暗期：光照強(qiáng)度為0 Lux。白藜蘆醇處理組和白藜蘆醇非處理組各測(cè)試3組，所有實(shí)驗(yàn)均在9：00～16：00完成。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)室周?chē)３职察o，行為學(xué)檢測(cè)的室溫和水溫均為（28.5±0.5）℃。
1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
采用Viewpoint軟件分析開(kāi)放曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的視頻，導(dǎo)出游動(dòng)距離、平均游動(dòng)速度、游動(dòng)時(shí)間等運(yùn)動(dòng)參數(shù)，30 s/次，并輸出相關(guān)數(shù)據(jù)。主要分析第26～30分鐘光照w行分析，數(shù)據(jù)比較采用雙因素方差分析和Sidak分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)水平設(shè)為0.05，以P
2結(jié)果
2.1早期白藜蘆醇處理對(duì)急性乙醇作用下斑馬魚(yú)幼魚(yú)自發(fā)運(yùn)動(dòng)的影響
2.1.1光照期 雙因素方差分析顯示，F(xiàn)乙醇=45.96，P乙醇
2.1.2黑暗期 雙因素方差分析顯示，F(xiàn)乙醇=21.14，P乙醇
2.2早期白藜蘆醇處理對(duì)急性乙醇作用下斑馬魚(yú)幼魚(yú)對(duì)光照變化應(yīng)激的影響
在2.0%乙醇作用下，白藜蘆醇處理組和非處理組的光照游動(dòng)距離與黑暗游動(dòng)距離比值均顯著增加（P均
3討論
Karlsson等[12]給予小鼠不同濃度的乙醇，通過(guò)行為學(xué)測(cè)定發(fā)現(xiàn)低濃度乙醇能促進(jìn)小鼠的自發(fā)活動(dòng)水平，高濃度乙醇則出現(xiàn)自發(fā)活動(dòng)水平被抑制的現(xiàn)象，這與成年斑馬魚(yú)對(duì)乙醇的反應(yīng)基本一致，即在較低濃度乙醇的急性處理下表現(xiàn)出自發(fā)運(yùn)動(dòng)的增強(qiáng)，隨著乙醇濃度的逐漸增高表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)的抑制，同時(shí)失去了對(duì)環(huán)境中刺激因素的反應(yīng)[5]。本研究結(jié)果顯示，在光照環(huán)境中給予斑馬魚(yú)幼魚(yú)乙醇刺激，其自發(fā)活動(dòng)水平隨著乙醇濃度的增高而增加，這一現(xiàn)象與本研究的實(shí)驗(yàn)對(duì)象有關(guān)。5 dPF的斑馬魚(yú)幼魚(yú)已經(jīng)可以出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)[6]，但與成魚(yú)相比較，神經(jīng)系統(tǒng)并未發(fā)育完全，對(duì)乙醇濃度的敏感性較低[7]，所以會(huì)產(chǎn)生2.0%乙醇作用的斑馬魚(yú)幼魚(yú)在光照環(huán)境下自發(fā)運(yùn)動(dòng)水平上升的現(xiàn)象。
Emran等[13]的研究顯示，在斑馬魚(yú)幼魚(yú)發(fā)育到4 pPF時(shí)，野生型斑馬魚(yú)幼魚(yú)對(duì)光線的刺激已經(jīng)有相應(yīng)的反應(yīng)，即無(wú)論是光線突然從明亮變黑暗還是光線突然從黑暗變明亮，斑馬魚(yú)幼魚(yú)都會(huì)出現(xiàn)驚嚇?lè)磻?yīng)，因此，當(dāng)光線由明轉(zhuǎn)暗時(shí)，斑馬魚(yú)幼魚(yú)會(huì)出現(xiàn)游動(dòng)的增加，這與光線變化所導(dǎo)致的應(yīng)激作用相關(guān)。由于斑馬魚(yú)在黑暗中游動(dòng)多，在光亮中游動(dòng)少，因此光亮中游動(dòng)距離與黑暗中游動(dòng)距離的比值一般1，提示在高濃度乙醇作用下，斑馬魚(yú)幼魚(yú)的應(yīng)激反應(yīng)已基本消失。
Liu等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇干預(yù)可以通過(guò)其良好的抗氧化作用緩解小鼠慢性溫和應(yīng)激導(dǎo)致的抑郁癥狀，從而提高小鼠的自發(fā)活動(dòng)水平。本研究中，在中低濃度乙醇的作用下，白藜蘆醇處理組的游動(dòng)距離比值均高于非處理組，說(shuō)明白藜蘆醇預(yù)處理可以降低斑馬魚(yú)幼魚(yú)因乙醇誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)增加。Hu等[15]的研究顯示，白藜蘆醇可以緩解腦內(nèi)因可卡因戒斷導(dǎo)致的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）上升；而在高濃度乙醇作用下，白藜蘆醇處理組對(duì)應(yīng)激反應(yīng)消失的作用并不明顯，這可能與預(yù)處理的白藜蘆醇濃度有關(guān)。斑馬魚(yú)幼魚(yú)的給藥方式主要通過(guò)皮膚吸收，因此斑馬魚(yú)生活的水環(huán)境是唯一的給藥介質(zhì)，而白藜蘆醇作為天然單體化合物，其在水中溶解度較低，僅為0.03 g/L。本研究選擇該濃度為干預(yù)濃度，已發(fā)現(xiàn)其對(duì)乙醇造成的行為異常有一定的緩解作用，在進(jìn)一步的研究中可嘗試提高白藜蘆醇的給藥濃度，從而進(jìn)一步探索白藜蘆醇對(duì)神經(jīng)損傷的具體緩解途徑。
本研究中，在相同濃度乙醇的情況下，白藜蘆醇處理組的斑馬魚(yú)幼魚(yú)游動(dòng)距離均多于非白藜蘆醇處理組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Pal等[16]在白藜蘆醇對(duì)氟化物誘導(dǎo)的基因損傷的作用研究中發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇干預(yù)后腦內(nèi)多巴胺含量顯著增加，這說(shuō)明白藜蘆醇可能會(huì)通過(guò)增加多巴胺含量來(lái)增加斑馬魚(yú)幼魚(yú)的自發(fā)游動(dòng)水平。在柳富平等[17]對(duì)多巴胺和運(yùn)動(dòng)能力的研究中也驗(yàn)證了多巴胺含量增加可以提高運(yùn)動(dòng)能力這一觀點(diǎn)。
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[關(guān)鍵詞] 白藜蘆醇；椎間盤(pán)突出；盤(pán)髓核細(xì)胞；細(xì)胞因子
[中圖分類(lèi)號(hào)] R9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2013）08（c）-0057-02
腰椎間盤(pán)突出是一種慢性退行性疾病，其確切病因和病理生理機(jī)制仍不清楚[1]。目前，炎癥因素在椎間盤(pán)退變中的作用日益受到關(guān)注[2]。參與椎間盤(pán)突出的炎癥介質(zhì)有很多，包括IL-6、IL-1β、TNF-α和PGE2等[3]。IL-1β可以促使內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，還可以激活腦內(nèi)的多種酶，如COX-2、iNOS等[4]。因此，以IL-1β作為炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)物，可廣泛應(yīng)用于各種細(xì)胞模型當(dāng)中。該實(shí)驗(yàn)旨在探討白藜蘆醇對(duì)IL-1β誘導(dǎo)椎間盤(pán)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響，為研究椎間盤(pán)退行性病變的防治提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。
1 資料與方法
1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑
白藜蘆醇購(gòu)自Sigma-Adrich公司（純度>99%）。用DMSO配制成 0.2 mol/L 母液備用，使用前DMSO終濃度不高 0.1 %。IL-6和IL-8購(gòu)自深圳欣博盛生物科技有限公司。IL-1β購(gòu)自Sigma-Adrich。細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自Corning。
1.2 髓核細(xì)胞的原代培養(yǎng)
將椎間盤(pán)手術(shù)患者術(shù)體內(nèi)獲取的椎間盤(pán)組織用D-Hanks液清洗，并將髓核組織與纖維環(huán)及纖維環(huán)交界區(qū)組織剪成1 mm3的小塊， 反復(fù)洗滌后加入0.25%的胰蛋白酶消化15 min。離心洗滌后繼續(xù)用0.2% II型膠原酶消化4 h。用完全培養(yǎng)基終止消化并用200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾后，吹打成細(xì)胞懸液后接種于6孔板中，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。
1.3 實(shí)驗(yàn)分組與處理
待髓核細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度為90%左右時(shí)，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆譃榻M：①空白對(duì)照組：僅加入0.1% DMSO；②IL-1β組（陽(yáng)性對(duì)照組）：加入5 ng/mL IL-1β作用2 h；③Res組：加入終濃度為5 μmol/ L、30 μmol/L、50 μmol/L 3種濃度，按不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆謩e作用 0 h、12 h、24 h、36或48 h。培養(yǎng)中止后收集細(xì)胞，進(jìn)行測(cè)定。
1.4 ELISA檢測(cè)IL-8和IL-6的產(chǎn)生
收集感染后24孔板中細(xì)胞上清液，按照ELASA 試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)IL-8、IL-6的水平。即，100 μL細(xì)胞上清液加入到每個(gè)捕獲抗體包被的微孔板中，室溫孵育2 h。洗板后，加入100 μL檢測(cè)抗體，室溫繼續(xù)孵育2 h。隨后棄混合物，每孔加入100 μL streptavidin-HRP，室溫避光孵育20 min。最后，每孔加入100 μL底物，室溫避光孵育20 min，然后加入50 μL終止液，分光光度計(jì)檢測(cè)450 nm處OD值。
1.5 統(tǒng)計(jì)方法
采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組比較采用one-way方差分析并行Student’s t檢驗(yàn)。
2 結(jié)果
2.1 髓核細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
人椎間盤(pán)髓核組織培養(yǎng)后4 h，細(xì)胞尚未完全貼壁，形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為圓形，胞漿比例較大，細(xì)胞核清亮。繼續(xù)培養(yǎng)5～7 d后，髓核細(xì)胞開(kāi)始貼壁并轉(zhuǎn)化為梭形原代細(xì)胞且呈單層生長(zhǎng)。隨后細(xì)胞間開(kāi)始有突起相連接。15～20 d后融合成片。
2.2 不同濃度白藜蘆醇對(duì)IL-1β誘導(dǎo)髓核細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和IL-8的影響
髓核細(xì)胞未經(jīng)任何處理情況下，產(chǎn)生的IL-6和IL-8較低。IL-1β作用2 h后，IL-6和IL-8產(chǎn)生顯著增多。而細(xì)胞隨后用5 μmol/ L、30 μmol/L、50 μmol/L白藜蘆醇處理后，IL-6和IL-8含量隨著白藜蘆醇濃度的遞增而逐漸降低。見(jiàn)圖1。
2.3 白藜蘆醇不同時(shí)間對(duì)IL-1β誘導(dǎo)髓核細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和IL-8的影響
髓核細(xì)胞用5 ng/mL IL-1β作用12 h即可誘導(dǎo)較高水平的IL-6和IL-8表達(dá)。其峰值位于24 h。而采用50 μmol/L 白藜蘆醇作用后，IL-8和IL-8水平明顯低于IL-1β組。見(jiàn)圖2。
3 討論
隨著對(duì)炎性因子的深入研究，發(fā)現(xiàn)其不僅在導(dǎo)致疼痛的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而且還參與了椎間盤(pán)的退變。IL-6是一種具有許多生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，對(duì)多種細(xì)胞的生長(zhǎng)、化及基因表達(dá)都有影響，在椎間盤(pán)退行性病變中起重要作用[5]。研究顯示，突出腰椎間盤(pán)組織培養(yǎng)液中IL-6含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常椎間盤(pán)組織.腰椎間盤(pán)中的IL-6可能是通過(guò)自分泌或旁分泌方式產(chǎn)生，并作用于椎間盤(pán)自身細(xì)胞從而產(chǎn)生一系列病理效應(yīng)。和IL-6一樣，IL-8作為重要的白細(xì)胞趨化因子，對(duì)特異和非特異的免疫反應(yīng)細(xì)胞具有強(qiáng)烈的趨化作用，并能調(diào)節(jié)細(xì)胞同血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和相互作用[6]。目前發(fā)現(xiàn)IL-8是多種原因所致的缺血再灌注損傷過(guò)程和全身性失控炎癥反應(yīng)的主要炎癥因子，同時(shí)也可能參與椎間盤(pán)組織的退變[7]。
該實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示，單純的髓核細(xì)胞本身分泌IL-6和IL-8不多。給予IL-1β刺激后，其含量顯著增高。而給予白藜蘆醇預(yù)處理后，髓核細(xì)胞中IL-6和IL-8含量隨著白藜蘆醇濃度的增高而明顯降低，這表明白藜蘆醇落能夠抑制退變椎間盤(pán)組織中IL-6和IL-8的異常表達(dá)，對(duì)阻止頸椎間盤(pán)退變具有良好作用。白藜蘆醇通過(guò)阻止退變頸椎間盤(pán)炎性因子的滲出，從而阻斷了炎性因子對(duì)頸椎體的破壞作用，但究竟其影響機(jī)制如何，尚需進(jìn)一步研究。
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【摘要】 目的 探討白藜蘆醇（Resveratrol，Res）體外抑制U251、U87和SHG44腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及誘導(dǎo)凋亡的不同作用比較，驗(yàn)證Res確可導(dǎo)致U251細(xì)胞凋亡。方法 MTT比色法測(cè)量不同劑量的Res作用U251、U87和SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞24h后對(duì)增殖的影響及不同劑量的Res作用U251、U87和SHG44細(xì)胞6h、24h、48h后的影響。流式細(xì)胞儀用Annexin VFITC和PI雙染檢測(cè)U251、U87和SHG44細(xì)胞凋亡率。HE染色、Hoechst 33342熒光染色、透射電鏡(TEM)觀察U251細(xì)胞形態(tài)改變，流式細(xì)胞儀測(cè)定U251細(xì)胞的細(xì)胞周期改變。結(jié)果 Res明顯抑制U251、U87和SHG44細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖（P＜0.01）且對(duì)U87細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，U251和SHG44細(xì)胞次之；對(duì)U251細(xì)胞的抑制作用呈濃度及時(shí)間依賴(lài)性反應(yīng)；Res所致的U251 、U87和SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡為濃度依賴(lài)關(guān)系，且對(duì)U87細(xì)胞的凋亡作用強(qiáng)于U251和SHG44細(xì)胞。U251凋亡細(xì)胞的細(xì)胞周期主要發(fā)生G1期阻滯。結(jié)論 Res對(duì)U251、U87和SHG44細(xì)胞生長(zhǎng)抑制及凋亡作用以U87細(xì)胞更明顯，對(duì)U251細(xì)胞的抑制作用呈濃度及時(shí)間依賴(lài)性反應(yīng)并引起了其細(xì)胞周期改變。
【關(guān)鍵詞】 白藜蘆醇；膠質(zhì)細(xì)胞瘤；細(xì)胞凋亡
Comparison Study on Resveratrol Suppressing Human Glioma Cells Growth and Inducing Apoptosis
Key words：Resveratrol； Glioma； Apoptosis
0 引言
Res是一種多酚類(lèi)化合物，化學(xué)名為3，5，4’三羥基反均二苯代乙烯(3，5，4’trihydroxystilbene， C14H12O3)，分子量228.2 [1]。近年來(lái)對(duì)其抗腫瘤作用研究較廣泛。本研究旨在證明Res可抑制人源腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251生長(zhǎng)并導(dǎo)致其發(fā)生凋亡及細(xì)胞周期改變，探討生長(zhǎng)抑制與劑量、時(shí)間及凋亡與劑量的關(guān)系，并與Res抑制U87及SHG44腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及誘導(dǎo)凋亡的作用比較。
1 材料與方法
1.1 材料
Res購(gòu)自Sigma公司，用DMSO溶解配成200 mmol/L貯存液-20℃凍存?zhèn)溆?；U251、U87和SHG44細(xì)胞系由本研究所提供；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibico公司；胎牛血清購(gòu)自灝洋生物公司；MTT、Hoechst 33342熒光試劑盒、Annexin VFITC和PI均為Sigma公司產(chǎn)品。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
U251、U87和SHG44細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。
1.2.2 MTT法
實(shí)驗(yàn)首先進(jìn)行3種細(xì)胞Res處理24h的生長(zhǎng)狀態(tài)比較，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U251、U87和SHG44細(xì)胞，接種至96孔板內(nèi)；實(shí)驗(yàn)按3種細(xì)胞分3組，每組將Res分7個(gè)不同濃度梯度，分別為5、25、50、100、200、300、400μmol／L的處理組及濃度為0μmol／L Res 的等量DMSO的對(duì)照組，每種濃度設(shè)6個(gè)重復(fù)孔，并以空白孔調(diào)零。各組細(xì)胞培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)液換成含不同濃度Res的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h，隨后每孔加入20μl、5g/L的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，最后每孔加150μl DMSO振蕩10min，酶標(biāo)分析儀檢測(cè)490nm波長(zhǎng)的光密度值(Optical density，OD)。其次按照同樣方法進(jìn)行Res處理U251、U87和SHG44細(xì)胞6h、24h、48h的分組及其細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的MTT法OD值測(cè)量。所得數(shù)據(jù)用SPSS 10.0軟件計(jì)算均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差，并進(jìn)行方差分析，組間差異采用Dunnettt 檢驗(yàn)。
1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及Annexin VFITC 和 PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡率
消化收集200μmol/L Res處理24h的U251細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度1×106 /ml各取4ml，按常規(guī)細(xì)胞周期樣品檢測(cè)方法作程序性處理后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)；分別消化收集300、150、50、5μmol/L Res處理24h組的U251、U87和SHG44細(xì)胞和DMSO對(duì)照組的細(xì)胞，加入5μl Annexin VFITC和5μl PI于細(xì)胞懸液中避光染色10min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡的百分比，數(shù)據(jù)用multicycle分析軟件處理。
1.2.4 凋亡細(xì)胞的光鏡觀察
將U251傳代細(xì)胞接種于蓋玻片表面，培養(yǎng)24h后，換成含200μmol/L Res的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，HE染色，光鏡觀察。
1.2.5 凋亡細(xì)胞的Hoechst 33342熒光檢測(cè)
200μmol/L Res處理24h的U251細(xì)胞按熒光染色試劑盒方法逐步進(jìn)行后熒光顯微鏡下攝片。
1.2.6 凋亡細(xì)胞的TEM觀察
消化收集200μmol/L Res處理24h的U251細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)1×106 ～107，1 500r/min離心15min后，4%戊二醛固定，按常規(guī)TEM樣品作程序性處理，行TEM觀察。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料結(jié)果采用(±s)表示，組間均數(shù)的比較用t 檢驗(yàn)分析和方差分析。
2 結(jié)果
2.1 Res所致U251、U87和SHG44細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)比較
通過(guò)設(shè)計(jì)的MTT實(shí)驗(yàn)，首先比較了Res對(duì)U251、U87和SHG44細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效果，見(jiàn)圖1。隨著Res作用濃度的增加、作用時(shí)間的延長(zhǎng)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞受抑制作用越顯著，從左到右的生長(zhǎng)曲線分別為U87、U251和SHG44細(xì)胞，可以看到U87細(xì)胞在同種濃度下的受到抑制更明顯，存活率更低；MTT法分析存活率，當(dāng)前存活率=同一濃度處理組OD值均值/DMSO對(duì)照組OD值均值×100%，設(shè)DMSO對(duì)照組存活率為100%。
其次Res作用6h、24h、48h后的U251、U87和SHG44細(xì)胞的存活率見(jiàn)圖2，Res引起的3種膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用有濃度和時(shí)間的依賴(lài)關(guān)系，且有顯著差異（P＜0.01）。
2.2 Res導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞儀分析
經(jīng)300μmol/L、150μmol/L、50μmol/L Res處理24h后和DMSO對(duì)照組的U87、SHG44和U251細(xì)胞的凋亡率（包括早期及晚期凋亡）分別為52.2%、38.6%、24.4%、2.3%、40.5%、34.4%、22.7%、2.5%、43.8%、37.1%、23.3%、2.1%，有濃度依賴(lài)關(guān)系。3種細(xì)胞的凋亡率比較，可見(jiàn)不同濃度的Res作用后的凋亡率U87＞U251＞SHG44，與MTT法測(cè)得的抑制率結(jié)果相一致。DMSO對(duì)照組及150μmol／L Res處理組的U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡分布圖，見(jiàn)圖3A、B。U251的細(xì)胞周期改變， G1、G2、S期的細(xì)胞對(duì)照組分別占69.5%、2.7%、27.8%，200μmol/L Res處理組分別占76.4%、2.2%、21.4%。G1期比例升高，S、G2期比例降低，見(jiàn)圖3C、D。
2.3 形態(tài)學(xué)結(jié)果
2.3.1 HE染色
光鏡下觀察所見(jiàn)U251凋亡細(xì)胞，細(xì)胞變圓、細(xì)胞核固縮、深染，核染色質(zhì)致密，形狀不一、大小不等的團(tuán)塊邊集于核膜。
2.3.2 Hoechest 33342染色
U251凋亡細(xì)胞的熒光染色高倍鏡下觀察結(jié)果，可見(jiàn)凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核固縮，核染色質(zhì)邊集，熒光信號(hào)強(qiáng)，見(jiàn)圖4。
2.3.3 透射電鏡觀察
凋亡的U251細(xì)胞表面絨毛消失，表面光滑，細(xì)胞膜表面有出泡現(xiàn)象，線粒體崩解，胞質(zhì)濃縮，染色質(zhì)晚期碎裂，邊集。
3 討論
Res是普遍存在于葡萄屬植物中的一種物質(zhì)，是一種多酚類(lèi)化合物，已在72種植物中被發(fā)現(xiàn)。對(duì)Res藥理作用的認(rèn)識(shí)最早源自其具有抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用。近年對(duì)Res抗腫瘤活性機(jī)制的研究揭示，其在腫瘤啟動(dòng)、促進(jìn)及發(fā)展3個(gè)階段都有抗腫瘤功效。目前提出的Res抗腫瘤途徑有很多種，但機(jī)制還不是很清楚。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)Res對(duì)U251腫瘤細(xì)胞的抑制率大于凋亡率更大于死亡率，說(shuō)明Res導(dǎo)致凋亡作用不是唯一途徑。我們主要對(duì)Res導(dǎo)致U251細(xì)胞凋亡及引起其細(xì)胞周期改變進(jìn)行研究，證實(shí)Res阻滯U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期從G0/G1期進(jìn)入S期，導(dǎo)致了S期減少，并且根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道Res可通過(guò)抑制人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞 [2]、人乳腺癌MCF7細(xì)胞 [3]的細(xì)胞周期蛋白cyclin D1表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期G0/G1阻滯，并應(yīng)用周期素依賴(lài)性蛋白激酶抑制劑可以抑制Res導(dǎo)致的凋亡 [2]，由此考慮細(xì)胞周期的阻滯可能促進(jìn)了Res導(dǎo)致的凋亡性死亡，引起了腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，但是其確切的作用機(jī)制還有待我們深入的研究。
本研究證明Res對(duì)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制呈濃度和時(shí)間依賴(lài)關(guān)系，這與我們以前對(duì)SHG44 [4]、U87 [5]細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，也與文獻(xiàn)對(duì)RT2膠質(zhì)瘤 [6]、乳腺癌 [3]、前列腺癌 [7]等的報(bào)道結(jié)果一致。同時(shí)，我們也證明了Res對(duì)人源U251、U87和SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生明顯的凋亡作用，與其引起其他腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡 [6，8]的結(jié)果有相似性，都有濃度依賴(lài)關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)又證實(shí)Res對(duì)U251、U87和SHG44細(xì)胞生長(zhǎng)抑制及凋亡作用以U87細(xì)胞最明顯，這樣我們以后可以采用更為敏感的U87細(xì)胞進(jìn)行機(jī)制研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。另外，實(shí)驗(yàn)中用于溶解Res的溶劑為稀釋至1‰的DMSO溶液，對(duì)細(xì)胞不具有毒性作用，Res對(duì)正常細(xì)胞及3T3成纖維細(xì)胞沒(méi)有明顯毒性作用 [6，8]。
以上實(shí)驗(yàn)證明了Res確可抑制人源U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡，并篩選出了對(duì)Res更為敏感的U87細(xì)胞作為以后機(jī)制研究的細(xì)胞系。我們認(rèn)為加強(qiáng)Res的抗癌耙點(diǎn)研究，可以為臨床開(kāi)發(fā)新藥物提供理論依據(jù)。同時(shí)我們認(rèn)為Res作為一種天然藥物比傳統(tǒng)化療藥物有優(yōu)勢(shì)，有著很好的應(yīng)用前景。（本文圖4見(jiàn)第318頁(yè)）
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[關(guān)鍵詞]色譜法；葡萄酒；白藜蘆醇
中圖分類(lèi)號(hào)：V750 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1009-914X（2017）16-0348-01
中草藥在國(guó)家已經(jīng)擁有數(shù)千年的歷史，屬于民族的瑰寶，但是仍需要經(jīng)過(guò)大量的研究推動(dòng)中藥產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。白藜蘆醇的化學(xué)分子式是C14H12O3，是非黃酮類(lèi)多酚化合物，其相對(duì)分子質(zhì)量是228.25，這是葡萄酒中的重要組成部分，因此有益于人體的健康。野生刺葡萄中的白藜蘆醇含量很高，同時(shí)這樣的物質(zhì)還具有良好的抗癌抗菌效能，發(fā)揮出優(yōu)質(zhì)的藥理作用，受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。白藜蘆醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)具備反式和順式兩種構(gòu)象，在自然界中的白藜蘆醇主要是以反式構(gòu)象為標(biāo)準(zhǔn)，這兩種構(gòu)象能夠在一定條件下實(shí)現(xiàn)相互的轉(zhuǎn)化，例如反式構(gòu)象白藜蘆醇經(jīng)過(guò)紫外光照射之后可以及時(shí)轉(zhuǎn)化為順式異構(gòu)體，這種順式異構(gòu)體的化學(xué)構(gòu)象如圖1所示。高效液相色譜技術(shù)就是在液相和氣相色譜法發(fā)展的基礎(chǔ)上，誕生出的具有分離和檢測(cè)能力的技術(shù)，發(fā)揮出簡(jiǎn)便、快速、靈敏的特點(diǎn)，推動(dòng)了這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展，逐漸在生物工程、食品監(jiān)測(cè)、醫(yī)療制藥等多種領(lǐng)域投入使用。
1 材料和方法
1.1 儀器和試劑
1.1.1 儀器
Agilent1100系列的高效液相色譜儀器的色譜柱全部是從美國(guó)安捷倫科學(xué)技術(shù)公司引進(jìn)，MILLI-Q超純水純化系統(tǒng)主要是從美國(guó)的Millipore公司引進(jìn)，CSF-3A超聲洗清器是從上海的超聲波儀器廠購(gòu)進(jìn)。
1.1.2 試劑
白藜蘆醇對(duì)照品、甲醇、冰醋酸、雙蒸水、Triton X-100、氯化鈉、硫酸鈉、碳酸鈉、葡萄酒。
1.2 方法
1.2.1 樣品制備
1.2.1.1 白藜蘆醇對(duì)照品的配制
稱(chēng)取50g的白藜蘆醇對(duì)照品，然后適當(dāng)?shù)募尤?00毫升的甲醇溶液，經(jīng)過(guò)配制成500毫克每毫升的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，然后運(yùn)用百分之五十的甲醇溶液和標(biāo)準(zhǔn)的儲(chǔ)備液不同比例進(jìn)行混合，配制為不同濃度的對(duì)照品溶液。
1.2.1.2 葡萄酒中白藜蘆醇的提取
量取五百毫升的干紅葡萄酒，適當(dāng)?shù)募尤胛灏俸辽囊宜嵋阴ト芤?，?jīng)過(guò)充分的振動(dòng)，使其完全的融合，經(jīng)過(guò)靜置待其分層，把有機(jī)相旋轉(zhuǎn)40攝氏度之后蒸發(fā)干，殘留物應(yīng)該加入甲醇溶液定容到100毫升溶解萃取之后避光進(jìn)行保存，上機(jī)測(cè)定之前還應(yīng)該超過(guò)0.45微秒濾膜去除相應(yīng)的雜質(zhì)，獲取供試品溶液。
1.2.2 色譜條件
順式白藜蘆醇檢測(cè)波長(zhǎng)應(yīng)該保持在305納米，反式白藜蘆醇的檢測(cè)波長(zhǎng)應(yīng)該保持在320納米，柱溫控制在35攝氏度，流動(dòng)相是甲醇和百分之一乙酸按照體積比值35：65配制，流速是1.0毫升每分鐘，進(jìn)樣量是20微升。
1.2.3 平衡溫度的影響
白藜蘆醇需要在55攝氏度的平衡溫度下才能獲取到最好的萃取率，并且也能夠獲得最好的峰形，如果溫度進(jìn)一步升高，峰形可能會(huì)變得不對(duì)稱(chēng)，出現(xiàn)越來(lái)越寬的趨勢(shì)，所以在實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)該選擇55攝氏度作為平衡溫度。
1.2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)
1.2.4.1 線性關(guān)系
通過(guò)量取濃度是500mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和百分之五十的甲醇溶液配制出不同濃度對(duì)照品，濃度分別是0.2500、0.1250、0.0250、0.0125、0.0025mg/ml。通過(guò)明確量取配制好的不同濃度的對(duì)照品溶液20微升，測(cè)定出峰面積，通過(guò)進(jìn)樣濃度X和峰面積Y設(shè)置線性回歸，由此得出相應(yīng)的回歸方程。
1.2.4.2 精密度試驗(yàn)
量取1.2.1.2中的供試品溶液20微升，在經(jīng)歷了五次的重復(fù)進(jìn)樣之后，測(cè)定出白藜蘆醇的峰面積，計(jì)算出相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
1.2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)
通過(guò)量取供試品溶液的20微升，在間隔一小時(shí)測(cè)定一次之后，總計(jì)的進(jìn)樣是24次，在此之后測(cè)定出白藜蘆醇的峰面積，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)偏差。
1.2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)
量取供試品溶液共計(jì)五份，測(cè)定出白藜蘆醇的峰面積，計(jì)算出具體的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
1.3 數(shù)據(jù)分析
運(yùn)用Markerlynx ApplicationManager Version件加以分析，把保留時(shí)間范圍和偏差設(shè)置在1-30分鐘、2秒，相對(duì)分子的質(zhì)量范圍和偏差分別設(shè)置為50-1000及50ppm，把最小強(qiáng)度設(shè)置為50。
2 結(jié)果
2.1 線性關(guān)系
所獲得的回歸方程是Y=9096.6X+13.806，r=0.9998（n=5）。通過(guò)分析相應(yīng)的結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇的濃度保持在2.50-255.00μg/m L時(shí)，和峰面積始終呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。
2.2 精密度試驗(yàn)結(jié)果
供試品的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差是0.76%。
2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果
供試品的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差是0.95%，表明了在二十四小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。
2.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果
供試品峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差是0.77%，證明了此測(cè)試的重復(fù)性較好。
3 討論
中藥屬于一種相對(duì)復(fù)雜且未知的物質(zhì)體系，因此其化合物的種類(lèi)較多，數(shù)目不明確，不同的方劑含量差異較大，體現(xiàn)出復(fù)雜性。白藜蘆醇廣泛的存在于葡萄、百合與豆科植物中，體現(xiàn)出抗病毒的功效，因此被廣泛的應(yīng)用至心腦血管疾病的預(yù)防中。正是因?yàn)榘邹继J醇在食品和醫(yī)藥方面發(fā)揮出的良好功效，讓相應(yīng)的研究人員更加關(guān)注。為了解決白藜蘆醇中藥現(xiàn)代化的問(wèn)題，需要讓中藥得到國(guó)際的認(rèn)可，因此才能有針對(duì)性的開(kāi)展工作，通過(guò)運(yùn)用合理的新方法解決新問(wèn)題。高效液相色譜分離分析法在面對(duì)中藥復(fù)雜的構(gòu)成成分時(shí)，可以及時(shí)快速的完成分離純化的工作，做到省時(shí)、高效、低耗的落實(shí)，并且能夠有效的提供最佳液相色譜，二維分離方式明顯的減少了離子的抑制效應(yīng)，從而獲取到更多的樣品化合物信息，為更好的分析中藥提供了較為廣闊的平臺(tái)。
此次研究主要是通過(guò)高效液相色譜分離分析法在葡萄酒萃取白藜蘆醇的實(shí)驗(yàn)，體現(xiàn)出極好的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性，驗(yàn)證了高效液相色譜分離分析法已經(jīng)成為了當(dāng)前中藥復(fù)雜體系研究中的重要技術(shù)，因此可以為復(fù)雜體系中藥分離分析提供可靠的保障。
綜上所述，白藜蘆醇的濃度應(yīng)該在2.50-255.00μg/mL的時(shí)候和峰面積呈現(xiàn)出最佳的線性關(guān)系，其中體現(xiàn)出的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性的標(biāo)準(zhǔn)偏差都在0.76%以上。由此判斷，高效液相色譜分離分析法在葡萄酒萃取白藜蘆醇中的應(yīng)用效果顯著，體現(xiàn)出廣闊的發(fā)展前景。
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關(guān)鍵詞：肝癌；Ras相關(guān)區(qū)域家族1A；甲基化
肝細(xì)胞癌是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1， 2]。近年來(lái)DNA甲基化在肝癌的發(fā)病過(guò)程中日益受到重視，在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的作用下，胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-甲基胞嘧啶（CpG）[3]。DNA異常甲基化可導(dǎo)致多種癌基因的激活和（或）抑癌基因的失活，與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[4]。藜蘆醇是廣泛存在于各類(lèi)植物中的一種天然多酚，研究顯示其具有多重藥理作用，包括心肌保護(hù)，抑制血小板凝集，抗炎、抗氧化作用以及血管舒張等。此外，白藜蘆醇也能通過(guò)多種機(jī)制調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖，侵襲以及凋亡，因此是一種潛在的高效腫瘤預(yù)防藥物[5]。但其對(duì)肝癌細(xì)胞具有何種作用仍然不清楚。本研究旨在觀察Rev能否影響肝癌HepG2細(xì)胞系中RASSF1A基因的表達(dá)和甲基化，以此為腫瘤肝癌的預(yù)防提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料
白藜蘆醇（純度98%）為sigma產(chǎn)品；RASSF1A引物和其亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化啟動(dòng)子區(qū)購(gòu)于Integrated DNA Technology. M. SssI 甲基酶、S-腺蛋氨酸（3.2mmol/L）、10×保溫緩沖液購(gòu)于New England Biolab Inc，其余分析純?cè)噭┲饕?gòu)自生海生物工程有限公司。
1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與活性研究
人肝癌細(xì)胞系HepG2用含10%牛胎兒血清、100U/mL的青霉素以及100U/ml的鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（pH7.4）中在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前將細(xì)胞密度調(diào)整至105/mL。實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組和白藜蘆醇處理組。其中對(duì)照組加入等量的DMEM培養(yǎng)基（含終濃度低于0.1%的DMSO）。處理組加入不同濃度的白藜蘆醇在37℃下處理實(shí)驗(yàn)細(xì)胞24～72h。隨后用于MTT分析，并計(jì)算抑制率。抑制率=（對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)室OD值）/對(duì)照組OD值×100%。
1.3 Western blot與甲基化活性分析
細(xì)胞處理完畢后，離心（
1.4 DNA提取和水解
獲取1×107個(gè)Rev處理后的HepG2細(xì)胞，按照DNeasy Tissue kit （Qiagen）試劑盒操作步驟提取基因組DNA用于全細(xì)胞甲基化分析。DNA水解方法根據(jù)參考文獻(xiàn)提供的方法進(jìn)行[6]。
1.5 高效液相色譜- 電噴霧質(zhì)譜檢測(cè)
液相色譜包括HPLC 系統(tǒng)，色譜柱和預(yù)柱。流動(dòng)相為0.1%甲酸-甲醇，流速為0.2 mL/min。電噴霧離子模式為正離子，掃描范圍為m/z 100～2 000， 離子源溫度450℃， 噴霧電壓為415 kV，破簇電壓為55 V，入口電壓6 V。采用Sciex Analyst software軟件處理數(shù)據(jù)。
2 結(jié) 果
2.1 Rev增加HepG2細(xì)胞RASSF1A mRNA和蛋白表達(dá)
如圖1所示，HepG2細(xì)胞基礎(chǔ)狀態(tài)下RASSF1A表達(dá)水平較低，而經(jīng)10 μmol/L 和30 μmol/L Rev處理后，能顯著增強(qiáng)RASSF1A蛋白的表達(dá)。
圖1. Rev對(duì)HepG2細(xì)胞RASSF1A mRNA和蛋白表達(dá)的影響
1.對(duì)照組；2.10 μmol/L Rev；3.30 μmol/L Rev
2.2 Rev能降低RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)域以及全基因組和細(xì)核DNA甲基化以及DNMT1表達(dá)水平
高效液相色譜- 電噴霧質(zhì)譜結(jié)果顯示，30 μmol/L Rev處理HepG2細(xì)胞后，與對(duì)照組相比， RASSF1A啟動(dòng)子甲基化水平降低至32%，全基因組甲基化水平降低44%，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P
2.3 Rev對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響
HepG2細(xì)胞經(jīng)Rev處理后，其增殖活性收到一定程度的抑制。其中10和30 μmol/L Rev作用后，細(xì)胞存活率降至36%和24%（P
3 討 論
有證據(jù)表明Rev可能是肝癌的一種有效的預(yù)防和治療劑。但是，Rev發(fā)揮作用的分子機(jī)制仍然不清楚。本研究中，我們首次證實(shí)Rev能上調(diào)肝癌細(xì)胞中因甲基化而失活的RASSF1A基因 mRNA和蛋白的表達(dá)。同時(shí)，RASSF1A的激活還與降低其啟動(dòng)子甲基化有關(guān)。此外，本研究也發(fā)現(xiàn)Rev對(duì)HepG2細(xì)胞增殖具有抑制作用。因此，Rev可能通過(guò)抑制DNA甲基化，從而抑制肝癌生長(zhǎng)增殖。本研究發(fā)現(xiàn)Rev能在一定程度上抑制DNMT1的表達(dá)，從而通過(guò)降低RASSF1A啟動(dòng)子甲基化從而重新激活RASSF1A，這可能是其化學(xué)預(yù)防肝癌的一種新的分子機(jī)制。一些超甲基化沉默的抑癌基因，如GSTP1和MGMT，已經(jīng)被認(rèn)為在肝癌和其他癌細(xì)胞系中被外源性因素重新激活。這說(shuō)明Rev能誘導(dǎo)DNA去甲基化以及重新激活由此沉默的抑癌基因。
盡管白藜蘆醇具有多方面的正向生物學(xué)效應(yīng)，但其在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和分布仍不清楚，由于它水溶性很低，因此白藜蘆醇必須與相關(guān)蛋白結(jié)合后才能在血清中保持較高的濃度[7]。此外，對(duì)于治療性的藥物而言，其與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)合能力直接決定了其療效。因此對(duì)于臨床肝癌的治療，其制作工藝還有待進(jìn)一步完善以提高其藥理動(dòng)力學(xué)效應(yīng)。
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1.廈門(mén)市第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，福建廈門(mén) 361100； 2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義 563003
[摘要] 目的 探討反式白藜蘆醇（TR，Trans-Resveratrol）對(duì)Aβ25-35損傷大鼠海馬NMDA受體NR1、NR2A亞基表達(dá)的影響。方法 選擇經(jīng)莫式水迷宮(MWM)訓(xùn)練合格的大鼠，隨機(jī)分為6組：假手術(shù)組；模型組；TR高劑量組、TR中劑量組、TR低劑量組、安理申對(duì)照組。模型組通過(guò)在大鼠海馬內(nèi)注射Aβ25-35制模獲得，在模型組基礎(chǔ)上分別用TR高、中、低劑量TR干預(yù)獲得TR高劑量組、TR中劑量組、TR低劑量組，同時(shí)用安理申干預(yù)獲得安理申對(duì)照組，每組6只，采用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)法(real time PCR)檢測(cè)6組大鼠海馬NMDA受體NR1、NR2A表達(dá)。 結(jié)果 在MWM中模型組逃避潛伏期比TR高、中、低劑量組、安理申組和假手術(shù)組明顯延長(zhǎng)，各組NMDA受體NR1表達(dá)分別為(0.14±0.04), (1.51±0.54), (0.22±0.06), (0.37±0.08,0.61) ± 0.15)(LOW)，(0.97±0.16)(安理申)。各組NMDA受體NR2A表達(dá)分別為(0.12±0.07)、(1.72±0.34)、(0.16±0.06)、(0.21±0.08)、(0.52±0.15)、(0.67±0.16)。結(jié)論 TR可能有下調(diào)海馬NMDAR1 、NMDAR2A受體表達(dá)，從而減少海馬細(xì)胞凋亡的作用。
關(guān)鍵詞 反式白藜蘆醇；癡呆；大鼠；NMDA受體
[中圖分類(lèi)號(hào)] R725 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2014）09（c）－0011-03
海馬是學(xué)習(xí)記憶的重要腦區(qū)，是邊緣系統(tǒng)的一個(gè)部分[1]。NMDA受體是谷氨酸受體的一種亞型，參與形成突觸傳遞的長(zhǎng)時(shí)增強(qiáng)過(guò)程，參與調(diào)解神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，同時(shí)在癲癇、腫瘤等多種重要過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2-3]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的NMDA受體多達(dá)7種，包括NR1、NR2（A、B、C和D4種）、NR3（A、B2種），NR2各亞單位之間具有很好的相似性，一般將其分為2種亞群[4]。研究表明，反式白藜蘆醇(Trans-Resveratrol, TR)具有一定的抗氧化作用，在防止高血壓、動(dòng)脈硬化及提高機(jī)體免疫力方面有較好的效果[5]。
研究發(fā)現(xiàn)，利用基因敲除技術(shù)敲除NR1基因后，小鼠CA1區(qū)NMDA受體興奮性突觸后電位消失，癡呆大鼠的海馬突觸傳遞發(fā)生改變，其海馬的NR2A表達(dá)輕度上調(diào)，NR1表達(dá)明顯上調(diào)。經(jīng)TR干預(yù)后海馬及附近腦組織NR1、NR2A表達(dá)均下調(diào)[9]。因此，我們使用顱鉆鉆孔微注棒Aβ25-35注射損傷雙側(cè)大鼠海馬[7-8] ,注射TR后，觀察其對(duì)癡呆大鼠保護(hù)的效果，并檢測(cè)NMDA受體NR1、NR2A的表達(dá)情況，以探求臨床上癡呆病人理想藥物治療的實(shí)驗(yàn)研究方法，現(xiàn)報(bào)道如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
實(shí)驗(yàn)用36只雄性大鼠為本單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，體重208~225 g，平均體重215 g。反式白藜蘆醇(TR)粉劑購(gòu)自西安林禾生物技術(shù)有限公司?？辔端豳?gòu)自生工生物工程（上海）有限公司，鹽酸多奈哌齊（安理申）購(gòu)自衛(wèi)材（中國(guó)）藥業(yè)有限公司，Aβ25-35購(gòu)自SIGMA公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑、熒光液Green Supermix等PCR試劑購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司。
1.2 儀器
冷凍離心機(jī)（德國(guó)5417R）、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（TU-1810）、湘儀 H1650-W離心機(jī)，Thermo Piko Real 96 Real-time system實(shí)時(shí)PCR儀，Bioer XP Cycler普通PCR儀、雙臂腦立體定位儀（68002型RWD life science co）、顱鉆（78001型）、超微量注射棒、Morris水迷宮等。
1.3 動(dòng)物模型制備
選擇經(jīng)莫式水迷宮(MWM)訓(xùn)練合格的大鼠，隨機(jī)分為6組：假手術(shù)組；模型組；TR高劑量組、TR中劑量組、TR低劑量組、安理申對(duì)照組。模型組通過(guò)在大鼠海馬內(nèi)注射Aβ25-35制模獲得，在模型組基礎(chǔ)上分別用TR高、中、低劑量TR干預(yù)獲得TR高劑量組、TR中劑量組、TR低劑量組，同時(shí)用安理申干預(yù)獲得安理申對(duì)照組。
1.4 NMDA受體NR1、NR2A表達(dá)檢測(cè)
利用RT-PCR檢測(cè)NMDA受體NR1、NR2A的表達(dá)，方法參照檢測(cè)試劑盒進(jìn)行，PCR反應(yīng)條件采用兩步法進(jìn)行,具體步驟為：95 ℃，3 min； 65 ℃，3 min。
1.5 統(tǒng)計(jì)方法
應(yīng)用spss18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析所有數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較用Levene 檢驗(yàn)分析。
2 結(jié)果
2．1 各組NMDA受體NR1、NR2A表達(dá)
各組NRI及NR2A的表達(dá)結(jié)果見(jiàn)表1，與模型組相比，各組NR1及NR2A的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且高劑量組反式白藜蘆醇干預(yù)組的NR1的表達(dá)明顯減少，與中、低劑量反式白藜蘆醇干預(yù)組相比效果好。
2.2 TR各劑量組海馬凋亡細(xì)胞病理觀察
TR各劑量組海馬凋亡細(xì)胞病理切片結(jié)果如圖1所示，TR高劑量組海馬的凋亡細(xì)胞數(shù)明顯低于TR低劑量組、對(duì)照組及模型組，TR低劑量組海馬凋亡細(xì)胞數(shù)相對(duì)對(duì)照組及模型組較少。
3 討論
海馬是人類(lèi)腦部的重要區(qū)域，具有調(diào)解神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育的重要作用，是邊緣系統(tǒng)的一個(gè)部分，海馬受損是引起阿爾茨海默病的主要病因[6-7]。
NMDA受體是谷氨酸受體的一種亞型，參與形成突觸傳遞的長(zhǎng)時(shí)增強(qiáng)過(guò)程，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)海馬神經(jīng)元突觸內(nèi)NMDA受體被阻斷時(shí)，細(xì)胞變性死亡將會(huì)增加[8-10]。海馬中主要表達(dá)的NMDA受體有NR1和NR2A，NR1可以在細(xì)胞中單獨(dú)表達(dá)有功能的同聚受體，但對(duì)激動(dòng)反應(yīng)很小，NR2A不能單獨(dú)形成有功能的通道，只有和NR1組合才能表現(xiàn)活性，并使后者反應(yīng)明顯加強(qiáng)，所以把NR1、NR2A放一起研究并起互相印證的作用[11-13]，研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酸可能在神經(jīng)病理變化及癡呆癥狀中起重要作用，在有癡呆的大鼠甘氨酸結(jié)合能力降低,提示NMDA受體的功能缺損，Lu等[15]采用免疫印跡法分析AD 患者死后腦NR1下降39% ,NR2B下降40%，提示NMDA受體的功能缺失后, AD患者嗅內(nèi)皮質(zhì)中NR1mRNA含量較正常人下降34%，而用用高壓液相色譜分析腦組織標(biāo)本中的右旋- 天冬氨酸含量發(fā)現(xiàn)[16] AD患者的天冬氨酸較相同年齡正常對(duì)照組下降，但在神經(jīng)病理變化較小的小腦中無(wú)明顯變化，這些說(shuō)明右旋-天冬氨酸的降低可能參與NMDA受體功能下調(diào)及記憶喪失的過(guò)程。Hasanein等[17]則發(fā)現(xiàn)AD患者神經(jīng)受損區(qū)具有特異性，Aβ25-35 在AD患者腦內(nèi)堆集、產(chǎn)生神經(jīng)毒性可能是通過(guò)NMDA受體促進(jìn)氧自由基的生成所引起的[18]，所以該實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)NMDA受體含量變化，推測(cè)抗氧化藥物白藜蘆醇是否對(duì)癡呆大鼠有作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著TR劑量的增加，海馬組織NMDA受體的表達(dá)減少，癡呆癥狀有所改善，TR對(duì)癡呆大鼠海馬起到保護(hù)作用，TR對(duì)大腦海馬的保護(hù)作用可能是通過(guò)下調(diào)海馬中NMDA受體NR1及N2A的表達(dá)完成的，但其具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。
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