顯微光譜成像裝置研制實驗設計研究

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摘要：基于已完成的自組熒光顯微鏡實驗教學裝置，研制了一套通過有序控制光譜儀和振鏡實現(xiàn)顯微光譜成像的裝置，并開發(fā)了配套的光譜圖像采集分析軟件。利用該裝置完成了量子點熒光樣品的熒光光譜測量、白光照明成像和顯微光譜成像等實驗內(nèi)容。該光譜成像裝置的研制和實驗設計能幫助學生掌握光譜成像的原理、實驗操作方法和成像數(shù)據(jù)處理方法，拓展學生的研究內(nèi)容和視野，提高學生的創(chuàng)新能力。

關鍵詞：光譜成像裝置；顯微成像；熒光光譜

顯微光譜成像技術是一種通過有機整合光學顯微成像技術和光譜分析技術，給出待測樣品光學分辨率下的空間位置信息和與之相對應的光譜信息的成像探測技術。該技術實現(xiàn)了空間顯微成像分辨能力和光譜探測能力的優(yōu)勢互補，可以完成光學分辨率下的空間成像和位置定位，同時可以提供樣品的光譜成分分析以及不同光譜成分的選擇性成像。顯微光譜成像技術在生物熒光成像、醫(yī)學成像、熒光材料研制等領域都有著廣泛應用，是在這些領域中進行科研的有效實驗手段[1-6]。近些年來，如何將科學研究中常用的一些實驗技術融合到實驗教學中是高校實驗教學改革的熱點課題之一[7-8]。目前，南開大學物理實驗教學中心在已開設的物理實驗課程基礎上，依托本校優(yōu)勢學科和已設立的自制實驗教學儀器設備等項目，正在逐步將部分研究成果轉(zhuǎn)化為具體的物理實驗教學內(nèi)容，為物理實驗教學改革提供有益的嘗試?；诖耍緦嶒炛行膰L試研制了顯微光譜成像裝置，并自行編寫了該裝置的控制和成像軟件。該裝置主要通過振鏡將激發(fā)光束反射進入顯微物鏡聚焦在樣品某一位置處，此位置處的樣品經(jīng)激發(fā)后發(fā)出熒光，熒光被同一物鏡收集，透過雙色鏡后進入熒光采集光路，探測器獲取該位置處的熒光和光譜數(shù)據(jù)；通過有序控制光譜儀和振鏡，計算機將有序采集的某一區(qū)域的光譜信號和相應位置信息進行數(shù)據(jù)處理，獲得該區(qū)域樣品的顯微光譜圖像。基于該光譜成像裝置，設計了自組熒光顯微鏡、白光照明成像、熒光光譜測量和光譜成像等實驗內(nèi)容。

1光譜成像裝置的光路設計和搭建

自組顯微光譜成像裝置是基于我校物理實驗教學中心已搭建的自組熒光顯微鏡，通過在自組熒光顯微鏡光路中加入振鏡裝置實現(xiàn)對激光光束和熒光光束的位置控制，再通過編寫軟件有序控制振鏡和光譜儀之間的聯(lián)動，實現(xiàn)顯微光譜成像功能。其中，自組熒光顯微鏡的搭建可參見文獻[9]。顯微光譜成像裝置的光路設計見圖1，主要由光源光路、可控激光掃描光路和熒光收集光路等組成，具體包括激光光源、白光光源、平面反射鏡、可移動位置的平面反射鏡、雙色鏡、掃描振鏡、透鏡、物鏡、三維平移臺、熒光樣品、CMOS相機、光纖光譜儀等。光源光路包括532nm激光光源和白光光源，兩者可以通過可移動的平面反射鏡實現(xiàn)激光激發(fā)成像和白光照明成像之間的自由切換。激光光束經(jīng)雙色鏡和振鏡反射后，依次經(jīng)過透鏡、物鏡后聚焦到裝載于三維平移臺的樣品上，樣品受激發(fā)出的熒光被同一物鏡收集，經(jīng)透鏡、振鏡、雙色鏡進入后方熒光采集光路，后方的CMOS相機完成熒光圖像采集或白光照明圖像采集，光纖光譜儀完成光譜數(shù)據(jù)的采集，兩者可以通過可移動的平面反射鏡實現(xiàn)CMOS探測光路和光纖光譜儀光路的自由切換。通過計算機控制振鏡位置，進而控制激光光束聚焦位置和熒光采集位置，再通過計算機軟件有序控制振鏡和光譜儀之間的聯(lián)動，實現(xiàn)樣品的逐點掃描、光譜數(shù)據(jù)的采集和實時處理以及光譜圖像的獲得。顯微光譜成像裝置的光學元件主要從大恒光電公司和索雷博公司購置。所用的熒光樣品為CdTe\CdS量子點。整個裝置采用反射式光路，激發(fā)光路和熒光光路共用同一物鏡，且配有白光光源可以隨時完成白光照明成像，光學圖像清晰，配合三維平移臺的操作可以方便地隨時觀察大范圍樣品和定位樣品區(qū)域。該裝置的光譜測試范圍為350~1050nm，可以完成可見光到近紅外光范圍內(nèi)的光譜信號采集和分析。

2顯微光譜成像

顯微光譜圖像采集工作由自行編寫的計算機控制軟件完成。圖2是光譜成像軟件的控制流程圖。光譜成像軟件的整個工作流程如下：利用LabVIEW編寫程序，控制掃描振鏡和光譜儀；計算機主機上的主程序輸出坐標位置（Xi,Yi）給掃描振鏡，掃描振鏡的X軸驅(qū)動電機和Y軸驅(qū)動電機帶動反射鏡轉(zhuǎn)動，使光斑移動到（Xi,Yi）位置處；光纖光譜儀采集此處的熒光光譜并存儲，主程序提取光譜數(shù)據(jù)，獲得坐標（Xi,Yi）處的特定波段的熒光光譜強度值并存儲；隨后主程序輸出坐標位置（Xi+1,Yi+1）給掃描振鏡，重復后續(xù)過程，獲得坐標（Xi+1,Yi+1）處的光譜數(shù)據(jù)；依次改變坐標位置，重復上述過程N次，最終可獲得某一區(qū)域內(nèi)的樣品光譜圖像。以CdTe\CdS量子點為測試熒光樣品，襯底為石英。532nm激光光束激發(fā)樣品，可移動的平面反射鏡將熒光光路切換到光譜儀光路，熒光信號經(jīng)透鏡聚焦后通過光纖進入光譜儀完成光譜采集。圖3是光纖光譜儀采集的量子點樣品的熒光光譜曲線，采集時間10ms。從圖中可以看到，該量子點樣品的熒光峰值位于717nm處，整個熒光光譜范圍為650~800nm，半高寬72nm。為了驗證整個裝置的顯微光譜成像能力和所編控制軟件的可行性，在量子點熒光樣品上做了一個十字形的標記。首先通過光路中的可移動平面反射鏡切換成白光光源照明光路，熒光光路切換到CMOS白光照明圖像采集光路，通過三維平移臺移動樣品位置，使得十字形標記進入CMOS相機視野中，調(diào)整合適的樣品位置后，得到十字形標記所在區(qū)域的白光照明灰度值圖像，如圖4(a)所示；隨后通過搭建的顯微光譜成像裝置對該十字形標記所在區(qū)域進行熒光光譜圖像采集，設定單個光譜的采集時間為10ms，共采集10000組光譜數(shù)據(jù)，獲得的十字形標記所在區(qū)域的光譜圖像如圖4(b)所示，圖中所用顏色為偽色，對應光譜強度值。為了凸顯十字形標記所在區(qū)域的白光照明圖像和光譜圖像以便相互對照，圖4(a)和4(b)僅顯示了部分成像結(jié)果。從圖4可以看到，白光照明圖像和光譜圖像中的十字形標記均清晰可見，形狀一致，表明兩者的成像區(qū)域是同一樣品區(qū)域。圖4(b)中用紅色虛線標記的區(qū)域，其熒光光譜強度為背景強度，表明此處沒有量子點，這與圖4(a)中相同位置區(qū)域的白光照明圖像相對應，圖4(a)中顯示灰白色，表明此區(qū)域沒有量子點或量子點極少，白光光束直接被石英襯底反射進入探測光路。圖4(b)中用紅色實線標記的區(qū)域，其熒光光譜強度值較大，表明這些區(qū)域有較多的量子點聚集，這與圖4(a)中相同位置區(qū)域的白光照明圖像相對應，圖4(a)中顯示灰黑色，表明這些區(qū)域量子點較多，白光光束照射到量子點樣品上時，發(fā)生漫反射，僅有較少的白光被物鏡收集進入探測光路。因此，獲得的光譜圖像和白光照明圖像是一一對應的，表明我們的顯微光譜成像裝置和自行編寫的相應控制軟件是可以完成顯微光譜成像測試的。

3結(jié)語

在高校物理實驗教學課程中，光譜儀相關實驗是一類基礎的、已被廣泛采用的物理光學實驗[10-12]。本文通過自組顯微光譜成像裝置和相關的實驗設計，以量子點熒光光譜測量和光譜成像為著力點，將科學研究中常用的光譜分析手段和顯微成像手段融合進高校物理實驗教學中，對物理實驗教學方法和教學內(nèi)容進行了大膽的改革探索，這將幫助學生在夯實光譜儀相關的基本實驗技能和光路調(diào)節(jié)能力的基礎上，進一步拓寬科學研究視野，領會光譜成像相關技術。通過接觸振鏡和光譜儀等硬件的控制和相關軟件程序的編寫模式等方式，期望能夠培養(yǎng)和提高學生的科學素養(yǎng)和創(chuàng)新能力，為提高本科物理實驗教學水平和高校學生的培養(yǎng)質(zhì)量提供有益的思路。

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作者：劉東奇 孔勇發(fā) 單位：南開大學