酶對造紙流程中生物膜的管控
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本文作者：李洪才（編譯）
生物膜的形成會造成工業(yè)、環(huán)境和健康問題，通常會導(dǎo)致操作故障和產(chǎn)品質(zhì)量降低。紙廠的過程水中富含營養(yǎng)物質(zhì)，溫度25～45℃，是微生物迅速生長的合適介質(zhì)。以廢紙為原料時，雖然添加劑和水也可能含有少量的污染物質(zhì)，但大多數(shù)微生物是隨原料一起進入系統(tǒng)的。在生產(chǎn)過程中，水中細菌類微生物獲得了理想的生存條件，不可避免地造成大量細菌生長。由細菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)（如有機酸、硫化物和胺類化合物）和生物膜的形成會產(chǎn)生難聞的氣味和/或引起產(chǎn)品質(zhì)量問題。另外，隨著廢紙用量的增加和水循環(huán)系統(tǒng)的封閉（均能導(dǎo)致有機物負荷增加和水回路溫度升高），這些問題會使原本已經(jīng)開始惡化的水系統(tǒng)變得更為嚴重。
通常而言，生物膜可視為包裹于自產(chǎn)聚合物基體內(nèi)并黏附在惰性或活性表面的組織化的細菌群落。生物膜所能承受的殺菌劑濃度是殺死同種浮游細菌所需濃度的10～100倍，因此生物膜極難根除。出于各種目的，如保護原料、填料，阻止生物膜沉積和臭味形成，或避免設(shè)備腐蝕，通常會在各個工藝部位使用殺菌劑，如氯、溴、碘、戊二醛及其他物質(zhì)。但是，有些微生物會對殺菌劑產(chǎn)生抗藥性，這就需要研發(fā)新的微生物控制劑。另外，殺菌劑有時無法滲入生物膜并將其去除。而且，大多數(shù)抗菌劑對環(huán)境有害，可能成為水和環(huán)境污染問題的潛在來源。阻止微生物淤積的方案應(yīng)當對環(huán)境友好，應(yīng)阻止微生物與表面接觸和/或阻止群生微生物積累到可能會產(chǎn)生問題的水平，方案之一是分散劑的使用。
分散劑可作為一種單一添加劑用于過程水中，以阻止生物膜的形成，也可與微生物敏感型原料的殺菌劑處理配合使用。分散劑并不是都能殺死或抑制細菌的生長，盡管一些分散劑對能形成生物膜的細菌表現(xiàn)出選擇性抑制作用。由于這一原因，不應(yīng)該僅僅依靠細菌數(shù)量來確定分散劑最佳用量和評估它們的作用效果。分散劑可通過降低水滲透阻力、增加水分留著或通過增加起泡性影響紙張的化學(xué)性質(zhì)。用于生物膜控制系統(tǒng)的分散劑也能作用于其他的非生物膜沉積物，因此使用這些分散劑時應(yīng)該考慮其對整個造紙過程的影響。殺菌劑的另一種選擇是使用酶處理技術(shù)。酶可以通過4種不同方式影響微生物的集群和黏附：①酶會作用于沉積微生物的膠黏物，從而預(yù)防沉淀現(xiàn)象；②酶可降解生物膜基質(zhì)（通過增生形成）上的聚合物和沉積的微生物；③酶可催化表面防污化合物的釋放，這些化合物可能有毒也可能沒毒，但它們比傳統(tǒng)殺菌劑更不穩(wěn)定，應(yīng)該能夠預(yù)防有害化學(xué)品的生物富集問題；④表面集群過程中微生物細胞間的聯(lián)系可能被特定的酶所阻止。
開發(fā)用于造紙過程的有效酶產(chǎn)品主要有2種方法：①鑒定生物膜中存在的多糖，并尋找可降解它們的特定酶；②鑒定不同酶產(chǎn)品中的活性物質(zhì)，評估它們對生物膜的影響。酶模型反應(yīng)的專一性使第二種方法的技術(shù)較為復(fù)雜，增加了鑒定酶能否有效防止所有種類生物膜形成的困難。因此，包含幾種酶的配方似乎成為生物膜控制方案成功的關(guān)鍵。第二種方法還未在公開報道的研究中進行過嘗試，關(guān)于專一性酶對造紙過程中生物膜的影響的研究較少。已經(jīng)有人對果聚糖水解酶和Darazyme的系列產(chǎn)品進行過研究，Darazyme由GraceDearborn團隊研發(fā)，根據(jù)生物膜化合物的初步鑒定，隨后運用一種酶或有針對性挑選的酶混合物來降解已鑒定的多糖。本研究著重于第二種方法，對比了17種商品非專一性酶產(chǎn)品對生物膜的預(yù)防和降解能力，其中生物膜由紙廠分離出的細菌形成。
1實 驗
1.1 酶
評價了不是專門為生物膜處理而開發(fā)的17種商品酶產(chǎn)品（來自NovozymesA/S，Krogshoejvej36，DK-2880Bagsvaerd，丹麥）對生物膜的影響。表1為17種酶產(chǎn)品的主要活性。
1.2 實驗設(shè)備
使用2種連續(xù)-流動生物反應(yīng)器研究了酶對生物膜形成的影響，生物反應(yīng)器的容量為300mL（B300）和10L（B10）。這種設(shè)計旨在讓生物膜在試樣上生長，這是對1982年發(fā)明的實驗室規(guī)模Pedersen設(shè)備的改進。槽的入口通過硅管（B300）或PVC管（B10）與蠕動泵和過程水槽相連，出口循環(huán)至槽子（見圖1）。每個流動室包含10個PVC試樣，間隔為5mm。回路中液體的總?cè)萘糠謩e為300mL和10L。用離心泵輸送這些液體，流速為0.29L/s。新鮮過程水從進料槽連續(xù)泵入攪拌槽（B300：50mL/d；B10：250mL/d）。通過排出攪拌槽的過量過程水，而使過程水的總體積保持不變。通過試樣槽的水流為0.10L/s，以此保持湍流狀態(tài)。因為流體動力學(xué)條件顯著影響著生物膜的形成，而且紙廠的流體動力學(xué)條件很難在實驗室規(guī)模中再現(xiàn)，因此分別在層流和湍流2種動力學(xué)條件下研究了酶對生物膜形成的影響，從而可以通過與對照實驗的比較確定每種處理對生物膜形成的影響。
1.3 實驗流程
1.3.1 實驗室預(yù)實驗（B300）
實驗開始前，用除垢劑和乙醇將生物反應(yīng)器洗凈，再用無菌蒸餾水清洗。用丙酮和乙醇對試樣進行脫酯和殺菌處理后，用無菌蒸餾水洗滌，置于流動室內(nèi)。向生物反應(yīng)器內(nèi)接種過程水中出現(xiàn)的菌群，過程水取自某個以100%廢紙（混合廢紙，產(chǎn)品為紙板）為原料的紙廠的網(wǎng)部成形區(qū)（工廠1）。實驗在pH值6.8～7.0、30℃溫度下進行。研究了17種酶混合物。所有實驗中商品酶制劑用量均為0.1%。用B300反應(yīng)器進行了4天多的實驗，每24h打開流動室取出2個試樣。一個試樣用于測定生物膜的形成量，以105℃下干燥6h后的絕干質(zhì)量（mg/m2）為基準。另一個試樣用于測定試樣每單位面積上的菌落形成單位數(shù)量Ns（CFU/cm2）。后一種測定中，試樣用無菌鉗移出，用9mL無菌生理鹽水洗滌以去除輕微黏附的細胞和多余的水分。用無菌棉絨棒在每個試樣的一側(cè)擦除生物膜，轉(zhuǎn)移到含一定量無菌生理鹽水的小瓶中。搖晃懸浮液（20s）以分散細胞。然后對所得的每個樣品進行一系列稀釋，涂在平板計數(shù)瓊脂上。平板在30℃下培養(yǎng)48h。然后測定每平方厘米上形成的菌落形成單位數(shù)量。在相同的時間間隔內(nèi)，在生物反應(yīng)器的水介質(zhì)中無菌取樣，并測定每毫升的菌落形成單位數(shù)量Nv（CFU/mL）。在這些預(yù)實驗結(jié)果中選擇3種處理方法進一步在B10L反應(yīng)器中進行研究。
1.3.2 實驗室實驗（B10）
進行了4天多的實驗，每24h取一次水樣和試樣，根據(jù)B300實驗中的方法通過計數(shù)和稱量質(zhì)量測定試樣上的生物膜形成量。實驗采用工廠1中的過程水。這種過程水富含纖維、細小纖維和填料，取自網(wǎng)部成形區(qū)，并在15℃下貯存。在用于B10L實驗前，過程水依次用1mm、600m、400m、200m和63m過濾器過濾，類似于工廠中使用多盤過濾處理獲得澄清水。
由試樣上菌落形成單位數(shù)量總數(shù)（A）和與試樣接觸的菌落形成單位數(shù)量總數(shù)（C）的比值計算集群比（CR），如公式（1）所示。后者（C）被定義為介質(zhì)中的菌落形成單位數(shù)量總數(shù)（B）和試樣上菌落形成單位數(shù)量總數(shù)（A）之和，如公式（2）所示。A和B根據(jù)公式（3）和公式（4）確定，其中CS為試樣表面積（cm2），TVL是反應(yīng)器內(nèi)液體的總體積（mL）。采用這種方法，不同初始條件下的實驗可以進行比較。
CR（%）=AC×100% （1）C=A+B（2）A=Ns（CFU/cm2）×CS?。?）B=Nv（CFU/mL）×TLV?。?）最后，只選擇一種商品酶產(chǎn)品進行進一步實驗。首先在B10反應(yīng)器中進行10天以上的實驗。為確保細菌數(shù)量在整個實驗過程中保持恒定，每24h對介質(zhì)中的細菌進行一次計數(shù)，實驗測得過程水中的細菌濃度保持在106～107CFU/mL。通過測定沉積在試樣上的生物膜絕干質(zhì)量，每24h評估一次生物膜的積累情況。
1.3.3 中試回路試驗
為確定對阻止生物膜形成起主要作用的有效成分，還研究了2種商品酶產(chǎn)品，其包含從17種商品酶產(chǎn)品中挑選出的最有效酶產(chǎn)品。此組試驗在中試回路中進行，中試回路模擬了一個紙廠內(nèi)的過程水回路并考慮到了新鮮水的加入和多余水的去除。
中試回路包括2個由NewBrunswickScientific公司（USA）制造的生物反應(yīng)器BioFlo3000，其中1個用于測試處理效果，另一個用于對比，使細菌在一個可控環(huán)境下生長：溫度45℃，pH值7，溶解氧高達20%，湍流狀態(tài)（雷諾數(shù)>2000）。將高密度聚丙烯試樣浸入每個反應(yīng)器中，以便形成沉淀物。試驗采用的過程水取自以100%廢紙為原料生產(chǎn)書寫和印刷紙的紙廠（工廠2）。同樣，這些水取自網(wǎng)部成形區(qū)并在15℃下貯存。在用于中試試驗之前，過程水按B10L實驗所述流程進行過濾。
為測試酶處理對防止生物膜形成的能力，從試驗開始到結(jié)束的10天內(nèi)連續(xù)添加酶使其濃度保持在恒定質(zhì)量分數(shù)0.1%。每天通過干燥-再水合薄膜法（Petrifilm3MTM）測定水中好氧細菌的總?cè)郝鋽?shù)。計數(shù)結(jié)果以菌落形成單位數(shù)量（CFU/mL）表示。在試驗的最后，測定試樣上形成的生物膜總絕干質(zhì)量。
為排除酶產(chǎn)品中非酶成分的影響，用工廠2中的過程水在干凈的回路中進行變性酶試驗。酶在121℃下加熱30min后失活。試驗過程中連續(xù)加入失活酶以保持恒定質(zhì)量分數(shù)0.1%，并與對比試驗（無酶）中生物膜的形成進行了對比。在干凈回路中，采用不同用量的最佳酶產(chǎn)品進行了試驗。在3個生物反應(yīng)器中連續(xù)進行，并向生物反應(yīng)器中加入工廠2的過程水。測試了酶在3個不同的質(zhì)量分數(shù)（0.01%、0.001%和0.0001%）下的情況。第4個反應(yīng)器用于對照試驗（無酶處理）。
2結(jié) 果
2.1 實驗室預(yù)實驗
表1為酶對生物膜形成的影響（定性）。測試的17種酶中，PectinexSmash對活性菌落吸附于試樣和生物膜形成的預(yù)防效果最佳。ViscozymeL、Pulpzyme、Terminox和Bio-feedBetaL的效果次之。雖然用Novozyme863h處理時，試樣上測得的菌落形成單位數(shù)量相當少，但對生物膜的形成無阻止效果，這在意料之外。因此，選擇Novozyme863h、PectinexSmash和ViscozymeL進行進一步研究。
2.2 實驗室實驗（B10）
所選酶產(chǎn)品在B10實驗中的結(jié)果如圖2所示。圖2顯示了介質(zhì)中的菌落形成單位數(shù)量（CFU/mL）、試樣上單位面積上的活菌數(shù)量（CFU/cm2）、試樣上的生物膜絕干質(zhì)量和集群比。通過沉積在試樣上的生物膜的絕干質(zhì)量增加值和集群比來評估生物膜的形成。絕干質(zhì)量的增加是由細菌集群和胞外多糖（EPS）的生成引起的。集群比的增大表明了生物膜的形成。由圖2可知，隨著反應(yīng)時間的增加，酶的添加沒有改變介質(zhì)內(nèi)每毫升中的菌落形成單位值，這個值在所有的實驗中都保持恒定，并與對照樣品的測定值相似。這表明，所測試的酶制劑沒有所希望的殺菌效果。
當不添加酶時（對照實驗），試樣上的菌落形成單位數(shù)量和試樣上的生物膜絕干質(zhì)量都增加了，然而，介質(zhì)中菌落形成單位數(shù)量基本穩(wěn)定。這表明，細菌群集于試樣表面并生成生物膜。實際上，24h后生物膜就已經(jīng)形成，且隨著實驗的進行而增加。48h后集群比迅速增加，96h后集群比接近100%，這說明試樣生物膜上的細菌幾乎都是活的。當使用酶處理時，在開始的24h，試樣上每平方厘米內(nèi)的活性菌落形成單位數(shù)量有所增加，其值比對照實驗中得到的結(jié)果更高。這個意想不到的效果與其他研究人員的觀察結(jié)果一致，他們已經(jīng)證明，鹽類、消毒水或其他化合物、其他細菌能增加細菌的黏附作用，甚至生物膜的熟化。然而，初期增長過后，每平方厘米上的活性菌落形成單位數(shù)量保持不變（見圖2中Novozyme863和PectinexSmash的結(jié)果）；72h后甚至稍有下降（ViscozymeL的情況）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酶處理實驗中集群比保持在20%以下，且細菌在試樣表面上群集或增長的最終值比對照實驗還低。Novozyme863和ViscozymeL對沉積在試樣上的生物膜絕干質(zhì)量的影響比PectinexSmash的影響明顯要小。Novozyme863和ViscozymeL的添加不會阻止有機物在試樣上的積累，盡管它們限制了有機物的積累，且最終值比對照實驗最終值的1/2還少。然而，PectinexSmash的添加能阻止有機物在試樣上的積累，其質(zhì)量保持在0.2mg/cm2以下。此外，在整個實驗過程中集群比都較低，表明酶處理通過限制集群在試樣表面的細菌數(shù)量和減少試樣上生物質(zhì)的生成來減少試樣表面的生物膜的總量。因此，選擇PectinexSmash繼續(xù)進行中試回路試驗研究。
2.3 中試回路試驗
在中試回路試驗中，所有情況下水中的細菌含量均保持在2.3×106～7×107之間。未進行酶處理時，試驗72h后肉眼就可明顯觀察到試樣表面形成的生物膜。添加PectinexSmash時生物反應(yīng)器中試樣上沉積的生物膜絕干質(zhì)量為無酶處理時的1/4～1/3（見圖3）。因此湍流條件下，在干凈回路中添加PectinexSmash能顯著限制生物反應(yīng)器中聚丙烯試樣上生物膜的生成。
2.4 失活PectinexSmash試驗
在失活PectinexSmash試驗中，水中的細菌總數(shù)變化不明顯（107～108CFU/mL）。使用失活PectinexSmash處理和無任何處理時，未觀察到生物反應(yīng)器中試樣上沉積的生物膜絕干質(zhì)量有明顯差異（260h后測得試樣上增加的絕干質(zhì)量均在（1.4±0.3）mg/cm2范圍內(nèi)）。這些結(jié)果表明，PectinexSmash對生物膜形成的預(yù)防性能并不是由于其中的非酶成分造成的。
2.5 PectinexSmash劑量的影響
在實驗進行的190h期間，未觀察到4個生物反應(yīng)器中的細菌總數(shù)有顯著差異。24h后，無酶處理和酶用量為0.0001%的PectinexSmash處理中，肉眼可明顯觀察到生物反應(yīng)器中試樣上形成的生物膜。酶用量為0.001%和0.01%的生物反應(yīng)器中，48h后才能肉眼觀察到試樣上的生物膜。無酶處理和用量為0.0001%的PectinexSmash處理中，生物反應(yīng)器試樣上的生物膜絕干質(zhì)量很接近，表明PectinexSmash用量為0.0001%時不影響生物膜的生成（見圖4）。PectinexSmash用量為0.001%時可觀察到酶對生物膜積累的預(yù)防效果一般，使試樣上生物膜絕干質(zhì)量降低了50%。然而，酶用量為0.01%時，PectinexSmash顯著阻礙了生物膜的形成，因為此用量下試樣上的生物膜絕干質(zhì)量為無酶處理時的1/5。因此，PectinexSmarsh在用量為0.01%和0.1%時的作用效果相當。
2.6 主要酶成分的鑒定
如先前的實驗所述，由于PectinexSmash性能最佳，故進行了更多的實驗以進一步證實它對未過濾水（含有纖維、細小纖維和填料，這些物質(zhì)會影響生物膜的形成）中生物膜形成的阻止效果。PectinexSmash是一種從曲霉屬真菌中提取的產(chǎn)品，具有較寬的酶活性范圍，因為它們之間含有各種果膠活性物質(zhì)——果膠甲基酯酶。為鑒定對抑制生物膜形成起主導(dǎo)作用的活性物質(zhì)，在B10反應(yīng)器中研究了2種含有PectinexSmash活性成分的相關(guān)產(chǎn)品，即PectinexUltraSP（從曲霉屬真菌中提取的果膠酶混合物）和Novoshape（主要活性酶為從曲霉屬真菌中提取的果膠甲基酯酶）。圖5顯示了這些酶產(chǎn)品的作用效果。圖5可知，PectinexUltraSP對生物膜的形成沒有影響，而PectinexSmash處理對控制生物膜的形成是有效的，試樣上生物膜的絕干質(zhì)量為對照實驗的1/3。Novoshape處理結(jié)果表明，試樣上生物膜的絕干質(zhì)量為對照實驗的1/4。PectinexSmash和Novoshape制劑中都含有果膠甲基酯酶。因此可得出結(jié)論，果膠甲基酯酶是造成PectinexSmash具有預(yù)防和控制生物膜功能的主要酶，或至少是其中的一種酶。
3討 論
實驗結(jié)果表明，研究的17種酶產(chǎn)品中，PectinexSmash及Novoshape是預(yù)防生物膜形成的最有效方法（它們都主要由果膠甲基酯酶組成）。PectinexSmash是一種果膠酶活性成分的混合物，Novoshape是一種微生物果膠甲基酯酶溶液（PME，E.C.1.1.11）。酯酶的編碼基因來自曲霉屬真菌，可轉(zhuǎn)移到食品級微生物-米曲霉的分子鏈中，從而用于工業(yè)生產(chǎn)。Novoshape制劑的活性為10PEU/mL，最佳溫度約50℃（數(shù)據(jù)由制造商提供）。這種酶屬于碳水化合物酯酶屬，能催化甲基酯基團的水解，對果膠底物有高度選擇性，此特性在食品工業(yè)和植物學(xué)中應(yīng)用廣泛。目前，生物膜多糖的組成還不完全清楚，但關(guān)于浮游生物的胞外聚合物（EPS）和少量生物膜EPS的現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明，它們的一些單體與植物細胞壁物質(zhì)完全相同或相似。實際上已有報道稱，一些細菌EPS是酶混合物（不是來自細菌）的基質(zhì)。
Orgaz等人在關(guān)于生物膜去除的案例研究中得出結(jié)論，對于熒光假單胞菌生物膜的去除，由綠色木霉菌（與果膠甲基酯酶同屬）產(chǎn)生的果膠酯酶可能使生物基質(zhì)中的多糖去乙酰基化，使其更松軟并具有更多孔隙。許多微生物EPS具有不同的取代基，如縮酮連接的丙酮酸酯基或酯連接的乙?；?。?；?，尤其是醋酸酯的去除能顯著影響多糖的物理性質(zhì)。一種取代基的去除會影響EPS的物理特性，如乙?；?，特別是醋酸酯。
通過分泌各種酶，一些真菌可降解復(fù)雜的植物細胞壁物質(zhì)。這種多功能性使得商品多糖降解酶混合物在多種領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，如水果加工或廢水處理。它們還能用于降解細菌生物膜基質(zhì)或預(yù)防和控制造紙廠廢水管道系統(tǒng)內(nèi)生物膜的形成。因為EPS的多相性，酶混合物對生物膜的有效降解是必需的。
高效酶能夠去除浸沒在水內(nèi)的生物膜，這種方法可以與殺菌劑一起使用，本研究為這種方法的使用奠定了基礎(chǔ)。酶能生物降解且毒性低，它的使用能減少殺菌劑的使用，因而對環(huán)境友好且具有經(jīng)濟優(yōu)勢。
