堅定的錫兵精選(九篇)

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第1篇：堅定的錫兵范文

劉某于2006年經(jīng)老鄉(xiāng)介紹來到了山西省某縣的一家煤礦公司當了一名井下工人。雖說下井又累又危險，但每個月四五千的工資，干別的是不可能掙到的，劉某也沒啥技術(shù)，他就想趁著還有把子力氣，多攢點錢供孩子上學(xué)。2011年12月的一天晚上，正在井下的工作面打錨桿時，劉某的衣服不慎絞在了鉆桿上，還沒等他反應(yīng)過來，錨頭已經(jīng)重重打到了胸脯上。劉某當時就覺得胸疼得厲害，井下的班長趕緊讓其他人扶著他升井，然后送到了就近的煤礦醫(yī)院。經(jīng)診斷，劉某右側(cè)第八肋軟骨骨折。當時公司支付了住院期間的醫(yī)療費，劉某聽別人說還應(yīng)該有別的賠償，但他還想繼續(xù)在公司上班，因此沒有向公司提出賠償。劉某繼續(xù)上班后，胸部一直疼的厲害，自己買了止疼藥也沒管用，他覺得奇怪，按照醫(yī)生的說法，他現(xiàn)在恢復(fù)的還不錯，應(yīng)該不至于這么疼了，劉某有點擔(dān)心，就自己來到了醫(yī)院又做了次檢查，診斷結(jié)果為：肺大泡、肺氣腫。醫(yī)生一看檢查結(jié)果，就問他是干什么的，得知劉某一直在井下工作，醫(yī)生就說該病很可能是因為長期在井下吸入有害氣體所致，如果再發(fā)展下去那就是矽肺病了。原本以為下井工作就是累點臟點，有危險也是瓦斯爆炸、塌方和透水等事故，沒想到還有矽肺病。醫(yī)生說這個病很嚴重，如果不及時治療會有生命危險。回到公司后，劉某就去找公司領(lǐng)導(dǎo)，提出給自己治療，卻遭到了領(lǐng)導(dǎo)的拒絕。無奈之下，劉某在工友的指點下，來到了農(nóng)民工工作站求助。

律師了解情況后，告訴劉某，他肋骨受傷和肺部的職業(yè)病都屬于工傷，但由于傷害的性質(zhì)不一樣，所以需要分別處理。律師首先整理好相關(guān)材料后向社會保障局提出了工傷認定，要求認定劉某肋骨骨折為工傷；至于職業(yè)病的工傷認定，需要先經(jīng)過職業(yè)病診斷才行。由于劉某當時肋骨受傷有很多工人在場，公司為他支付了醫(yī)療費，對受傷的事實也不否認，因此劉某肋骨骨折的工傷認定很快就做出了。拿到工傷認定書后，劉某卻一點也高興不起來，因為此時他的肋骨骨折已經(jīng)基本痊愈，但肺部的毛病卻越來越嚴重，而此時他還不知道自己該去哪里做職業(yè)病診斷。律師四處打聽后，得知山西省職業(yè)病醫(yī)院可以做職業(yè)病診斷，律師就幫助劉某將材料遞交給了醫(yī)院，但醫(yī)院檢查后認為劉某缺少有關(guān)勞動關(guān)系、工種、工作崗位等單位證明，因此拒絕為其作職業(yè)病診斷。律師提出，劉某肋骨骨折已經(jīng)確認了工傷，工傷證上也表明了他的工作單位，勞動關(guān)系已經(jīng)認定，為什么不能做職業(yè)病診斷？但醫(yī)院方面認為，除了確認目前的勞動關(guān)系外，用人單位必須要出具工種、工作時間等具體工作資料。劉某很失望，這些東西自己哪能拿的來??？律師考慮后，提出一方面讓他繼續(xù)就肋骨骨折申請勞動能力鑒定；另一方面，則向勞動仲裁委提出申請，要求確認他與公司的勞動關(guān)系、工種、工作崗位及時間。很快，劉某肋骨骨折經(jīng)鑒定為九級傷殘，而仲裁委經(jīng)審理后也做出了裁決書：確認了劉某與公司存在勞動關(guān)系，并對其工作崗位和工作時間也做出了認定。收到仲裁裁決書后，律師整理了材料再次遞交給了職業(yè)病醫(yī)院。醫(yī)院做出了職業(yè)病診斷，確認劉某為煤工塵肺一期。根據(jù)這一診斷證明，社會保障局做出了工傷認定，確認劉某所患的職業(yè)病為工傷。原本以為沒辦法的事，在律師的幫助下柳暗花明竟然拿到了工傷證。劉某這下有信心了，在律師的幫助下討要自己應(yīng)得的賠償。

律師提醒：職業(yè)病是工傷的一種情形，但申請工傷認定前，必須先經(jīng)過有資質(zhì)的醫(yī)療機構(gòu)進行職業(yè)病診斷，而職業(yè)病診斷需要勞動關(guān)系、工作崗位、工作時間等資料。農(nóng)民工朋友若認為自己可能患職業(yè)病，就要先收集相關(guān)證據(jù)，尤其是確認勞動關(guān)系的證據(jù)。

摘自《農(nóng)民工法律援助中心》

第2篇：堅定的錫兵范文

關(guān)鍵詞：專業(yè)性 科學(xué)性 嚴謹性

隨著人們生活水平的提升，越來越多的社會群眾開始關(guān)注醫(yī)療事業(yè)的發(fā)展情況，但從數(shù)據(jù)上來說，醫(yī)療糾紛發(fā)生頻率有逐年上升趨勢，其中涉及到病患死亡的醫(yī)療糾紛的社會影響比過去更加強烈。法醫(yī)病理鑒定能夠快速、直接地查明病患死亡原因，明確醫(yī)療糾紛中雙方責(zé)任的同時提供最有力的科學(xué)證據(jù)，對解決醫(yī)療糾紛具有重要意義。

一、法醫(yī)病理學(xué)鑒定內(nèi)容

首先，通過法醫(yī)病理學(xué)鑒定，對病患死亡原因進行確認。通過科學(xué)化的鑒定方法，將病患體內(nèi)多處損傷、多種外傷進行分類，從而對致死傷進行精確定位。

其次，對致死的傷患部位確定后，就可以進一步對死亡原因進行病理學(xué)上分析，進而明確死亡原因。將死亡原因和死亡機制分析清楚，對接下來的醫(yī)患事故原因分析和醫(yī)療糾紛責(zé)任歸咎提供一定的信息支持。

此外，醫(yī)療糾紛一旦需要進行司法鑒定，簡單的死亡原因確認和醫(yī)患事故原因分析是遠不能解決糾紛的根本問題的。而法醫(yī)病理學(xué)方面的鑒定可以將醫(yī)療過程中的某些具體細節(jié)進行確認，對醫(yī)患事故產(chǎn)生的原因進行細致分析，判斷醫(yī)療單位是否存在過失、過失有多少，還是病患接受治療時間太晚而錯失治療時機等。

二、法醫(yī)病理學(xué)鑒定的優(yōu)勢

（一）比一般醫(yī)學(xué)鑒定在程序上更具優(yōu)勢。一般的醫(yī)療糾紛發(fā)展到后期階段都會上升到民事訴訟階段，而相應(yīng)的民事訴訟中有時會有司法鑒定請求，這種時候由一般的醫(yī)學(xué)鑒定機構(gòu)進行尸檢在程序上不具合法性，在結(jié)果上不具權(quán)威性，而專業(yè)的法醫(yī)病理學(xué)鑒定能夠直接參與到民事訴訟中的司法鑒定程序中，其程序上具備合理性，并且法醫(yī)尸檢的程序比一般醫(yī)學(xué)鑒定程序嚴格、內(nèi)容也更加全面，因此其鑒定結(jié)果更具專業(yè)性。

（二）比一般醫(yī)學(xué)鑒定的結(jié)果更具針對性且更加準確。法醫(yī)鑒定人員都進行過專業(yè)的病理學(xué)學(xué)習(xí)，并且法醫(yī)鑒定人員學(xué)習(xí)的醫(yī)學(xué)鑒定技術(shù)更具專業(yè)指向，是專門為司法鑒定進行證據(jù)服務(wù)的鑒定。且法醫(yī)比一般醫(yī)科人員接觸尸體的時間更多，因此比一般醫(yī)科人員更加了解尸體的一些特征、特性和變化規(guī)律，因此尸檢結(jié)果更具準確性。

（三）比一般醫(yī)學(xué)鑒定更加嚴格。這里的嚴格指的是人員上的嚴格和結(jié)果上的責(zé)任概念。法醫(yī)鑒定人員是專職人員，法醫(yī)人員接受過專業(yè)化培訓(xùn)，具備更高的職業(yè)素質(zhì)，并且專門的管理部門，只在有法醫(yī)鑒定需求時參與尸體鑒定。因此不容易受到社會勢力或是輿論方面的干擾，并且鑒定條件要求、流程要求更加嚴格，從而能夠?qū)κw鑒定結(jié)果做到負責(zé)。

三、法醫(yī)病理學(xué)鑒定的重要性

（一）解決醫(yī)療糾紛的要求

很多醫(yī)療糾紛由一般醫(yī)學(xué)鑒定組織來進行尸體鑒定的相關(guān)操作，其結(jié)果很難達到“服眾”的效果，反而可能使醫(yī)院或進行鑒定的醫(yī)療組織陷入輿論危機、信譽危機等。而能夠進行法醫(yī)鑒定的病理學(xué)組織的成員都是經(jīng)過專業(yè)化訓(xùn)練，受專門部門管理，其團隊的的專業(yè)性和個人素質(zhì)并非一般病理學(xué)組織可以相比。因此由法醫(yī)組織對尸體進行病理學(xué)鑒定不僅能夠在結(jié)果上更加精確，而且更具權(quán)威，能夠在醫(yī)療糾紛的司法鑒定過程中通過責(zé)任的明確，過失程度的確認的方式對醫(yī)療糾紛的決絕起到?jīng)Q定性的作用。

（二）醫(yī)學(xué)自身的要求

首先，醫(yī)學(xué)發(fā)展需要對各種各樣的致死原因、死亡機制就行嚴格準確的數(shù)據(jù)、信息統(tǒng)計，進而可以對這些致死原因、死亡機制進行研究，了解人類死亡過程中的一些醫(yī)學(xué)學(xué)理上、病理學(xué)上的變化過程，這是醫(yī)學(xué)發(fā)展的需求。

其次，醫(yī)學(xué)本身具備嚴謹性的要求，而醫(yī)療糾紛中責(zé)任混亂，明確尸體死亡原因、機制，弄清楚尸體生前的各種病理現(xiàn)象和原因是醫(yī)學(xué)嚴謹性的要求之一，此外分清醫(yī)療責(zé)任是醫(yī)學(xué)嚴謹性的另一要求。

（三）醫(yī)學(xué)發(fā)展的要求

隨著社會經(jīng)濟的進步發(fā)展，相應(yīng)的科教文衛(wèi)事業(yè)也要相應(yīng)發(fā)展，其中群眾對衛(wèi)生事業(yè)的發(fā)展需求增長速度最快。

法醫(yī)病理學(xué)的尸體鑒定能夠?qū)σ恍┮呻y情況下產(chǎn)生的醫(yī)療糾紛原因有一個理性的鑒定結(jié)果，還原尸體還處于活體狀態(tài)時的身體狀態(tài)的具體情況，進而產(chǎn)生與尸體相關(guān)的病理學(xué)認識，為以后的醫(yī)學(xué)實踐和醫(yī)學(xué)發(fā)展進行經(jīng)驗的積累，進而促進相關(guān)的醫(yī)療事業(yè)的發(fā)展和醫(yī)用器械、醫(yī)療科學(xué)的進步和發(fā)展。

（四）司法鑒定程序的要求

大多數(shù)涉及到民事賠償責(zé)任的醫(yī)療糾紛都會進行司法鑒定程序，而司法鑒定程序需要由一支專業(yè)素質(zhì)較強、責(zé)任感出眾的病理學(xué)鑒定團隊來執(zhí)行。如果由一般的病理學(xué)醫(yī)學(xué)組織來進行相關(guān)的尸體鑒定，科學(xué)性和結(jié)果的準確性就難以保證。而準確性不足的尸檢結(jié)果對司法仲裁來說是不足以成為證據(jù)，甚至?xí)蔀樽璧K司法審判的錯誤信息，從而影響審判公平原則，極不利于建立法律權(quán)威。長久以往將會阻礙我國法制社會建設(shè)進程。

四、結(jié)語

法醫(yī)病理學(xué)的尸檢對還原尸體病理現(xiàn)象，致死原因、死亡機制的病理學(xué)變化有重要意義，是促進醫(yī)學(xué)、病理學(xué)發(fā)展的重要內(nèi)容和環(huán)節(jié)。并且，法醫(yī)病理學(xué)尸檢還對司法審判有重要意義，司法審判中很多賠償責(zé)任的確定都需要法醫(yī)病理學(xué)尸檢結(jié)果提供信息和證據(jù)支持。綜合來說，我國的法醫(yī)病理學(xué)正處于發(fā)展階段，在未來的時間內(nèi)，法醫(yī)病理學(xué)的發(fā)展方向應(yīng)當更加大眾化更加普及。

參考文獻：

[1]宋國建，范少罡.當法醫(yī)病理鑒定遭遇穆斯林風(fēng)俗習(xí)慣時[J].中國司法鑒定，2012，（06）.

[2]陳曉峰.法醫(yī)病理鑒定參與醫(yī)療糾紛尸檢的重要性及常見問題防范[J].中國衛(wèi)生標準管理，2015，（26）.

[3]李良賢，張建軍.老年人肺動脈栓塞猝死病例栓塞形成的高危因素及法醫(yī)病理鑒定特點[J].法制博覽，2015，（25）.

第3篇：堅定的錫兵范文

關(guān)鍵詞 精神病司法鑒定 原因自由行為(自陷行為) 責(zé)任主義(同時原則)

2005年11月～2010年4月受理各類刑事、民事案件151起，其中與醉酒相關(guān)的刑事案件16例，通過對其16例與醉酒相關(guān)案例為研究對象進行精神病司法鑒定分析。

資料與方法

2005年11月～2010年4月受理案例16例。①被鑒定人資料：均為男性；年齡25～62歲，其中25～30歲5例(31.3%)，31～40歲7例(44.0%)，41～50歲3例(18.8%)，51～65歲1例(7.0%)；文化程度：文盲3例(18.8%)，小學(xué)4例(25.0%)，初中7例(43.8%)，高中2例(12.5%)；職業(yè)：無業(yè)人員4例(25.0%)，農(nóng)民6例(37.5%)，從業(yè)人員6例(37.5%)；婚姻：未婚5例(32.0%)，已婚7例(43.8%)，離異4例(25.0%)；②委托機構(gòu)：公安局或公安分局；③案件性質(zhì)：為刑事案件；其中涉嫌故意傷害案9例(57.0%)，放火案2例(12.5%)，搶劫案1例(6.25%)，故意毀壞財物案1例(6.25%)，妨礙公務(wù)案1例(6.25%)，案1例(6.25%)，猥褻案1例(6.25%)。

方法：嚴格按照司法鑒定程序，實施精神病司法鑒定。即根據(jù)調(diào)查材料及檢查所見，依據(jù)《中國精神障礙分類與診斷標準(第3版)CCMD-3》提出醫(yī)學(xué)診斷意見，按照我國《刑法》第18條之規(guī)定明確案發(fā)時段產(chǎn)生危害行為時的精神狀態(tài)及特定行為的辨認和控制能力狀況。

結(jié) 果

評定為完全責(zé)任能力占鑒定案75.0%，限定責(zé)任能力18.75%，無責(zé)任能力6.25%。精神疾病性質(zhì)及法定能力界定，見表1。

討 論

酒精是一種親神經(jīng)物質(zhì)，一次大量飲酒，可出現(xiàn)急性神經(jīng)精神癥狀，長期飲用可產(chǎn)生酒精依賴，酒精中毒性精神障礙，由此給個人、家庭及社會造成的危害日益突出［1］。這也給與酒精相關(guān)的精神司法鑒定工作帶來了一定的難度，如何依據(jù)醫(yī)學(xué)要件和法學(xué)要件來界定責(zé)任能力也是精神司法鑒定的難點，所以在鑒定實施前認真閱卷，對卷宗中的疑點必須提請委托機構(gòu)補充相關(guān)的調(diào)查材料，同時要“去偽存真”。鑒定時要全面客觀，并進一步核實印證［2］。

從委托機構(gòu)反饋情況看，16例的鑒定中普通醉酒和輕度精神發(fā)育遲滯的普通醉酒及酒精依賴(12例)的法定能力界定完全責(zé)任；中度精神發(fā)育遲滯和輕躁狂的普通醉酒(2例)法定能力界定限定責(zé)任，委托機構(gòu)未提出異議。1例酒中毒性幻覺癥的精神發(fā)育遲滯(輕度)評定為限定責(zé)任提出異議，賦予說明后采信；對一復(fù)雜性醉酒的搶劫案法學(xué)能力界定為限定責(zé)任，未予采信。16例鑒定中15例被采信，采信率93.8%。

在此說明的是復(fù)雜性醉酒的醫(yī)學(xué)診斷宜審慎，雖然根據(jù)相關(guān)調(diào)查材料，通過循證的?？茩z查得出此結(jié)論，但在法學(xué)界現(xiàn)對刑法第十八條中“醉酒的人犯罪，應(yīng)當負刑事責(zé)任”有“原因自由行為(自陷行為)”和“責(zé)任主義(同時原則)”的爭議。對我們的鑒定意見未予采信也在所難免。

時至今日，多數(shù)學(xué)者提倡原因自由行為(自陷行為)應(yīng)在刑法中加以明文規(guī)定。此種主張逐漸成為趨勢，并在世界各國的刑事理論、立法與司法實務(wù)中得以體現(xiàn)［3］。修訂后的2010年4月1日新交通法規(guī)對于飲酒后或者醉酒后駕駛機動車者課以重罰也說明了這點。

與醉酒相關(guān)案例的精神病司法鑒定是一項細致復(fù)雜的工作，鑒定工作必須全面客觀，不僅要從本專業(yè)領(lǐng)域出發(fā)，還要示蹤法學(xué)發(fā)展前沿，將醫(yī)學(xué)要件與法學(xué)要件有機的結(jié)合起來，對提高司法精神病鑒定工作的質(zhì)量大有裨益。

參考文獻

1 沈漁.精神病學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社,2009:446-452.

第4篇：堅定的錫兵范文

資料與方法

2006年1月～2010年6月由市轄兩縣兩區(qū)人口計生局上報，申請進行病殘兒童醫(yī)學(xué)鑒定患兒160例，男74例（4625%），女86例（5375%）；年齡2～15歲。

方法：由病殘兒家長申報，經(jīng)鄉(xiāng)、鎮(zhèn)、街計劃生育服務(wù)站調(diào)查、核實后上報縣（區(qū)）計劃生育行政部門審核，再報市計劃生育醫(yī)學(xué)鑒定小組，統(tǒng)一組織體檢。對所有申報對象進行認真、細致的體格檢查。根據(jù)需要做輔助檢查，包括：B超、心電圖、腦電圖、CT等。對疑有遺傳傾向的患兒及其父母均作染色體及其相關(guān)生化檢查，對智力低下者采用韋氏兒童智力量表（WISC-CR）進行智商評定。根據(jù)國家計生委《病殘醫(yī)學(xué)鑒定診斷標準及其父母再生育的指導(dǎo)原則》，最后由醫(yī)學(xué)鑒定小組做出鑒定結(jié)果。

結(jié)　果

在上報的160例病殘兒醫(yī)學(xué)鑒定中，非遺傳性疾病94例（5875%），遺傳性疾病66例（4125%）。非遺傳性疾病中的神經(jīng)系統(tǒng)疾病最多（22例），占非遺傳疾病的2340%，其次是心臟病18例（1915%），第3位是腦癱14例（1489%）。見表1。

遺傳性疾病中以多基因遺傳病的先天性心臟病最多12例，占遺傳性疾病的1818%，其次是腦神經(jīng)系統(tǒng)疾病10例，占遺傳疾病的1515%，第3位遠視、弱視9例，占遺傳疾病的1364%。見表2。

討　論

對本地區(qū)出生缺陷的現(xiàn)狀及病因進行分析：隨著年齡增長，病殘兒例數(shù)逐漸增多。因有些疾病早期不易發(fā)現(xiàn)，很多非遺傳性疾病在育兒過程中才不斷發(fā)生。病殘兒主要分布在農(nóng)村，原因是農(nóng)村不少家庭衛(wèi)生保健知識較差，部分婦女在孕期未脫離有害接觸，孕期檢查少，基礎(chǔ)醫(yī)療設(shè)備較差，沒有及時發(fā)現(xiàn)問題，導(dǎo)致胎兒出生缺陷。不少農(nóng)村家長忙于外出務(wù)工或經(jīng)商等，對兒童看管不當，外傷、燒傷、燙傷車禍等等致殘較多。以上說明病殘兒防治工作重點在農(nóng)村，改善醫(yī)療條件，建立健全出生缺陷干預(yù)機制，減少環(huán)境污染及傷害。其中繼發(fā)性癲癇、腦癱所占比例最高。妊娠期感染、缺氧、有害物質(zhì)的接觸等，都是導(dǎo)致繼發(fā)性癲癇、腦癱等疾病的主要原因。產(chǎn)前檢查，孕產(chǎn)期、圍產(chǎn)期、兒童保健工作落后，很多婦女有不良孕產(chǎn)史因外傷等所致的運動系統(tǒng)傷殘。因此應(yīng)廣泛普及優(yōu)生優(yōu)育知識，提高產(chǎn)前診斷水平和助產(chǎn)技術(shù)，搞好孕產(chǎn)期、圍產(chǎn)期、兒童保健工作，并加強對幼兒的看守，防止意外事故的發(fā)生非常重要。遺傳性疾病中發(fā)病率居前3位的先天性心臟病、遺傳性智力低下、原發(fā)性癲癇均屬多基因遺傳病，其易患性的高低是由遺傳因素和環(huán)境因素共同決定的。因此，重視環(huán)境保護，減少環(huán)境污染，避免接觸有害物質(zhì)，可降低多基因病的發(fā)生。有些單基因病如先天性耳聾，高度近視，再發(fā)風(fēng)險較高，應(yīng)建議其領(lǐng)養(yǎng)；而性連鎖隱性遺傳病如血友病等，可發(fā)放生育指標，但應(yīng)做產(chǎn)前診斷，保留正常胎兒，流產(chǎn)病胎。非遺傳性疾病中，由于母嬰受內(nèi)、外因素損害，如長期母親患病服藥，接觸有害物質(zhì)，高齡孕產(chǎn)婦等，已經(jīng)證實，葉酸缺乏是神經(jīng)管畸形的重要原因，增補葉酸可以有效預(yù)防出生缺陷的發(fā)生。

在遺傳病順位中，先天性心臟病占第1位，其次是神經(jīng)管畸形和遠視、弱視。先天性心臟病是多基因遺傳疾病，神經(jīng)管畸形和遠視、弱視是發(fā)病率較高的遺傳性疾病，因此，應(yīng)加強圍產(chǎn)期保健，開展有效的孕前、孕期保健和產(chǎn)前診斷，及時發(fā)現(xiàn)異常情況，及時采取有效措施，降低遺傳病的發(fā)生。

第5篇：堅定的錫兵范文

關(guān)鍵詞：南酸棗；內(nèi)生細菌；芒果炭疽病菌；防治效果

中圖分類號：Q939.95文獻標識碼：A文章編號：0439-8114（2014）10-2398-03

Identification of Choerospondias axillaris Endophytic Bacterial Strain WYG5 and Its Effects on Preservating Postharvest Mango

WU Jia-fei，LI Xiao-yu，F(xiàn)AN Yong-mei，LIU Zhi-qiang

（College of Environment and Plant Protection，Hainan University，Haikou 570228，China）

Abstract：Strain WYG4，isolated from Choerospondias axi11aris（Roxb1） Burttet Hill，had higher antagonistic effects against Colletotrichum gloeosporioides， with antagonistic activity of 32% in plate. According to its morphological，physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence，the strain WYG5 was identified as Bacillus megaterium. Its fermentation broth and fermentation filtrate had obvious effects on preservating postharvest mango. After 9 d and 12 d treatment，the controlling effects were up to 60.76%， 59.50% and 43.59%，34.19%， respectively.

Key words：Choerospondias axillaris； endophytic bacteria； Colletotrichum gloeosporioides； control effect

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（31160377）；國家科技支撐計劃項目（2012BAK01B05）

南酸棗（Choerospondias axillaris）為漆樹科南酸棗屬落葉大喬木，多年生，又名五眼果、酸棗樹、山棗子等，主要分布于云南、廣東、廣西、湖南、湖北、江西、福建、浙江、貴州等地區(qū)[1]，其樹皮和果實可以入藥，樹皮主治瘡瘍、湯火傷、陰囊濕疹；鮮果則消食滯，治食滯腹痛；果核醒酒解毒，治風(fēng)毒起疙瘩成瘡或瘍癰[2]。

植物內(nèi)生菌是指在其生活史的一定階段生活在活體植物組織內(nèi)，而不引起植物明顯病害的微生物[3]。許多研究表明植物中的內(nèi)生細菌對宿主具有抗病促生的能力，作為生物菌劑在生物防治方面和促進植物生長方面有著重要的應(yīng)用價值[4，5]。試驗從南酸棗體內(nèi)分離出一株內(nèi)生細菌WYG5，發(fā)現(xiàn)其對芒果炭疽病菌具有較好的拮抗效果，利用常規(guī)方法結(jié)合16S rDNA序列分析對該菌株進行了鑒定，并測定了其對采后芒果的保鮮防病效果，為其今后應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試材料南酸棗采自海南大學(xué)儋州校區(qū)，內(nèi)生細菌WYG5從南酸棗中經(jīng)組織表面消毒分離獲得。芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz）由海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院提供，芒果品種為臺農(nóng)l號。

1.1.2培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母粉 5 g，NaCl 10 g，去離子水1 L；PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，去離子水1 L。

1.2方法

1.2.1菌株培養(yǎng)菌株WYG5經(jīng)活化后接入LB培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)2 d，收集發(fā)酵液，12 000 r/min離心5 min，將上清液利用0.22 μm的濾膜除菌過濾，得到發(fā)酵濾液。

1.2.2 菌株WYG5的鑒定采用常規(guī)鑒定方法進行[6]。菌株基因組DNA利用Bacterial DNA Kit（50）試劑盒提取，利用16S rDNA通用引物（5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，5′-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進行基因擴增，由上海英駿生物技術(shù)有限公司進行序列測定，將所測序列在GenBank中進行Blast分析，根據(jù)Blast結(jié)果利用MEGA 5.0軟件以鄰近相接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.3菌株WYG5皿內(nèi)拮抗活性測定 在直徑9 cm的PDA平板中央接種1塊直徑為5 mm芒果炭疽病菌的菌餅，菌絲面朝下，同時在菌餅兩側(cè)2 cm處各接入一環(huán)內(nèi)生細菌WYG5，以不接內(nèi)生細菌為對照，每處理3次重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，十字交叉法計算皿內(nèi)拮抗活性。

1.2.4菌株WYG5對芒果的防病效果取健康無病、大小均一、約八成熟芒果果實，用75%酒精表面消毒后，自然晾干備用。處理液包括發(fā)酵液、10倍稀釋發(fā)酵液、發(fā)酵濾液、10倍稀釋發(fā)酵濾液，以去離子水處理為對照。處理時將果實分別于各處理液中浸泡10 min，晾干后裝入保鮮盒中放置，在處理后第6、9、12 天共調(diào)查3次，逐次記錄并累加炭疽病病果數(shù)和病級，計算病指和防效，并對防效進行方差分析。具體方法參照國家標準GB/T 17980.98-2004進行。

果實發(fā)病程度分級方法如下，0 級：無病；1 級：病斑面積占果實面積的5%以下；3 級：病斑面積占果實面積的 6%～15%；5 級：病斑面積占果實面積的 16%～25%；7 級：病斑面積占果實面積的 26%～50%；9 級：病斑面積占果實面積的 50%以上。試驗數(shù)據(jù)采用DPS處理，進行差異顯著性分析。

病情指數(shù)= [∑（各級病果數(shù)×相對級數(shù)）/（調(diào)查總果數(shù)×9）]×100

防效=[（對照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)]×100%。

2結(jié)果與分析

2.1菌株WYG5的鑒定

菌株WYG5在培養(yǎng)基上菌落呈圓形，淺黃色，邊緣整齊，表面有凸狀隆起，干燥，不透明，革蘭氏染色陽性，芽孢染色陽性，菌體桿狀，周生鞭毛。菌株WYG5 的形態(tài)和生理生化特征與東秀珠等[6]描述的巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）特征相同。對菌株WYG5的16S rDNA序列進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)純化后測序，得到 1 515 bp的堿基序列。將16S rDNA 序列進行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)它與多株巨大芽孢桿菌菌株的同源性均在99%以上。選取GenBank中的8株芽孢桿菌屬的細菌與菌株WYG5一起，利用軟件MEGA 5.0構(gòu)建出基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。由圖1可以看出，菌株WYG5與巨大芽孢桿菌的同源性最高，結(jié)合形態(tài)觀察和生理生化特征分析，確定菌株WYG5為巨大芽孢桿菌。

2.2菌株WYG5皿內(nèi)拮抗活性的測定

采用十字交叉法測定菌株WYG5對芒果炭疽病菌的皿內(nèi)拮抗活性，結(jié)果表明，該內(nèi)生細菌對芒果炭疽病菌有明顯的拮抗作用，能夠有效抑制該病原菌菌絲在PDA培養(yǎng)基中的擴展，抑制率達到32%。

2.3菌株WYG5對芒果的防病效果

內(nèi)生細菌WYG5的不同處理液對采后芒果的保鮮防病效果見表1。6 d相對于芒果保鮮來說時間較短，6 d時對照組病情指數(shù)僅為7.04，處理防效雖高但意義不大，故重點討論了9 d和12 d的防效。其中菌株發(fā)酵液及發(fā)酵濾液處理9 d時的防效分別為60.76%和59.50%，不存在顯著差異；12 d時的防效分別為43.59%和34.19%，存在極顯著差異，發(fā)酵液的保鮮防病效果明顯優(yōu)于發(fā)酵濾液。稀釋10倍發(fā)酵液處理9 d時的防效為54.43%，與發(fā)酵液處理不存在顯著差異，而處理12 d時兩處理防效差異極顯著。稀釋10倍發(fā)酵濾液處理9 d和12 d時的防效均極顯著低于發(fā)酵濾液的防效。

3結(jié)論與討論

巨大芽孢桿菌作為植物內(nèi)生細菌已有報道，如農(nóng)倩等[7]從水稻體內(nèi)分離到一株巨大芽孢桿菌B196，對水稻紋枯病菌的生長具有較強的抑制作用，盆栽和田間防效分別為64.29%和55.13%；林天興等[8]從苦豆子中分離出48株對棉花枯萎病菌和黃萎病菌有較強拮抗作用的內(nèi)生細菌，并對其遺傳多樣性進行了分析，發(fā)現(xiàn)這些菌株分別屬于Bacillus atrophaeus、Bacillus subtilis、Bacillus cereus、Bacillus megaterium、Bacillus pumilus、Serratia marcescens；張鑫等[9]從無紋紫背苔葉片中分離出一株內(nèi)生菌z12，鑒定為巨大芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)其對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌及水稻紋枯病菌均有較強的抑制作用；林娜等[10]從山蒼子的根、莖、葉和果中分離出內(nèi)生細菌52株，其中一株對辣椒疫霉病的防治效果較好，且可促進辣椒植株生長。試驗從南酸棗中分離到一株對芒果炭疽病菌拮抗作用較強的菌株WYG5，通過形態(tài)觀察、生理生化測定及16S rDNA序列分析，鑒定將該菌株為巨大芽孢桿菌，經(jīng)測定該菌株發(fā)酵液及發(fā)酵濾液對采后芒果均有明顯的保鮮防病效果，處理9 d后防效分別為 60.76%和 59.50%，12 d后的防效分別為43.59%和34.19%，有關(guān)該菌的抗病機理及抑菌活性物質(zhì)還有待進一步研究。

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第6篇：堅定的錫兵范文

［摘要］目的 探討不同位點微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）和雜合性缺失（LOH）與慢性粒細胞白血?。–ML）各期的關(guān)系。方法 應(yīng)用多重PCR技術(shù)檢測CML病人不同時期8、9、17號染色體上5個微衛(wèi)星位點的MSI和LOH。結(jié)果 在D8S555位點，CML加速、急變期（AP+BC）病人的MSI發(fā)生率明顯高于慢性期（CP）病人，差異有顯著意義（ P =0.009）;8號染色體上D8S555、D8S559位點MSI發(fā)生率明顯高于9、17號染色體上D9S67、TP53A1/A2、AFMa127xg9位點 ，AFMa127xg9位點LOH發(fā)生率明顯高于其他4個位點，差異有顯著性（ χ 2 =1.858～9.946，P < 0.05、0.01）。結(jié)論 微衛(wèi)星遺傳不穩(wěn)定性是CML發(fā)生和轉(zhuǎn)化過程中的常見事件;不同位點微衛(wèi)星不穩(wěn)定性在CML病情演變中所起作用不同;AFMa127xg9位點附近可能存在與CML發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的新抑癌基因。

［關(guān)鍵詞］ 染色體不穩(wěn)定性;雜合性缺失;微衛(wèi)星重復(fù);白血病，髓樣，慢性

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the relationship between the frequency of microsatellite instability （MSI） on differ-ent chromosome and chronic myeloid leukemia （CML） at different stages. MethodsUsing multiplex-PCR，the MSI and loss of heterozegosity （LOH） on 5 microsatellite loci of chromosome 8， 9 and 17 in chronic myeloid leukemia were detected. Results The frequency of MSI at D8s555 locus in patients with CML at chronic， accelerated， blastic stages was significant differences （ P =0.009）. CML patients showed higher frequency of MSI on D8S555 and D8S559 loci than that of at D9S67 and AFMa127xg9 loci （ χ2 =5.680， 8.096; P

［KEY WORDS］chromosomal instability; loss of heterozygosity; microsatellite repeats; leukemia， myeloid， chronic

微衛(wèi)星（MS）是廣泛存在于原核及真核細胞基因組中的簡單串聯(lián)重復(fù)的DNA序列，約占人類基因組的10%［1］。由于微衛(wèi)星DNA具有豐富的多態(tài)性、高度的雜合性以及較低的重組率等特點，已被廣泛應(yīng)用于人類基因組計劃中的基因制圖、遺傳病診斷、法醫(yī)學(xué)等各個領(lǐng)域。近年來，人們發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星在惡性腫瘤及相關(guān)疾病中可表現(xiàn)出不穩(wěn)定性（MSI）和雜合性缺失（LOH），因而對微衛(wèi)星的監(jiān)測成為尋找和定位抑癌基因、探討腫瘤發(fā)生機制的一個重要方法［2，3］。慢性粒細胞白血?。–ML）是一種造血干細胞起源的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，其病程發(fā)展經(jīng)歷慢性期、加速期和急變期。對于慢性期轉(zhuǎn)變?yōu)榧铀倨诘臋C制 尚未研究清楚。本文用多重PCR技術(shù)檢測CML不同時期的多個微衛(wèi)星位點的MSI和（或）LOH，以期探索其與CML發(fā)生及病情進展的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 對象 CML病人37例，來自青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，包括慢性期（CP）27例，加速期和急變期（AP+BC）10例;男20例，女17例;年齡12～70歲，中位年齡47.1歲。診斷依據(jù)文獻［4］標準。選擇同期5例健康查體志愿者作為正常對照組。

1.2 方法

1.2.1標本制備 收集CML病人的骨髓標本，正常對照組外周血，同時刮取口腔黏膜標本做自身對照，參考本室常規(guī)方法分別提取骨髓、外周血與口腔黏膜標本DNA備用。

1.2.2引物合成 選取與CML病人不同時期染色體改變密切相關(guān)的8、9、17號染色體上5個微衛(wèi)星位點:D8S555、D8S559、D9S67、TP53A1/A2、 AFMa127xg9 ，從基因庫中查出其引物序列，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成所需引物，引物序列見表1。

表1 第8、9、17號染色體5個微衛(wèi)星位點引物序列 （略）

1.2.3PCR擴增 將引物分成兩組，用多重PCR方法同時擴增病人的骨髓（或正常對照組的外周血）和口腔黏膜DNA。

1.2.4產(chǎn)物分析 將擴增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染，用凝膠成像分析儀分析是否存在MSI和（或）LOH。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 用卡方檢驗（包括校正檢驗和精確檢驗法）。

2 結(jié)果

2.1 各期CML病人MSI和（或）LOH發(fā)生率比較 27例CP病人中14例發(fā)生MSI和（或）LOH，10例AP+BC病人中8例發(fā)生了MSI和（或）LOH，二者比較，差異無顯著性（ P =0.152）。

2.2 不同微衛(wèi)星位點MSI和（或）LOH的發(fā)生率及其比較 在D8S555位點，CML CP病人的MSI發(fā)生率為7.4%，AP+BC為40.0%，但未見LOH。進展期（AP+BC）病人的MSI發(fā)生率明顯高于CP病人，差異有顯著性（ P =0.009）。同時出現(xiàn)兩個和兩個以上位點改變者10例，其中CP病人6例，AP+BC病人4例，二者差異無顯著性（ P =0.407）。8號染色體的D8S555、D8S559位點MSI的發(fā)生率明顯高于9、17號染色體的3個位點，差異均有顯著意義（ χ2 = 5.680、8.096，P

表2 CML病人各期不同微衛(wèi)星位點的MSI、LOH發(fā)生情況（略）

2.3 正常對照組的MSI和（或）LOH發(fā)生情況 正常對照組5例外周血細胞與口腔黏膜細胞DNA電泳、銀染后得到的條帶都完全相同，未見到MSI和（或）LOH。

3 討論

慢性白血病是一種克隆性、多能造血干細胞疾病，發(fā)病率為1/100 000，發(fā)病高峰在50～60歲之間。其臨床特征為:髓系增生，白細胞增多伴嗜堿粒細胞增多，脾大。病情發(fā)展最終由慢性期進展到加速期，最后到致命的急變期。特征性的染色體異常t（9，22）（q34:q11）導(dǎo)致bcr-abl融合基因的形成，其產(chǎn)物bcr/abl酪氨酸激酶的活性比野生型abl酪氨酸激酶的活性更強，這在CML的發(fā)病中起重要作用［5］。一般認為，CML急變時70%的病人可以出現(xiàn)額外的染色體異常，這種變化的出現(xiàn)比血液學(xué)和臨床表現(xiàn)的惡化要早幾個月，可作為估計預(yù)后的有價值的指標［6］。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展對CML的發(fā)病機制及病程演變的研究起了進一步推動的作用。PCR技術(shù)檢測微衛(wèi)星的不穩(wěn)定性在研究CML發(fā)生發(fā)展機制中被廣泛應(yīng)用。WADA等［7］檢測了19例CML進展期和20例慢性期病人的5個不同微衛(wèi)星位點的MSI，結(jié)果顯示，進展期有10例病人檢測到至少2個微衛(wèi)星位點的MSI，而20例慢性期病人中沒有1例檢測出同樣位點的MSI，認為由于復(fù)制和修復(fù)機制缺陷導(dǎo)致微衛(wèi)星不穩(wěn)定性這一頻繁事件的發(fā)生同CML進展關(guān)系密切。OHYASHIKI等［8］用熒光技術(shù)對73例不同類型白血病的7個微衛(wèi)星標記進行連續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，在CML慢性期沒有微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，而急變期時微衛(wèi)星不穩(wěn)定性出現(xiàn)的頻率明顯升高，達25%，且出現(xiàn)多個位點不穩(wěn)定性者占50%以上，因此認為，多個基因位點的不穩(wěn)定性與CML的急變有關(guān)聯(lián)。李戈等［9］檢測17例CML加速期和急變期病人的2個微衛(wèi)星標記，發(fā)現(xiàn)有8例出現(xiàn)MSI或LOH，表明慢性白血病在加速期和急變期檢出微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的頻率明顯高于慢性期。本文結(jié)果顯示，進展期病人D8S555位點處的MSI發(fā)生率明顯高于慢性期病人，與文獻報道相符;同時也觀察到所選的其他4個位點上，加速期和急變期病人發(fā)生一個或多個位點的MSI和（或）LOH的頻率與慢性期病人無顯著性差異;8號染色體的2個位點D8S555、D8S559的MSI發(fā)生率明顯高于9、17號染色體的3個位點，而17號染色體的AFMa127xg9位點LOH發(fā)生率明顯高于其他4個位點，在9q34上的D9S67位點和17號染色體的TP53A1/A2位點上MSI和（或）LOH發(fā)生率都較低，且只發(fā)生在慢性期，這說明CML的演變是一個遺傳學(xué)改變高度異質(zhì)性的過程，微衛(wèi)星遺傳不穩(wěn)定性廣泛存在于疾病全過程，不同微衛(wèi)星的改變在這一過程中發(fā)揮的作用也不同。MORI等［10］對17例處于由慢性期向急變期進展的CML病人的10個微衛(wèi)星標記進行研究，也沒有發(fā)現(xiàn)MSI，認為這些微衛(wèi)星區(qū)域改變沒有參與CML的進展。另外，MEZA等［11］研究發(fā)現(xiàn)，CML出現(xiàn)額外染色體異常如+8、i（17q）的頻率具有地區(qū)民族差異。所以，我們分析不同文獻結(jié)果不同的原因除與所選擇的微衛(wèi)星位點不同有關(guān)外，可能還與人種、地域等因素造成的微衛(wèi)星多態(tài)性有關(guān)。如何科學(xué)選擇微衛(wèi)星位點檢測慢性白血病不同時期的MSI和LOH的臨床意義還有待于更多、更進一步的研究。

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第7篇：堅定的錫兵范文

【關(guān)鍵詞】高脂血癥；載脂蛋白；動脈粥樣硬化指數(shù)

載脂蛋白（apo）是脂蛋白（Lp）顆粒外層的蛋白質(zhì)部分，是脂蛋白組成中的關(guān)鍵物質(zhì)，已經(jīng)闡明各種載脂蛋白與脂代謝的關(guān)系非常密切，其主要功能是維持脂蛋白結(jié)構(gòu)與脂類運輸，調(diào)控脂代謝存在酶的活力，以及作為細胞表面Lp受體的配體，而參與脂蛋白代謝，從人和動物血漿和淋巴液中分離的多種apo中明確存在于人血漿中的有APOA-Ⅰ、AⅡ、AⅣ、B-100、B-48。CⅠ、CⅡ、CⅢ、D（即AⅢ）、E、F、G及apo（a）等用于動脈粥樣硬化（AS）風(fēng)險度估計的指標是APOA-Ⅰ、APOB-100[1]。

APOA-Ⅰ是高密度脂蛋白的主要蛋白質(zhì)，它的血清濃度代表HDL水平，正常情況下APOB占低密度脂蛋白（LDL）中蛋白質(zhì)的97%及低密度脂蛋白（VLDL）中蛋白質(zhì)的37%左右，所以APOB水平主要反應(yīng)LDL水平，但VLDL多時，APOB也會有所增高，通常認為HDL是動脈粥樣硬化的防御因素，而LDL是致病因素，所以血清APOA-Ⅰ減少及APOB升高，提示動脈粥樣硬化發(fā)生的危險性增加，APOA-Ⅰ/APOB-100比值，被稱為動脈粥樣硬化指數(shù)[2]。

1標本來源與方法

住院患者空腹靜脈血，同時用生化分析儀做膽固醇、甘油三脂、其中一項或兩項均高者，再用聯(lián)合免疫電泳去測其血清中APOA-1，與APOB-100的含量。

3討論

從表1可以看出，隨著年齡的增加，其APOA-Ⅰ的水平在下降，APOB-100的水平相對增高，膽固醇的含量也隨著年齡的增加而增高，A/B比值，隨著年齡的增加而減少，甘油三脂的含量隨著年齡的增加而增高，通過P值可以看出，各年齡組的測定結(jié)果有顯著性差異。

從表2可以看出，高血脂病人當中63.3%患者血清APOA-Ⅰ與APOB-100的含量仍維持在正常水平。

其二者的比值也在正常水平，其平均比值為1.5。說明高血脂人群中，有少數(shù)人載脂蛋白含量未發(fā)生改變，而大多數(shù)病人已發(fā)生改變，根據(jù)有關(guān)資料報道，A/B的正常參考值為1.3±0.56比值小于1.3就預(yù)示著疾病的存在，比值越小，疾病嚴重程度越深。

從表3可以看到高血脂病人當中，48.9%患者血清APOA-Ⅰ的含量仍維持在正常水平，其A/B的平均比值為1.36，51.1%的患者血清APOA-Ⅰ的含量下降，其A/B的平均值為0.9。

從表4可以看到高血脂病人當中，88.9%患者血清APOB-100的含量明顯增高，其A/B的平均比值為1.11，而11.1%的患者血清APOB-100仍維持在正常水平，其A/B的平均比值為1.35。

綜上所述，用聯(lián)合免疫電泳測人血清APOA-Ⅰ，APOB-100方法簡易，準確性高，在冠心病危險的預(yù)測上APOB的測定，可能比總膽固醇測定更好、更有意義。

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[2]吳希云.載脂蛋白A1和載脂蛋白B的測定在肝病中的意義.全國肝病實驗室診斷論文匯編，74-75.

第8篇：堅定的錫兵范文

【摘要】 目的： 構(gòu)建攜帶人白細胞介素10(hIL10)和人肝細胞生長因子(hHGF)雙基因的重組腺病毒載體。方法： 分別以pDC316hIL10EGFP和pCDNA3hHGF重組質(zhì)粒為模板，PCR擴增獲得hIL10和hHGF基因片段，與pIRES連接成為hIL10IREShHGF，測序正確后酶切，與pDC315連接，獲得穿梭質(zhì)粒pDC315hIL10IREShHGF，與腺病毒包裝系統(tǒng)轉(zhuǎn)染293細胞，包裝產(chǎn)生重組腺病毒hIL10hHGF，PCR鑒定后，擴增病毒，并測定病毒滴度。用重組腺病毒轉(zhuǎn)染BEL7402和WRL68細胞，ELISA法檢測上清液中hIL10和hHGF的含量。結(jié)果： 成功構(gòu)建了重組腺病毒hIL10hHGF，擴增純化后測得重組腺病毒滴度為1×109 pfu/ml，轉(zhuǎn)染BEL7402和WRL68細胞72 h后，表達hIL10的量分別為(6 271.7±5.2) pg/ml和(350.6±12.4) pg/ml，表達hHGF的量分別為(20 827.1±345.5) pg/ml和(201.6±10.1) pg/ml。結(jié)論： 本實驗為進一步研究AdhIL10hHGF在動物體內(nèi)抗肝炎、肝纖維化作用奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】 白細胞介素10; 肝細胞生長因子; 腺病毒載體

[Abstract] Objective: To construct the recombinant adenovirus vector carrying human interlerkin10(hIL10) and human hepatocyte growth factor(hHGF).Methods： We amplified hIL10 and hHGF genes by PCR with plasmids pDC316hIL10EGFP and pCDNA3hHGF， respectively， and subcloned into pIRES to generate hIL10IREShHGF. Confirmed by sequence analysis， the hIL10IREShHGF genes were inserted into the vector pDC315， then the shuttle plasmid pDC315hIL10IREShHGF was constructed， which was cotransfected with the adenovirus skeleton plasmid into 293 cells to obtain the recombinant adenovirus vector hIL10hHGF. After identified the target genes by PCR， the recombinant adenovirus was propagated and the viral titer was determined. hIL10 and hHGF proteins in the virusinfected BEL7402 and WRL68 cells were measured by ELISA. Results： We obtained recombinant adenovirus vector of hIL10hHGF successfully. After propagation， the titer of the recombinant adenovirus was 1×109 pfu/ml. The recombinant adenovirus could express hIL10 and hHGF in BEL7402 and WRL68 cells effectively. The concentrations of hIL10 were(6 271.7±5.2) pg/ml and(350.6±12.4) pg/ml respectively， and the concentrations of hHGF were(20 827.1±345.5) pg/ml and(201.6±10.1) pg/ml respectively. Conclusion： The recombinant adenovirus vector hIL10hHGF seted the foundation for the gene therapy of hepatitis and cirrhosis in animals.

[Key words] interlukin10; heptocyte growth factor; adenovirus vector 肝炎、肝炎后肝硬化嚴重危害人類健康，通過基因治療手段來預(yù)防和減輕肝損傷是近年來人們研究的一個新方向。IL10是一個多效性細胞因子， 具有廣泛的生物學(xué)作用。研究表明內(nèi)源性IL10 對肝細胞具有保護作用，而且給予外源性IL10 也顯示了明顯的抗肝細胞損傷作用[1，2]。肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor， HGF)被認為是最強的肝再生促進劑，是一種具有多功能的生物大分子，它有強效的抗肝炎、促肝再生作用[3，4]。本研究擬構(gòu)建人IL10和HGF雙表達的重組腺病毒hIL10-HGF，為腺病毒介導(dǎo)IL10及HGF基因治療肝炎、預(yù)防肝損傷建立實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株 含HGF基因的質(zhì)粒pCDNA3HGF由江蘇省人民醫(yī)院血液科惠贈，含hIL10基因的質(zhì)粒pDC316EGFPhIL10，pIRES，pDC315，pDC312，大腸埃希菌菌株Top10、腺病毒骨架質(zhì)粒、腺病毒包裝細胞HEK293細胞和肝癌BEL7402、正常肝臟WRL68細胞均由南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細胞生物學(xué)實驗室惠贈。

1.1.2 酶類和主要試劑 限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、Taq DNA聚合酶、Pyrobest DNA，DNA 標準參照物、蛋白酶K購自Takara公司;DMEM購自Gibco BRL公司;DMSO為Amresco公司產(chǎn)品;胎牛血清購自杭州四季清公司，56℃滅活30 min;轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司;0.22 μm無菌濾器及濾膜購自Millipore公司;膠回收純化試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購自AXYGEN公司，引物由上海生工公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 PCR法擴增目的基因 以pDC316hIL10EGFP和pCDNA3hHGF為模板，hIL10上下游引物5′端分別引入NheI和EcoRI的位點，上游引物P1：5′CGGCTAGCACCATGCACAGCTCAGCACTGC3′;下游引物P2：5′GAGAATTCTCAGTTTCGTATCTTC3′;HGF上下游引物5′端分別引入XbaⅠ和SalⅠ酶切位點，P3：5′GCTCTAGAACCATGTGGGTGACCAAACTC3′;下游引物P4：5′GAGTCGACCTATGACTGTGGTAC 3′; 94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)，72℃連續(xù)延伸7 min。擴增完畢后進行膠回收獲得目的片段。

1.2.2 測序質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 NheⅠ，EcoRⅠ和XbaⅠ，SalⅠ分別酶切pIRES及目的片段，割膠回收純化，用T4 DNA連接酶與hIL10，hHGF連接，片段∶載體=3∶1(摩爾比)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)，涂布于含50 mg/L氨芐西林的LB瓊脂平板，37℃，220 r/min恒溫搖床振搖16 h。抽提質(zhì)粒，30 μl ddH2O溶解。取10 μl抽提質(zhì)粒和載體pDC312分別用NheⅠ，SalⅠ酶切，產(chǎn)物電泳，割膠回收hIL10IREShHGF片段和線性化載體pDC312，T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化，抽提質(zhì)粒，酶切鑒定。取鑒定陽性的質(zhì)粒1～2 μl送上海生工公司測序，測序正確的質(zhì)粒命名為pDC312hIL10IREShHGF。

1.2.3 重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 NheⅠ、SalⅠ酶切pDC312hIL10IREShHGF，0.8%瓊脂糖凝膠電泳，回收產(chǎn)物，30 μl ddH2O溶解，T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)，與含50 mg/L氨芐西林的LB瓊脂平板篩選，挑取20個最小克隆接種至2 ml LBAmp+(50 μg/ml)液體培養(yǎng)基，37℃，220 r/min恒溫搖床振搖過夜，取菌液進行菌液電泳，選出可疑陽性的菌株進行PCR鑒定，確定含2 200 bp和540 bp條帶后，選兩個陽性菌株進行大量擴增，采用堿裂解法抽提質(zhì)粒，獲得pDC315hIL10IREShHGF。

1.2.4 腺病毒的包裝、鑒定及擴增 2 μg質(zhì)粒和2 μg腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，37℃ 5%CO2培養(yǎng)5～7 d，細胞病變，-80℃、37℃水浴凍融5次收集病毒，再次感染HEK293細胞，最終收集的PBS重懸病毒上清，PCR鑒定，分別以含目的基因的重組穿梭質(zhì)粒、重組腺病毒及不含目的基因的重組腺病毒為模板進行擴增，反應(yīng)條件同“1.2.1”，鑒定后-80℃分裝保存。重組腺病毒命名為AdhIL10hHGF。

1.2.5 TCID50法滴定重組腺病毒效價 10%的培養(yǎng)液調(diào)整HEK293細胞為1×105個/ml，接種至96孔板，100 μl/孔，培養(yǎng)24 h;分別加入10-1～10-12濃度的病毒，留最后兩孔加入無血清培養(yǎng)基作為對照孔，每組設(shè)8孔，培養(yǎng)10 d，每天觀察細胞病變效應(yīng)情況。

1.2.6 重組腺病毒載體在BEL7402和WRL68中的表達 取BEL7402和WRL68細胞傳于6孔板，貼壁后24 h吸棄培養(yǎng)液，滅菌PBS(1×)洗2～3遍，加入MOI=20的AdhIL10hHGF轉(zhuǎn)染液，45 min搖勻1次，90 min后棄去轉(zhuǎn)染液，加入含5%胎牛血清的DMEM，培養(yǎng)72 h，顯微鏡下觀察細胞有無變圓和蝕斑現(xiàn)象，ELISA檢測上清液中hIL10和hHGF的含量。

2 結(jié) 果

2.1 目的片段PCR擴增結(jié)果

以pDC316EGFPhIL10和pCDNA3hHGF為模板，PCR擴增出預(yù)期片段，約540 bp的hIL10基因片段和2 200 bp的hHGF基因片段(圖1)。

2.2 pIREShIL10hHGF和 pDC312hIL10IREShHGF的酶切鑒定結(jié)果

用NheⅠ，SalⅠ酶切pIREShIL10hHGF產(chǎn)生3 400 bp和5 400 bp的兩個片段(圖2a)，用XbaⅠ，SalⅠ酶切pDC312hIL10IREShHGF產(chǎn)生2 200 bp的hHGF和4 540 bp的兩個片段(圖2b)，證明為預(yù)期質(zhì)粒，可用于后續(xù)實驗。

2.3 pDC315hIL10IREShHGF的篩選、鑒定及擴增結(jié)果

pDC312hIL10IREShHGF質(zhì)粒用NheⅠ和SalⅠ雙酶切，釋放3 400 bp大小的片段，與用NheⅠ和SalⅠ雙酶切的pDC315連接得到pDC315hIL10IREShHGF，進行PCR鑒定，證實所得質(zhì)粒正確(圖3a-d)。

(a)菌液電泳篩選，M: DL15000標準參照物，1：pDC315質(zhì)粒，2、3、5、7為可能陽性質(zhì)粒pDC315hIL10IREShHGF; (b)菌液PCR篩選pDC315hIL10IREShHGF，M: DL15000 標準參照物，1:陰性對照，2: pDC316EGFPhIL10質(zhì)粒陽性對照，6，10為hIL10陽性;(c)第6，10號菌液PCR鑒定，M: DL15000標準參照物，1: pCDNA3hHGF質(zhì)粒陽性對照;(d)大提質(zhì)粒pDC315hIL10IREShHGF鑒定，M: DL15000標準參照物，1: pDC315質(zhì)粒，2-4: 質(zhì)粒pDC315hIL10IREShHGF

圖3 pDC315hIL10IREShHGF鑒定

Fig 3 Identification of pasmid pDC315hIL10IREShHGF

2.4 病毒滴度測定結(jié)果

重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞4～10 d可見細胞病理效應(yīng)，細胞形態(tài)變圓，細胞核增大，細胞貼壁性降低，有死亡漂浮的細胞等。擴增病毒的滴度為1×109 pfu/ml。

2.5 AdhIL10hHGF的PCR鑒定結(jié)果

AdhIL10hHGF經(jīng)PCR鑒定，擴增出2 200 bp的hHGF 和540 bp的hIL10條帶，證實所得病毒正確(圖4)。

M1: 10000 標準參照物，1，2: hHGF陽性，3，4: hIL10陽性，M2: DL2000 標準參照物

圖4 腺病毒擴增后PCR鑒定

Fig 4 PCR identification of AdhIL10hHGF

2.6 AdhIL10hHGF在BEL7402和WRL68中的表達

BEL7402和WRL68細胞感染AdhIL10hHGF 72 h后，ELISA檢測上清液中hIL10和hHGF的含量，結(jié)果表達hIL10的量分別為(6 271.7±5.2) pg/ml和(350.6±12.4) pg/ml，表達hHGF的量分別為(20 827.1±345.5) pg/ml和(201.6±10.1) pg/ml 。

3 討 論

肝炎、肝炎后肝硬化和肝癌嚴重危害人類健康，盡管經(jīng)過數(shù)十年，幾代科學(xué)家的共同努力，對這些疾病的診斷及治療已取得了重要進展，但對絕大多數(shù)晚期病例尚缺乏有效治療手段。通過基因治療手段來預(yù)防和減輕肝損傷是近年來人們研究的一個新方向。

肝細胞生長因子在肝臟中主要由非實質(zhì)性細胞如肝星狀細胞和血竇內(nèi)皮細胞分泌，Kupffer細胞也少量分泌，實驗表明[5]，HGF是肝細胞生長和DNA合成最強大的刺激劑， HGF通過旁分泌和自分泌機制啟動肝臟再生，刺激肝細胞的生長。在肝纖維化的過程中，HGF起到了抑制肝纖維化的作用，還可用來治療急慢性腎功能不全、肺炎、肺纖維化、外傷、胃潰瘍以及循環(huán)系統(tǒng)等疾病。HGF的這種廣泛而有效的藥理治療作用，促使眾多的醫(yī)藥研究者們投入到HGF的開發(fā)研究中。用HGF治療疾病也可采取蛋白制劑給藥，但因HGF半衰期較短，因而需要大量反復(fù)應(yīng)用才能維持局部較高的藥物濃度，有時即使重復(fù)應(yīng)用也難達到有效的濃度，因此應(yīng)用蛋白制劑費用較高，故近年來興起基因治療的方法。

人IL10 主要由單核細胞、巨噬細胞、T和B淋巴細胞分泌，現(xiàn)已證實Th1和Th2細胞受刺激后均可分泌IL10，肝內(nèi)kupffer細胞也可分泌，而且是肝內(nèi)IL10 的主要來源[6]。IL10具有維持機體免疫反應(yīng)穩(wěn)定，抑制病原體引起對機體有害炎癥反應(yīng)的功能。IL10在控制局部炎癥特性上對肝臟起保護作用，并通過抑制炎癥介質(zhì)的釋放、核因子κB活性等途徑阻止肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展[7]。因此IL10具有潛在的強大抗肝纖維化作用，有望成為抗肝纖維化基因治療新的有效目的基因。

腺病毒載體是目前發(fā)展得較快的載體系統(tǒng)，它以遺傳毒性低、致病性小、宿主范圍廣、滴度高、感染效率高和裝載容量大等優(yōu)勢已廣泛用于基因治療，也為體內(nèi)外轉(zhuǎn)染肝細胞進行基因治療提供了有力的保證[8]。保護肝細胞的基因治療目的基因既要能快速表達，又不必長時間持續(xù)地表達，這也正是我們構(gòu)建攜帶人IL10基因和HGF基因的腺病毒載體進行體內(nèi)轉(zhuǎn)染肝細胞研究的重要出發(fā)點之一。

本實驗通過PCR鑒定、限制性酶切分析及序列測定，均證明已正確構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pDC315hIL10IREShHGF，并在HEK293細胞中與腺病毒骨架質(zhì)粒同源重組，成功包裝重組腺病毒hIL10hHGF。本研究所構(gòu)建的AdhIL10hHGF能在體外感染肝臟細胞和肝癌細胞，并成功表達出hIL10和hHGF，為進一步研究AdhIL10hHGF在動物體內(nèi)抗肝炎、肝纖維化作用奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻

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[3] Lindroos PM， Zarnegar R， Michalopoulos GK， et al. Hepatocyte growth factor rapidly increases in plasma before DNA synthesis and liver regeneration stimulated by partial hepatectomy and carbon tetrachloride administration[J]. Hepatology， 1991，13(4):743-750.

[4] Thatch KA， Schwartz MZ， Yoo EY， et al. Modulation of the inflammatory response and apoptosis using epidermal growth factor and hepatocyte growth factor in a liver jnjury model: a potential approach to the management and treatment of cholestatic liver disease[J]. J Pediatr Sur， 2008，43(12 ):2169-2173.

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[6] Platzer C， Dcke W， Volk H，et al. Catecholamines trigger IL10 release in acute systemic stress reaction by direct stimulation of its promoter/enhancer activity in monocytic cells[J]. J Neuroimmunol， 2000，105(1):31-38.

第9篇：堅定的錫兵范文

1、正確、工整地抄寫下面的漢字。(5分)

端 希 朋 從 竹

2、讀拼音，寫漢字。(24分

bì 　fēnɡ　 yǐnɡ lánɡ

水　秀 倒 　畫

yā ōu 　 　 dù 　 　 yàn

烏 海 鵑 大

yǒnɡ yǒnɡ qí 　qí

遠　敢　好　下

chì chì cónɡ 　 cónɡ

腳膀　花　順

zhuān xīn 　zhì zhì tiān chánɡ rì jiǔ

3、寫出帶有下列偏旁的字。(4分)

4、填上合適的詞語(6分)

一( 把 )雨傘 ( 歡樂 )的潑水節(jié) ( 飛快 )地前進

一( )黑板 ( )的蝴蝶谷 ( )地爬行

一( )針 ( )的鳥窩 ( )地計算

5、照樣子寫詞語。(6分)

(1)黑乎乎綠油油

( 2 )馬馬虎虎 平平安安

6、選詞填空。(8分)

傳揚　表揚

(1)老師常常()學(xué)習(xí)有進步的同學(xué)。

(2)勝利的消息很快在村子里(　)開來。

激動　感動

(3)仙人被沉香的孝心(　)了，送他一把神斧。沉香拿著神斧，想到就要劈開華山，見到媽媽，心

里很(　)。

黃黃的　藍藍的　尖尖的　茂密的

(4)星期天，我坐在陽臺上畫畫，我先在紙上畫了一片(　)森林。又在森林的上方畫了(　)

天空和幾朵白云，然后，我在森林中畫了幾只小鳥，(　)羽毛，(　)小嘴，可愛極了。最后，我給

畫兒起了一個名字：小鳥的家。

二、按課文內(nèi)容完成練習(xí)。(23分)

1.把詞語補充完整(6分)

來 往 烘 托 活 虎

習(xí) 武 五 顏 中 外

2.按課文內(nèi)容填空。(17分)

① 節(jié)，家家 。我一邊吃 　 　 ，一邊聽爺爺講有關(guān)月

亮的故事。春節(jié)到了,我們一起吃 ,去 年。(5分)

②我想變 　的星星，我想變　 的新月。最后，我看見小

小的 　，真想變成大大的 。(4分)

③ 好雨知時節(jié)，當春乃發(fā)生。 ， 。(4分)

④ 通過學(xué)課文，我們讀懂了許多有趣的故事：《狐假虎威》說的是：狡猾的

借著老虎的 ，把百獸嚇跑了?！逗诎迮芰恕分v的是物理學(xué)家

的故事。他搞科學(xué)研究非常 。(4分)

三、課外閱讀(12分)

1.安徒生是( )國的童話作家，世界文學(xué)童話創(chuàng)始人，被世人公認是 “童話”。

A.中國 B.美國 C.丹麥

2.《海的女兒》中的小公主最后化成了( )

A.泡沫 B.海水 C.海草 D.小精靈

3.《打火匣》中士兵用火擦打火匣，馬上出現(xiàn)了( )

A. 巫婆 B.狗 C.公主

4.《賣火柴的小女孩》中的小女孩最后在亮光中看到了( )

A.烤鵝 B.圣誕樹 C.奶奶 D.糖果

5.《野天鵝》中，妹妹編織( )救了十一位哥哥。

A.披風(fēng) B.衣服 C.帽子 D.鞋子

6.《堅定的錫兵》中，只有一只腳的錫兵，最后變成了什么?( )

A.錫塊 B.錫勺子 C.錫心 D.錫兵

四、看圖寫話。(12分)

仔細看圖，接著開頭的話編個小故事。

花傘借給誰?

小花貓有一把花傘。一天，下大雨了，青蛙、烏龜、小鴨、大公雞從它的門前走過。

一、識字寫字(53分)

1、端 希 朋 從 竹

2、碧、峰、影、廊 鴉、鷗、杜、雁 永、勇、奇、棋子

赤、翅、叢、從 專心致志 天長日久

3、菠、蘿 朗、腿 裙、衫 松、樹

4、塊 迷人 慢慢

根 小巧 飛快

5、(1)黃燦燦 紅通通

(2)家家戶戶 高高興興

6、(1)表揚 (2)傳揚 (3)感動 激動

(4)茂密的 藍藍的 黃黃的 尖尖的

二、按課文內(nèi)容完成練習(xí)。(23分)

1、寒暑 云月 生龍

練功 六色 古今

2、

(1)中秋 團圓 月餅 餃子 拜

(2)眨眼 彎彎 荷塘 荷葉

(3)隨風(fēng)潛入夜，潤物細無聲。

(4)狐貍 威風(fēng) 安培 專心

三、課外閱讀(12分)

1、C 2、A 3、B 4、C 5、A 6、A