淺說對生長因子與口腔黏膜的研究
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1實驗
無菌條件下取行智齒拔除術(shù)或牙齒助萌術(shù)患者健康牙齦組織，PBS(pH=7.4)徹底沖洗后，加入Dispase溶液2.0-3.0mL，4℃條件下消化過夜；次日，終止消化后，用眼科鑷將組織的表皮層與真皮層分離，將真皮層組織剪碎后，加入0.1%Ⅰ型膠原酶2.0-3.0mL，37℃條件下間斷震蕩消化3h，PBS終止消化后，過篩，1000r/min離心5min后，棄上清，用細胞培養(yǎng)液(DMEM+體積分數(shù)10%血清+1%雙抗)重懸細胞，在37℃、體積分數(shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)三四天，細胞貼壁后換液，以后每兩三天換液1次，待細胞融合達到70%-80%時，傳代擴增。脂肪干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定：無菌條件下取本院整形外科20-30歲吸脂患者的皮下脂肪5-10mL，PBS徹底沖洗，剔除血管和筋膜后剪碎，0.1%Ⅰ型膠原酶37℃水浴消化，20-30min后終止，過篩、離心后用人脂肪干細胞的專用培養(yǎng)液重懸細胞，接種于25mm2培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)條件同前。待細胞傳至第3代時，做流式鑒定(選取的表面標(biāo)志為CD13，CD14，CD44，CD90，CD105，CD34)和多向誘導(dǎo)分化，成脂誘導(dǎo)14d后，油紅O染色；成骨誘導(dǎo)14d后，茜素紅染色；成神經(jīng)元誘導(dǎo)7d后甲苯胺藍染色。脂肪干細胞條件培養(yǎng)液的制備及蛋白芯片分析：選擇生長良好的第3代脂肪干細胞，待細胞融合達80%時，換無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，收集上清，1000r/min離心5min，保留上清，0.22μm濾膜過濾，分裝，-80℃凍存?zhèn)溆谩Ｈ?mL脂肪干細胞條件培養(yǎng)液，采用蛋白芯片法對其蛋白含量進行檢測分析，此法可針對507種細胞因子的含量進行定性及半定量檢測，檢測步驟及分析方法參考RayBioBiotinLabel-basedHumanAntibodyArrayI說明書(Cat#:AAH-BLM-1-2)。
脂肪干細胞條件培養(yǎng)液中血管內(nèi)皮生長因子、血小板源性生長因子及堿性成纖維細胞生長因子對口腔黏膜成纖維細胞增殖的影響：選擇第3-5代口腔黏膜成纖維細胞，待細胞融合達到70%-80%時，胰酶消化1min，終止消化后將細胞制成濃度為5×107L-1的細胞懸液，種于96孔板中(100μL/孔)，約4h待細胞貼壁后換液，分別設(shè)陰性對照組(DMEM/F12)、空白對照組(脂肪干細胞條件培養(yǎng)液)、血管內(nèi)皮生長因子、血小板源性生長因子以及堿性成纖維細胞生長因子3種因子的濃度梯度實驗組(脂肪干細胞條件培養(yǎng)液+1，10，20，50，100μg/L質(zhì)量濃度的因子)，以及分別加入各上述因子中和抗體的實驗組(脂肪干細胞條件培養(yǎng)液+中和抗體)，每組設(shè)5個復(fù)孔。采用CCK-8法，用酶標(biāo)儀在光波波長為450nm的條件下，分別于1，2，3，4，5d檢測各組的吸光度值(A)，比較在對數(shù)生長期(第3天)時各濃度梯度下血管內(nèi)皮生長因子、血小板源性生長因子以及堿性成纖維細胞生長因子3種因子對口腔黏膜成纖維細胞增殖的影響。主要觀察指標(biāo)：①脂肪干細胞條件培養(yǎng)液蛋白芯片分析結(jié)果。②脂肪干細胞條件培養(yǎng)液中血管內(nèi)皮生長因子、血小板源性生長因子以及堿性成纖維細胞生長因子對口腔黏膜成纖維細胞增殖的影響。統(tǒng)計學(xué)分析：實驗數(shù)據(jù)均以x_±s表示，趙佳佳和胡麗應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件對資料進行分析。多組間差異比較用方差分析，兩組間差異比較用t檢驗，以P<0.05為差異有顯著性意義
2結(jié)果
2.1細胞培養(yǎng)結(jié)果
口腔黏膜成纖維細胞扁平，呈梭形，脂肪干細胞原代接種后，由短梭形和多角形逐漸變?yōu)殚L梭形流式檢測結(jié)果顯示人脂肪干細胞高表達CD13(99.49%)，CD44(92.13%)，CD90(97.78%)，CD105(96.82%)，而低表達CD14(1.14%)，CD34(2.71%)。脂肪干細胞成脂、成骨及成神經(jīng)元細胞誘導(dǎo)及鑒定結(jié)果
2.2脂肪干細胞條件
培養(yǎng)液蛋白芯片分析結(jié)果檢測脂肪干細胞條件培養(yǎng)液中507種因子的信號平均值見表1，其中血管內(nèi)皮生長因子(信號值SV=360.5)、血小板源性生長因子(信號值SV=363.5)以及堿性成纖維細胞生長因子(信號值SV=389.5)信號平均值均大于300，與陰性對照組比較差異有非常顯著性意義(P<0.001)。
2.3脂肪干細胞條件
培養(yǎng)液中血管內(nèi)皮生長因子、血小板源性生長因子以及堿性成纖維細胞生長因子對口腔黏膜成纖維細胞增殖的影響結(jié)果顯示，脂肪干細胞條件培養(yǎng)液對口腔黏膜成纖維細胞增殖有明顯的促進作用，差異有顯著性意義(P≤0.05)進一步研究發(fā)現(xiàn)，在脂肪干細胞條件培養(yǎng)液中，血小板源性生長因子以及堿性成纖維細胞生長因子對成纖維細胞增殖有明顯的促進作用，且隨著因子濃度的增高而呈現(xiàn)峰值性改變，其中堿性成纖維細胞生長因子對成纖維細胞增殖的促進作用在1μg/L時即達到了峰值，且在脂肪干細胞條件培養(yǎng)液中加入堿性成纖維細胞生長因子的中和抗體后，明顯抑制了脂肪干細胞條件培養(yǎng)液對成纖維細胞的增殖作用血小板源性生長因子對成纖維細胞增殖的促進作用在50μg/L時達到了峰值，且在脂肪干細胞條件培養(yǎng)液中加入血小板源性生長因子的中和抗體后，也可明顯抑制脂肪干細胞條件培養(yǎng)液對成纖維細胞的增殖作用，差異有顯著性意義(P≤0.05)；而血管內(nèi)皮生長因子對成纖維細胞的增殖并沒有明顯的促進作用，且在脂肪干細胞條件培養(yǎng)液中加入血管內(nèi)皮生長因子的中和抗體后，也沒有明顯抑制脂肪干細胞條件培養(yǎng)液對成纖維細胞的增殖作用
3討論
在正常的生理情況下，口腔黏膜相對于皮膚而言，具有創(chuàng)傷后愈合快，形成瘢痕組織少的特點。然而，在一些病理條件下，如復(fù)發(fā)性阿弗他口腔潰瘍，口腔黏膜大面積缺損等臨床病例中，由于全身因素及細胞所處的微環(huán)境等條件的改變，如嚴重的炎癥反應(yīng)等，黏膜的愈合能力受到了限制，創(chuàng)面愈合延遲，且更易形成瘢痕組織。值得關(guān)注的是，脂肪干細胞除了具有易于分離、培養(yǎng)和擴增，免疫調(diào)節(jié)性，可以被反轉(zhuǎn)錄病毒高效轉(zhuǎn)染等其他成體干細胞所不能比擬的優(yōu)越性能之外，脂肪干細胞有向炎癥和受損組織部位歸巢的特性，而其分泌的細胞因子也可以為受損組織提供營養(yǎng)支持。因此，實驗通過研究脂肪干細胞分泌的生長因子對口腔黏膜成纖維細胞增殖的影響，從一方面證實了其對口腔黏膜創(chuàng)傷修復(fù)的促進作用，為脂肪干細胞及其分泌的生長因子在口腔黏膜創(chuàng)傷修復(fù)中的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。實驗結(jié)果顯示，脂肪干細胞條件培養(yǎng)液對口腔黏膜成纖維細胞遷移具有明顯的促進作用，為了探究脂肪干細胞條件培養(yǎng)液中促進創(chuàng)傷修復(fù)的因子種類，本實驗對脂肪干細胞條件培養(yǎng)液進行了蛋白芯片分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在表達量較高(>300倍)的57種相關(guān)活性因子中(數(shù)據(jù)未顯示)，有的因子對血管再生具有明顯的促進作用，如血管生成素1，4、內(nèi)皮素、血小板反應(yīng)蛋白以及白細胞介素22等；有的因子，包括血管內(nèi)皮生長因子、血小板源性生長因子、表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、巨噬細胞刺激蛋白等在內(nèi)，對與創(chuàng)傷修復(fù)相關(guān)的效應(yīng)細胞的遷移和增殖具有明顯的促進作用，利于血管形成以及上皮再生；除此之外，這次實驗發(fā)現(xiàn)脂肪干細胞條件培養(yǎng)液中還具有一些特殊效應(yīng)的因子，如外異蛋白A2，該因子是腫瘤壞死因子家族的成員之一，與外胚層器官，尤其是皮膚附屬器，如毛囊、汗腺的發(fā)育密切相關(guān)。
上述結(jié)果證實，脂肪干細胞條件培養(yǎng)液中含有多種脂肪干細胞分泌的，與創(chuàng)傷修復(fù)相關(guān)的生物活性因子，各種因子共同作用，在創(chuàng)傷修復(fù)的各個階段，促進創(chuàng)傷的愈合。為了進一步探究脂肪干細胞條件培養(yǎng)液在創(chuàng)傷修復(fù)過程中對口腔黏膜成纖維細胞增殖的影響及作用機制，這次實驗選擇血管內(nèi)皮生長因子、血小板源性生長因子和堿性成纖維細胞生長因子，這3種與細胞增殖及遷移密切相關(guān)且在脂肪干細胞條件培養(yǎng)液中高表達(>300倍)的細胞因子，分別檢測其對口腔黏膜成纖維細胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血小板源性生長因子和堿性成纖維細胞生長因子對成纖維細胞的增殖有明顯的促進作用，且隨著因子濃度的增高而呈現(xiàn)峰值性改變，其中堿性成纖維細胞生長因子對成纖維細胞增殖的促進作用在1μg/L時即達到了峰值，血小板源性生長因子對成纖維細胞增殖的促進作用在50μg/L時達到了峰值，且分別在脂肪干細胞條件培養(yǎng)液中加入兩者的中和抗體圖8血小板源性生長因子對口腔黏膜成纖維細胞增殖的作用Figure8Effectofplatelet-derivedgrowthfactorontheproliferationoforalmucosafibroblasts1.00.90.80.70.60.50.40.30.20.10A空白對照組與空白對照組比較，aP<0.05。注：血小板源性生長因子對成纖維細胞增殖的促進作用在50μg/L時達到了峰值，且在脂肪干細胞條件培養(yǎng)液中加入血小板源性生長因子的中和抗體后，也可明顯抑制脂肪干細胞條件培養(yǎng)液對成纖維細胞的增殖作用。中和抗體組aaa1102050100堿性成纖維細胞生長因子(μg/L)圖9血管內(nèi)皮生長因子因子對口腔黏膜成纖維細胞增殖的作用Figure9Effectofvascularendothelialgrowthfactorontheproliferationoforalmucosafibroblasts1.00.90.80.70.60.50.40.30.20.10A空白對照組注：血管內(nèi)皮生長因子對成纖維細胞增殖沒有明顯的促進作用，且在脂肪干細胞條件培養(yǎng)液中加入血管內(nèi)皮生長因子的中和抗體后，也沒有明顯抑制脂肪干細胞條件培養(yǎng)液對成纖維細胞的增殖作用。中和抗體組1102050100堿性成纖維細胞生長因子(μg/L)后，脂肪干細胞條件培養(yǎng)液對成纖維細胞增殖的作用得到了顯著的抑制，結(jié)果有顯著性差異(P≤0.05)。
同時，實驗發(fā)現(xiàn)，雖然血小板源性生長因子和堿性成纖維細胞生長因子對成纖維細胞的增殖具有明顯促進作用，但是有各自的適宜濃度，高濃度的堿性成纖維細胞生長因子(≥20μg/L)和低濃度的血小板源性生長因子(≤20μg/L)對成纖維細胞增殖的促進作用并不是很明顯。上述結(jié)果提示，在脂肪干細胞條件培養(yǎng)液中，對成纖維細胞的增殖具有明顯促進作用的因子可能為血小板源性生長因子和堿性成纖維細胞生長因子，且這種作用對因子的濃度具有依賴性和適宜性。堿性成纖維細胞生長因子是一類研究比較成熟的生長因子，在體內(nèi)外均可表現(xiàn)出廣泛的生物學(xué)活性。堿性成纖維細胞生長因子來源于成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞、軟骨細胞等，其基本生物學(xué)作用是促進細胞分裂增殖,可增強有絲分裂活性。大量體外及體內(nèi)研究證實，組織損傷后，局部堿性成纖維細胞生長因子表達增加，通過趨化作用使炎癥細胞，成纖維細胞等向損傷部位聚集，同時通過促進效應(yīng)細胞增殖，遷移，促進血管及肉芽組織的形成，從而促進損傷修復(fù)與重建。除此之外，近年來，越來越多的文獻報道，在口腔中，堿性成纖維細胞生長因子對牙周膜組織中的成纖維細胞及牙髓細胞均具有促進其增殖和遷移的作用。
大量研究證實，血小板源性生長因子可由多種細胞，例如成纖維細胞、炎癥細胞等分泌合成，其在體內(nèi)體外均具有豐富的生物學(xué)活性，與創(chuàng)傷修復(fù)過程有密切的聯(lián)系，其中，一個重要的機制即促進成纖維細胞的增殖和遷移。近年來，亦有研究證實，在口腔中血小板源性生長因子具有促進牙齦及牙周膜組織中成纖維細胞增殖和遷移的作用。上述實驗結(jié)果提示，在創(chuàng)傷修復(fù)的早期階段，可以通過調(diào)節(jié)脂肪干細胞條件培養(yǎng)液中因子種類，并適當(dāng)選擇和提高脂肪干細胞條件培養(yǎng)液中血小板源性生長因子和堿性成纖維細胞生長因子等細胞因子的濃度，從而促進口腔黏膜成纖維細胞增殖，將利于脂肪干細胞條件培養(yǎng)液在創(chuàng)傷修復(fù)中的應(yīng)用。血管內(nèi)皮生長因子屬于血小板源性生長因子/血管內(nèi)皮生長因子家族，主要作用于內(nèi)皮細胞，相關(guān)研究證實，血管內(nèi)皮生長因子具有提高血管滲透性，促進內(nèi)皮細胞的生長和遷移，抑制細胞凋亡等生物學(xué)活性，從而可以促進血管的發(fā)生和生成，在創(chuàng)傷修復(fù)過程發(fā)揮重要的作用。然而，本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子對成纖維細胞增殖并沒有顯著的促進作用，上述結(jié)果提示，黏膜成纖維細胞的增殖很可能并不是由血管內(nèi)皮生長因子進行調(diào)節(jié)的。
4結(jié)論
綜上所述，在創(chuàng)傷修復(fù)過程中，脂肪干細胞條件培養(yǎng)液可以促進口腔黏膜成纖維細胞的增殖，且脂肪干細胞條件培養(yǎng)液中的多種生物活性因子可以共同促進創(chuàng)傷修復(fù)，因此，相較于單一應(yīng)用的商品化生產(chǎn)的細胞因子，脂肪干細胞條件培養(yǎng)液更具有其臨床應(yīng)用前景。然而創(chuàng)傷修復(fù)是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，血管內(nèi)皮生長因子、血管源性生長因子和堿性成纖維細胞生長因子對成纖維細胞增殖的作用機制仍需要體內(nèi)實驗的驗證；另外，脂肪干細胞條件培養(yǎng)液中其他因子對創(chuàng)傷修復(fù)的作用及其作用機制仍將是后續(xù)的研究方向。
作者：趙佳佳 胡麗 劉加榮 宮妮雅 陳莉莉 單位：華中科技大學(xué)