人參果抗腫瘤細胞研究

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本文作者：李麗靜 張亞杰 劉 佳 吳世佳 張 淞 王 蔚 王 威 王繼彥 單位：長春中醫(yī)藥大學藥學院中藥藥理教研室

人參PanaxginsengC．A．Meyer為五加科人參屬植物，不但其根藥用且其莖葉亦供藥用，并有廣泛的生物學活性，但果實研究較少。課題組近10年的研究表明，人參果含有人參皂苷并具有一定的生物活性，從人參漿果中分離得到人參果總皂苷，經(jīng)分離鑒定含有異人參皂苷Rh3、人參皂苷Rh2、人參皂苷Rh1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd、人參皂苷Rc、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb1、β-谷甾醇和化合物K等12個化合物及5個待鑒定化合物［1、2］。為觀察其抗腫瘤活性及機制，我們進行了如下研究。

1材料與方法

1.1材料與試劑人參果總皂苷為五加科植物人參PanaxginsengC．A．Mey．的成熟干燥漿果中提取的總皂苷，由課題組化學組提供。人肺腺癌細胞(SPC-A1)、人胃腺癌(SGC-7901)、人宮頸癌細胞(Hela)、人結腸癌細胞(SW-111C)和人神經(jīng)膠質瘤細胞(U251)等5個人腫瘤細胞株購自吉林省腫瘤醫(yī)院;噻唑藍(MTT)和二甲基亞礬(DMSO)購自美國Sigma公司;RPMI-1640為美國GIBCO產(chǎn)品;胎牛血清(進口分裝)、雙抗、谷氨酰胺，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、Hank’液、0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)均購自中國協(xié)和醫(yī)科大學細胞中心。二氧化碳培養(yǎng)箱(ESPECBNA-321D型)、倒置顯微鏡(日本Olympus光學工業(yè)株式會社);100級超凈工作室(蘇州);離心機(北京離心機廠);酶標儀(BioRad560型);透射電子顯微鏡(TECNAIG2，荷蘭)。

1.2細胞培養(yǎng)5種腫瘤細胞株按常規(guī)方法培養(yǎng)傳代，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、2μmol/L谷氨酰胺、100U/L青霉素、100mg/L鏈霉素RPMI-1640中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中飽和濕度下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3人參果總皂苷對5種腫瘤細胞增殖影響取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞濃度為1×108L－1接種于96孔培養(yǎng)板，100μL/孔培養(yǎng)24h后，0.5μg/ml的人參果總皂苷，同時設陰性對照組、空白對照組(即只加培養(yǎng)液，不加細胞以調(diào)零)及陽性藥物組(5-FU)，每組均設4復孔。共同培養(yǎng)48h后，每孔加入20μL的5%MTT，再培養(yǎng)4h棄上清，每孔加入150μL的DMSO振蕩10min，應用酶標儀于570nm處測吸光度值(A)。按如下公式計算抑制率:抑制率=(陰性對照A-樣品A陰性對照A)×100%。

1.4人參果總皂苷對5種腫瘤細胞電鏡形態(tài)學觀察細胞以每瓶1×106個接種于50mL培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24h后，加入0.5μg/ml的人參果總皂苷，培養(yǎng)0h、6h、12h、18h、24h和30h后，1500r/min離心5min，收集貼壁及懸浮細胞，細胞沉淀用2.5%戊二醛固定，再用1%鋨酸固定后乙醇脫水，Epon812環(huán)氧樹脂包埋，LKB-Ⅲ型超薄切片機半薄切片定位后做超薄切片，醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡下觀察形態(tài)改變并拍攝照片。

1.5Westernblot免疫印記法檢測人參果總皂苷對相關蛋白表達的影響0.5μg/ml人參果總皂苷分別作用于SPC-A1細胞0h、6h、12h、18h、24h，提取蛋白質進行Western免疫印記法操作，檢測周期相關蛋白cyclin及其相關激酶CDK2和CDK1的蛋白表達量。

1.6統(tǒng)計方法實驗數(shù)據(jù)均用SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計學分析。

2結果

2.1MTT法檢測人參果總皂苷對5種人腫瘤細胞增殖的影響表1顯示，采用MTT法，人肺腺癌細胞(SPC-A1)、人胃腺癌(SGC-7901)、人宮頸癌細胞(Hela)、人結腸癌細胞(SW-111C)和人神經(jīng)膠質瘤細胞(U251)等5個人腫瘤細胞株的作用;0.5μg/ml人參果總皂苷作用于5種人腫瘤細胞48h，對5種腫瘤細胞增殖均有不同程度的抑制作用，其中對SPC-A1細胞的作用最強。

2.2人參果總皂苷對SPC-A1細胞形態(tài)學電鏡觀察電鏡下觀察，未加藥物組細胞形態(tài)完整，呈略不規(guī)則形，細胞表面微絨毛豐富，核呈不規(guī)則形，核仁明顯，胞質內(nèi)可見線粒體，嵴清晰，細胞橋小體使細胞彼此黏附連接成完整的單層細胞;加入0.5μg/ml的人參果總皂苷后，隨藥物作用時間的延長，細胞呈現(xiàn)凋亡改變，藥物作用6h可見細胞表面微絨毛脫落，核小，胞質內(nèi)部分線粒體腫脹，嵴斷裂，有較多溶酶體產(chǎn)生;藥物作用12h，細胞表面微絨毛消失，核仁明顯，胞質內(nèi)出現(xiàn)大量空泡狀結構;藥物作用18h，細胞核內(nèi)異染色體趨邊凝聚呈塊狀，并可見胞質內(nèi)髓樣小體;藥物作用24h、30h，已清晰可見細胞膜包裹細胞器或核片段形成典型的凋亡小體。圖1顯示，通過上述SPC-A1腫瘤細胞在人參果皂苷0.5μg/ml濃度作用下，隨著時間的延長(0h、6h、12h、18h、24h和30h)，肺癌細胞在超微結構上發(fā)生變化，細胞超微結構出現(xiàn)比較典型的細胞凋亡的特征，從形態(tài)學上進一步證明，人生果皂苷誘導肺癌細胞凋亡是其抑制腫瘤細胞生長的作用機制之一。

2.3Western免疫印記法檢測人參果總皂苷對相關蛋白表達的影響圖2顯示，0.5μg/ml人參果總皂苷作用0h、6h、12h、18h、24h，隨時間的推進，cyclin和CDK4的蛋白表達逐漸減少，相關激酶CDK2和CDK1的蛋白表達量隨藥物作用時間的延長均有所增加，推測人參果皂苷可最終引起腫瘤細胞在G2/M期積累，其誘導SPC-A1細胞凋亡與其影響各周期相關蛋白和激酶的表達密切相關。

3討論

惡性腫瘤的本質是細胞周期調(diào)節(jié)失控，進而導致細胞無限制的分裂和增殖。細胞周期的調(diào)控主要是通過G1/S、G2/M2個關鍵限制點進行調(diào)控。Cyclin-CDK-CKI系統(tǒng)是真核細胞最重要的細胞周期調(diào)控系統(tǒng)，CDK是此系統(tǒng)的中心，cyclin具有正性調(diào)控的作用，而CKI則為負性調(diào)控因子。cyclin因其在細胞周期連續(xù)合成不斷積累使活性出現(xiàn)周期性變化而得名，是1組結構類似、能結合并調(diào)CDK的蛋白質，統(tǒng)稱為cyclin家族。細胞周期受細胞周期蛋白(cyclinB1)、細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)及其抑制劑(CKI)的共同調(diào)控。cyclinB1在G2/M期檢查點發(fā)揮重要作用，其水平升高可使細胞周期阻滯在G2/M期的檢查點上［3，4］。CDK是一組絲氨酸-蘇氨酸(Ser-Thr)蛋白激酶，故稱CDK家族。細胞周期檢查機制障礙與腫瘤、衰老、凋亡等的發(fā)生有密切關系。對于G2/M調(diào)控點而言，其進程主要受cyclinB1-CDK1復合物活性調(diào)控［5］。腫瘤細胞的G2/M檢查點失控，以致在DNA復制出現(xiàn)錯誤或復制不全的情況下仍然啟動M期。cyclinD1-CDK4復合物活性，使細胞阻滯于G1期，并誘發(fā)細胞凋亡。同樣抑制cyclinB1-CDK1復合物活性及CDK1蛋白表達，亦能使腫瘤細胞阻滯于G2期，并導致細胞凋亡而達到治療腫瘤的目的［6，7］。本研究結果表明，在離體抗腫瘤實驗中，人參果皂苷對5種人腫瘤細胞均有不同程度的抑制作用。對SPC-A1細胞的作用最強，可以誘導SPC-A1細胞凋亡;0.5μg/ml人參果總皂苷作用0h、6h、12h、18h、24h，隨著時間的推進，cyclin和CDK4的蛋白表達逐漸減少，相關激酶CDK2和CDK1的蛋白表達量隨藥物作用時間的延長均有所增加，推測人參果皂苷可最終引起腫瘤細胞在G2/M期積累，其誘導SPC-A1細胞凋亡與其影響各周期相關蛋白和激酶的表達密切相關。推測其抗腫瘤作用機制通過影響細胞周期相關蛋白cyclin及其激酶(CDK1、CDK2等)，使腫瘤細胞堆積于G2/M期，進而誘導凋亡發(fā)生而完成抑制腫瘤細胞分裂增殖進而殺死腫瘤細胞的全過程。