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生物育種是指人們按照自己的意愿,依據(jù)相關(guān)的育種原理,有目的、有計劃地改變生物的遺傳物質(zhì)以獲得人們所需要的生物新品種。育種的兩種常見思路是:從生物的諸多性狀中把需要的優(yōu)良性狀分離出來或把位于不同個體的優(yōu)良性狀集中到一個個體上來;或者是直接創(chuàng)造具有優(yōu)良性狀的生物新品種。
在遺傳學(xué)上主要涉及六種不同的育種方法:雜交育種,誘變育種,單倍體育種,多倍體育種,基因工程育種,細胞工程育種。
(一)雜交育種
方法步驟:親本雜交得F ,再用F 自交得F ,在F 中篩選所需性狀,若為隱性性狀則必為純合;若為顯性則需經(jīng)過連續(xù)多代自交,直到不發(fā)生性狀分離為止,可得到顯性純種。
育種優(yōu)點:育種的目的性強,通過基因重組,把位于兩個生物體上的優(yōu)良性狀集于一身。
育種缺點:育種年限過長,需及時發(fā)現(xiàn)優(yōu)良性狀。
實例:用抗倒伏不抗銹病的小麥與不抗倒伏抗銹病的小麥培育出既抗倒伏又抗銹病的小麥的新品種。
(二)誘變育種
方法步驟:利用一定劑量的射線、輻射或化學(xué)藥劑處理材料,提高基因突變的頻率,選育所需新品種。
遺傳學(xué)原理:基因突變。
育種優(yōu)點:提高了基因突變的頻率,加速育種過程,大幅度改良生物的性狀,變異范圍廣。
育種缺點:突變具有不定向性,且多害少利,所以需要大量處理實驗材料。
舉例:青霉素高產(chǎn)菌株的獲得。
(三)單倍體育種
方法步驟:將F (雜種)進行花藥離體培養(yǎng),得到單倍體幼苗后再用一定濃度的秋水仙素誘導(dǎo),形成純合多倍體,再從中選擇所需要的類型。
遺傳學(xué)原理:染色體變異。
育種優(yōu)點:與雜交育種相比大大縮短了育種的年限。
育種缺點:需要組織培養(yǎng),技術(shù)難度較高,需與雜交育種結(jié)合,多限于植物。
(四)多倍體育種
方法步驟:利用一定濃度的秋水仙素處理萌發(fā)的種子或幼苗。
遺傳學(xué)原理:染色體變異。
育種優(yōu)點:可培育出自然界沒有的新品種(如八倍體小黑麥),且多倍體莖桿粗壯,葉片、果實和種子都比較大,糖類和蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的含量都有所增加。
育種缺點:結(jié)實率低且晚熟,只適于植物。
舉例:三倍體無籽西瓜的培育。
(五)基因工程育種
方法步驟:提取目的基因,將目的基因與運載體結(jié)合,導(dǎo)入受體細胞,使之在受體細胞中復(fù)制保存并表達,篩選出符合要求的新品種。
遺傳學(xué)原理:基因重組。
育種優(yōu)點:不受種屬限制,可根據(jù)人類的需要,有目的地進行。
育種缺點:技術(shù)難度高,可能會引起生態(tài)危機。
舉例:能分泌人類胰島素的大腸桿菌菌株的獲得,抗蟲棉,轉(zhuǎn)基因動物等。
(六)細胞工程育種
方法步驟:植物:利用聚乙二醇等誘導(dǎo)不同種的細胞融合,經(jīng)組織培養(yǎng)后得到新品種;
動物克隆:核移植胚胎移植。
遺傳學(xué)原理:細胞的全能性。
育種優(yōu)點:克服遠源雜交不親和障礙,有目的地培育優(yōu)良品種;
動物體細胞克隆,可用于保存瀕危物種、保持優(yōu)良品種、挽救瀕危動物。
育種缺點:技術(shù)復(fù)雜,難度大,將對生物多樣性提出挑戰(zhàn)。
二、實例應(yīng)用
例1.
(1)通過花藥離體培養(yǎng)再用秋水仙素加倍得到煙草新品種的方法是 ,依據(jù)的原理是。
(2)用 輻射谷氨酸棒狀桿菌,選育出合成谷氨酸的新品種,所用的方法是 ,依據(jù)的原理是 。
(3)用小麥和黑麥培育八倍體小黑麥屬于 ,依據(jù)的原理是。
(4)用抗倒伏不抗銹病的小麥與易倒伏抗銹病的小麥雜交,培育成既抗倒伏又抗銹病的小麥品種,這屬于 育種,依據(jù)的原理是 。
(5)科學(xué)家將細菌的抗凍基因轉(zhuǎn)移的普通番茄的細胞中培育出番茄抗凍新品種,這屬于,依據(jù)的原理是。
例2.現(xiàn)有味甘汁多、能穩(wěn)定遺傳的綠皮(G)紅瓤(R)小籽(e)西瓜品種甲與白皮(g)黃瓤(r)大籽(E)西瓜品種乙,三對基因自由組合。已知西瓜的染色體數(shù)目2n=22,請根據(jù)下面提供的西瓜育種流程圖回答有關(guān)問題:
(1)圖中①過程中所用的試劑為 ,通過②途徑培育無籽西瓜的方法叫做 ,所結(jié)西瓜果實的基因型和表現(xiàn)型分別為 。
(2)通過③培育無籽西瓜時所用的試劑為 ,瓜農(nóng)用②生產(chǎn)的無籽西瓜比用③生產(chǎn)的更受消費者親睞,原因是,如果選育的品種優(yōu)秀,瓜農(nóng)也樂意采用③途徑生產(chǎn)無籽西瓜,其優(yōu)點是。
(3)通過④細胞融合途徑形成雜種體細胞時,要使用和 兩種化學(xué)物質(zhì)。由該雜種細胞形成雜種植株利用了 原理,使用了 技術(shù)。若用雜種植株去獲得單倍體植株,需要使用的方法是進行培養(yǎng)。
參考答案
1.(1)單倍體育種、染色體變異(2)誘變育種,基因突變(3)多倍體育種,染色體變異(4)雜交育種,基因重組(5)基因工程育種,基因重組
2.(1)秋水仙素,多倍體育種,GGgRRrEee,綠皮紅瓤無籽(2)生長素(類似物),與二倍體相比果實比較大,糖類、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)含量有所增加,省去制種的麻煩或節(jié)約購買三倍體西瓜種子的成本(3)纖維素酶,聚乙二醇,植物細胞全能性,植物組織培養(yǎng),花藥離體培養(yǎng)
關(guān)鍵詞數(shù)量遺傳學(xué);分子遺傳學(xué);動物育種;研究進展
自20世紀80年代以來,隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)和信息技術(shù)的迅速發(fā)展,動物育種計劃和動物分子遺傳學(xué)研究取得了大量的突破性成果,國際上的動物育種已逐漸進入分子水平,從傳統(tǒng)的育種方法朝著快速改變動物基因型甚至是單倍體型的方向發(fā)展。
1數(shù)量遺傳學(xué)與動物育種
數(shù)量遺傳學(xué)選擇原理充分考慮了環(huán)境因素對微效多基因控制的數(shù)量性狀的影響力,從表型方差中剖分出基因型方差,通過運用資料設(shè)計和統(tǒng)計模型估計有關(guān)的遺傳參數(shù),最后達到選種的目的[1-2]。數(shù)量遺傳學(xué)主要應(yīng)用于估計遺傳參數(shù)、通徑分析和動物育種估計的模型方法等幾個方面。
1.1遺傳參數(shù)估計
從統(tǒng)計學(xué)上講,遺傳參數(shù)的估計可歸結(jié)為方差或協(xié)方差組分估計。從親子回歸、同胞分析到方差分析法;到了20世紀50年代,C R Henderson提出了針對非均衡資料的Henderson方法Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ;之后出現(xiàn)了極大似然法約束極大似然法、最小范數(shù)二次無偏估計法和最小方差二次無偏估計法以及貝葉斯估計等方法。目前,約束最大似然法是世界各國育種學(xué)家采用的主要方法。
1.2育種值估計
畜禽遺傳評定即評估畜禽種用價值的高低,是畜禽育種工作的中心任務(wù)。畜禽種用價值的高低是用育種值來衡量的,影響數(shù)量性狀表型值的是微效多基因的加性效應(yīng)值(A)、等位基因之間的顯性效應(yīng)值(D)和非等位基因間的上位效應(yīng)值(I)。其中,只有基因的加性效應(yīng)值即育種值能夠穩(wěn)定的遺傳給后代,但是育種值不能直接測量,只能使用一定的統(tǒng)計學(xué)方法通過表型值對其間接加以估計,所以遺傳評定的主要工作就是對育種值的估計。畜禽的估計育種值是選擇種畜的主要依據(jù),育種值估計的準(zhǔn)確性在很大程度上影響著畜禽育種效果的好壞。用于育種值估計的方法概括起來主要有選擇指數(shù)法、群體比較法和混合線性模型法。
2分子數(shù)量遺傳學(xué)與動物育種
分子數(shù)量遺傳學(xué)是分子生物技術(shù)與數(shù)量遺傳學(xué)相結(jié)合的一門發(fā)展中的新的交叉學(xué)科,目前仍屬于數(shù)量遺傳學(xué)范疇[3-6]?,F(xiàn)代分子生物技術(shù)的發(fā)展,使得從分子水平上研究數(shù)量性狀的基因成為可能。
2.1對QTL作出遺傳標(biāo)記
目前對決定數(shù)量性狀的多基因還不能準(zhǔn)確定位,但如果能找到一個可以識別的基因或基因組的DNA多態(tài),或是一個染色體片段與這一目標(biāo)性狀有密切的關(guān)聯(lián),就可作為對目標(biāo)性狀選擇的遺傳標(biāo)記。遺傳標(biāo)記還可應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)移、基因定位和基因作圖等研究。
2.2QTL的分離和克隆
分子數(shù)量遺傳學(xué)的目標(biāo)是要分離和克隆決定數(shù)量性狀的基因,研究其結(jié)構(gòu)和功能,最終達到從分子水平上改良數(shù)量性狀的目的。雖然在理論上可以將分子生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)展的各種基因克隆技術(shù)用于QTL,但是數(shù)量性狀的遺傳表達一般涉及多個基因座位。例如,奶牛的產(chǎn)奶量既受繁殖和泌乳的內(nèi)分泌系統(tǒng)基因的控制,又受消化酶系統(tǒng)基因的控制,情況相當(dāng)復(fù)雜,很難把這些基因一一分離和克隆。但也可以根據(jù)已有的知識,通過對候選基因的篩選找出一個或幾個對某個數(shù)量性狀有較大效應(yīng)的QTL,就可以對這個QTL用一般的基因克隆方法進行克隆,作為數(shù)量性狀的一個重要基因來研究。例如,有資料報道豬的雌激素受體基因可影響產(chǎn)仔數(shù)1.0~1.5頭。
3動物育種方法前景
動物分子育種是依據(jù)分子數(shù)量遺傳學(xué)理論,利用分子生物學(xué)技術(shù)來改良畜禽品種的一門新型學(xué)科,是傳統(tǒng)的動物育種理論和方法的新發(fā)展。從目前發(fā)展?fàn)顩r來看,它應(yīng)包含兩方面內(nèi)容:以基因組分析為基礎(chǔ)的標(biāo)記輔助選擇和以轉(zhuǎn)基因技術(shù)為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)基因育種。由于動物分子育種是直接在水平上對性狀DNA的基因型進行選擇,因此其選種的準(zhǔn)確性會大大提高;同時轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用還能根據(jù)人們的需求創(chuàng)造出一些非常規(guī)性的畜牧產(chǎn)品[7-8]。可以說,動物分子育種是動物遺傳育種學(xué)科發(fā)展的必然,它將是21世紀動物育種的一種重要方法,對21世紀世界畜牧業(yè)產(chǎn)生巨大的影響。
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二年以上工作經(jīng)驗|男|25歲(1988年9月22日)
居住地:杭州
電 話:189********(手機)
E-mail:
最近工作 [ 1年8個月]
公 司:XXX師范大學(xué)生物科學(xué)
行 業(yè):生物科學(xué)
職 位:技術(shù)碩士
最高學(xué)歷
學(xué) 歷:本科
?!I(yè):生物科學(xué),技術(shù)
學(xué) 校:哈爾濱師范大學(xué)
自我評價
熟悉分子生物學(xué)及細胞,蛋白等多方面的實驗技能,有良好的理論及實驗基礎(chǔ),有較強團隊合作精神和學(xué)習(xí)能力,在兩年多的工作實踐中熟練掌握了慢病毒載體系統(tǒng)以及腺病毒載體系統(tǒng)的構(gòu)建病毒包裝,干擾篩選,穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建等細胞生物學(xué)技能,一直從事項目服務(wù)行業(yè),了解項目服務(wù)的情況。
求職意向
到崗時間:一個月之內(nèi)
工作性質(zhì):全職
希望行業(yè):生物科學(xué)
目標(biāo)地點:杭州
期望月薪:面議/月
目標(biāo)職能:技術(shù)碩士
工作經(jīng)驗
2012 /7—至今:XXX師范大學(xué)生物科學(xué)[1年8個月]
所屬行業(yè): 生物科學(xué)
化學(xué)部技術(shù)碩士
1. 生物化學(xué),基因工程,生物技術(shù),細胞生物學(xué),遺傳學(xué),微生物學(xué),生物統(tǒng)計學(xué),發(fā)酵工程,生化工程,微生物遺傳學(xué)。
2. 植物組織培養(yǎng),動物學(xué),植物學(xué),分子遺傳 學(xué),細胞遺傳學(xué)及染色體工程。
3. 細胞遺傳學(xué)實驗,現(xiàn)代遺傳學(xué)講座,基因工程原理與技術(shù)。
4. 基因組學(xué),葉綠體基因工程,生物電鏡應(yīng)用,生物信息學(xué)。
5. 實驗設(shè)計與統(tǒng) 計分析 ,生物學(xué)中的計算機應(yīng)用, 文獻檢索等課程。
2011 /6—2012 /6:XX生物技術(shù)有限公司[1年]
所屬行業(yè): 制藥/生物工程
科研部 科研管理人員
1、 隸屬于部門細胞組,主要進行細胞相關(guān)工作。
2、 包括細胞日常維持,慢病毒包裝、純化、滴度測定,腺病毒包裝、純化、滴度測定;質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、病毒感染穩(wěn)定細胞株篩選。
教育經(jīng)歷
2007/9—2011 /6 哈爾濱師范大學(xué) 生物科學(xué),技術(shù) 本科
證 書
2009/6 大學(xué)英語六級
2008/6 大學(xué)英語四級
【關(guān)鍵詞】數(shù)學(xué);遺傳學(xué);孟德爾;雜交實驗
【中圖分類號】S813.3【文獻標(biāo)識碼】B【文章編號】2095-3089(2017)03-0278-02
早期的遺傳思想可以追溯到什么時候,已經(jīng)是無史可考。但人們在向牲畜和種植過渡時,就已經(jīng)有意或無意地注意到了性狀可以世代相傳的問題。但遺傳變異規(guī)律的揭示,則是經(jīng)歷了漫長的歲月。一代代的科學(xué)家經(jīng)過苦苦的探索,無數(shù)次的失敗,最后才由奧國學(xué)者孟德爾在總結(jié)前人經(jīng)驗教訓(xùn)的基礎(chǔ)上,創(chuàng)造性地把數(shù)學(xué)原理引入遺傳研究,從而揭開了這塊神秘的面紗。在遺傳理論的建立過程中,數(shù)學(xué)起到了關(guān)鍵性的作用,有力地佐證了伽利略“自然之書是用數(shù)學(xué)語言寫成的”著名論斷。
一、試圖揭示遺傳變異規(guī)律的先驅(qū)
在孟德爾以前,科學(xué)界已經(jīng)廣泛開展了植物雜交實驗,積累了豐富的材料。其中,德國植物學(xué)家科爾羅伊德首次創(chuàng)立了科學(xué)的雜交方法。他用相對性狀不同的兩種類型植株(如開紅花和開白花的植株)雜交時,發(fā)現(xiàn)雜種一代只有一種類型(如只出現(xiàn)開紅花的植株),而雜種二代可出現(xiàn)不同類型(紅花和白花都出現(xiàn))。對于這些有價值的結(jié)果,科爾羅伊德茫然不解。
杰出的法國植物學(xué)家諾丹“先后進行了一萬多次試驗,涉及700個種和80余個屬”,同樣得出了科爾羅伊德的實驗結(jié)果,且雜種二代兩種類型的個體數(shù)目之比為3:1。諾丹進一步意識到在雜交后代中,生物相對性狀的出現(xiàn)如此地具有規(guī)律性,完全是由概率原理支配的,但他象其他科學(xué)家一樣,仍然不能揭示出隱藏在這些表面現(xiàn)象背后的實質(zhì),仍然不能揭示出遺傳變異的規(guī)律。[1]
二、數(shù)學(xué)原理的應(yīng)用導(dǎo)致遺傳學(xué)的誕生
諾丹等科學(xué)家在揭示遺傳規(guī)律的征途上做了很多實實在在的工作,幾乎走到了真理的面前,卻當(dāng)面錯過了它。原因是多方面的,就正如胡克、羅伯特一樣,他們早就有了萬有引力的觀念,然而,由于他們?nèi)狈εnD那樣橫絕一世的數(shù)學(xué)才能,雖然走到了萬有引力的跟前,卻無力抓住它。而孟德爾卻不同,他具有生物學(xué)、數(shù)學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)等諸方面的廣博知識,更善于總結(jié)前人的經(jīng)驗教訓(xùn),在很大程度上改變了前人的研究方法,并且第一個把數(shù)學(xué)引入了遺傳學(xué)的研究領(lǐng)域,把實驗結(jié)果建立在可以計量的基礎(chǔ)上,提出自己的假說,并加以反復(fù)驗證。
孟德爾對以下七對相對性狀進行了雜交實驗,并對實驗結(jié)果進行了數(shù)理統(tǒng)計分析:
上圖是孟德爾豌豆雜交子二代的結(jié)果。他發(fā)現(xiàn),具有一對相對性狀(例如紅花與白花)的兩個純種親本雜交產(chǎn)生的子一代(簡稱F1)均表現(xiàn)某一親本的性狀(只出現(xiàn)紅花),讓子一代自花授粉,結(jié)果在雜交子二代(簡稱F2)中,不僅有一個相對性狀,而是出現(xiàn)了各自的祖父祖母的一對相對性狀,即既有紅花,又有白花,紅白之比為3:1。這種雜交后代個體間,一部分表現(xiàn)出一個親本的性狀,其余表現(xiàn)出另一個親本的性狀的現(xiàn)象,叫做分離。同時,雜種一代表現(xiàn)出來的性狀叫顯性性狀,例如紅花,不表現(xiàn)出來的性狀叫隱性性狀,例如白花。[2]
孟德爾又跟蹤觀察了子三代、子四代、子五代和子六代的分離情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)以下事實:
(1)雜種自交子代的分離比為3:1。
(2)在這個分離比中,隱性性狀不會再分離而為純種,另2/3的個體仍為雜種——而其自交子代要重復(fù)3:1的分離,即雜種分離時有:
式中P為某一性狀個體的概率,q為另一性狀個體的概率,n為子代個體數(shù)。
為了解釋上述事實,孟德爾對試驗結(jié)果進行了數(shù)學(xué)抽象和推理,提出如下假說:
(1)性狀是由遺傳因子(現(xiàn)在稱為基因)決定的。
(2)基因在體細胞中成雙存在。
(3)形成配子時,成雙的基因彼此分離,分別進入不同的配子。
(4)雌雄配子隨機結(jié)合成受精卵,體細胞又恢復(fù)到基因成雙狀態(tài)。
(5)成雙基因的兩個成員,會出現(xiàn)一方壓倒一方的現(xiàn)象,即顯性基因壓倒隱性基因,從而使隱性基因所控制的性狀不能表現(xiàn)出來。
例如:紅花受顯性基因C控制,白花受隱性基因c控制,兩者進行雜交,根據(jù)孟德爾假設(shè),有:
F2基因型及其比例:1CC:2Cc:1cc
表現(xiàn)型及其比例:3紅花:1白花
如果用簡捷的數(shù)學(xué)方式推算,則同樣根據(jù)孟德爾假說,由于子一代雌雄配子的隨機結(jié)合,F(xiàn)1自交后代(F2)的分離比,實際上就是(C+c)2,用二項式展開系列表示即為
(C+c)2=CC+2Cc+cc,即1紅、2紅、1白,紅白之比為3:1。由此我們知道了上面所說的“1:2:1”乃是子二代(F2)的基因型之比,亦即是二項分布(p+q)2=1P2+2Pq+1q2的二項式系數(shù)之比。[3]
在一對相對性狀遺傳實驗的基礎(chǔ)上,孟德爾進一步就二對相對性狀進行了交雜實驗。他把圓粒黃色種子的豌豆跟皺粒綠色種子的豌豆雜交,發(fā)現(xiàn)F1結(jié)的都是圓粒黃色種子,說明圓粒對皺粒是顯性,黃色對綠色是顯性。再讓F1植株自交,所結(jié)的F2種子發(fā)生四種類型的性狀分離。除了具有親本性狀的兩種類型即圓粒黃色和皺粒綠色外,還出現(xiàn)了與親本性狀不同的兩種新類型,即皺粒黃色和圓粒綠色兩種新的組合,而且四種類型存在著一定的比例關(guān)系,即:圓粒黃色:皺粒黃色:圓粒綠色:皺粒綠色=9:3:3:1。
如果用A代表圓粒,a代表皺粒,B代表黃色,b代表綠色,則有:
上圖清晰地顯示了F2中有九種基因型:
由于存在著顯隱性關(guān)系,所以外觀(表現(xiàn)型)上就出現(xiàn)了特有的9:3:3:1。
研究了這種基因型比率后,孟德爾寫道:“此式無可辯駁地是一個組合系列,.....把這兩個式子:
結(jié)合起來,就得到系列中所有組的數(shù)目?!?/p>
孟德爾又做了多對相對性狀的雜交實驗,并且看出相對性狀愈多,F(xiàn)2分離出的表現(xiàn)型也就愈多。各種表現(xiàn)型的比率可以統(tǒng)一用(3:1)n來表示。這里n代表相對性狀的對數(shù),例如n=1時,出現(xiàn)(3:1)1,即3:1;n=2時出現(xiàn)(3:1)2,即
9:3:3:1;n=3時出現(xiàn)(3:1)3,即27:9:9:9:3:3:3:1,以此類推。
以上是F1所含雜合基因?qū)?shù)與后代基因型和表現(xiàn)型的關(guān)系表。通過對雜交實驗中子二代的分析,孟德爾提出:“設(shè)以n代表兩個原種的可區(qū)分性狀的數(shù)目,3n就得出組合系列的項數(shù),4n為屬于這個系列的個體數(shù),而2n則為保持穩(wěn)定的組合數(shù)。”[4]
為了檢驗假說的正確性,孟德爾做了自交和測交實驗(實驗過程略),無可辯駁地證實了假說的真理性,從而將假說上升為理論,這就是我們熟知的遺傳學(xué)第一定律和第二定律:“在雜種體內(nèi),成對的基因雖共同存在于一個細胞內(nèi),但彼此互不混合,在配子形成的過程中,彼此分離,各進入一個配子中?!薄霸谶z傳過程中不同對的基因在形成配子時可以自由組合?!?/p>
孟德爾理論的建立,標(biāo)志著近代遺傳學(xué)的誕生。
誠如偉大的科學(xué)家羅蒙諾索夫所說:“數(shù)學(xué)是科學(xué)的眼睛”,遺傳學(xué)的研究只有裝上數(shù)學(xué)這付明亮的“眼睛”,才能透過現(xiàn)象看清其實質(zhì)?!八街梢怨ビ瘛?,可以說,遺傳學(xué)的研究,如果不借助于數(shù)學(xué)原理,則任何雜交實驗都是徒勞的,一切努力都不能使研究者擺脫困境,至今仍有可能還在黑暗中徘徊,更談不上遺傳學(xué)這門科學(xué)的出現(xiàn)。
作者:陳月強
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人教版高中生物(必修2)遺傳與進化第6章第1節(jié)“雜交育種和誘變育種”,主要包括雜交育種的概念、過程、基本原理、應(yīng)用以及優(yōu)缺點和誘變育種的概念、過程、基本原理、應(yīng)用以及優(yōu)缺點等內(nèi)容,其中教學(xué)重點是遺傳和變異規(guī)律在改良農(nóng)作物和培育家畜品種等方面的應(yīng)用;教學(xué)難點是雜交育種和誘變育種的優(yōu)點和局限性。本節(jié)采取以育種技術(shù)的發(fā)展遞進歷程來組織教學(xué)內(nèi)容。教學(xué)過程中始終抓住育種技術(shù)的不斷突破和不斷改進這一主線,重點引導(dǎo)學(xué)生利用遺傳學(xué)原理分析不同育種階段育種技術(shù),發(fā)現(xiàn)其優(yōu)缺點,應(yīng)用所學(xué)的遺傳學(xué)知識,嘗試設(shè)計突破已有育種技術(shù)局限的途徑。充分利用教材所介紹的許多具體生動的育種方法的實例,培養(yǎng)學(xué)生的閱讀理解能力、歸納總結(jié)能力和分析思考解決問題的能力。運用小組合作的方式,收集育種的相關(guān)資料,通過成員匯報,提高小組的凝聚力;再采取各組互評的方式,進一步培養(yǎng)學(xué)生們的合作意識。
二、教學(xué)目標(biāo)
1.知識目標(biāo)
簡述雜交育種的概念;
說明雜交育種的遺傳學(xué)原理;
舉例說出誘變育種的基本原理及其在生產(chǎn)中的應(yīng)用。
2.能力目標(biāo)
嘗試將信息用圖表、遺傳圖解的形式表達出來運用遺傳和變異原理,解決生產(chǎn)和生活實際中的問題。
3.情感態(tài)度和價值觀目標(biāo)
(1)討論從選擇育種到雜交育種,再到誘變育種中,科學(xué)、技術(shù)和社會的相互作用。
(2)通過對雜交育種和誘變育種成果的了解,關(guān)注育種技術(shù)的發(fā)展。
(3)體會科學(xué)技術(shù)在發(fā)展社會生產(chǎn)力、推動社會發(fā)展中的巨大作用。
三、教學(xué)過程
自從孟德爾的遺傳規(guī)律問世之后,人工雜交的方法就被廣泛應(yīng)用到動植物育種。隨著科學(xué)技術(shù)的進步,人工誘變技術(shù)的應(yīng)用進一步推動了育種的步伐,后來基因工程的誕生,使人們能夠定向地改變生物的遺傳特性,創(chuàng)造出新的生物類型。育種在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的地位越來越重要了。請同學(xué)們結(jié)合我們學(xué)過的遺傳和變異的相關(guān)知識以及平時對這方面的認識,說一說選育新品種的方法有哪些?(讓學(xué)生分小組互相討論一段時間后,學(xué)生起來回答。)
(選擇育種、雜交育種、誘變育種、單倍體育種、多倍體育種、基因工程育種)
1.選擇育種
教師在上課之前先收集一些關(guān)于選擇育種和雜交育種的圖片,在上課的時候首先展示這些圖片,讓學(xué)生仔細觀察這些圖片,教師根據(jù)這些圖片設(shè)計問題:
根據(jù)圖片分析古印第安人培育玉米的方法所隱含的遺傳學(xué)原理及其優(yōu)缺點是什么?
看完圖片提出問題后,教師先讓學(xué)生閱讀教材上的基礎(chǔ)內(nèi)容,并組織學(xué)生分組討論,然后讓每一小組選出代表來回答問題。在回答問題過程中若學(xué)生不能很好地回答所提出的問題,教師可以通過對問題的分解來進行引導(dǎo):
教師提示:(1)古印第安人培育玉米的方法稱為什么?(2)這時出現(xiàn)的選擇的具體含義是什么?(3)選擇育種的優(yōu)缺點是什么?
最后再找同學(xué)起來補充回答直到答得全面為止,教師在必要的時候可以給予適當(dāng)?shù)奶崾?,使學(xué)生牢固掌握這部分的內(nèi)容。
2.雜交育種
每種生物都有不少性狀,這些性狀有的是優(yōu)良性狀,有的是不良性狀,而且不同的優(yōu)良性狀存在于不同的品種中。人們一直設(shè)想如果能想辦法去掉不良性狀,讓優(yōu)良性狀集于一身,創(chuàng)造出自然條件下沒有的新性狀組合,突破選擇育種的局限,培育出具有優(yōu)良性狀組合的新品種。會有什么辦法呢?(學(xué)生思考、分組討論之后回答),在此基礎(chǔ)上,教師提出問題:
有兩個小麥品種:一種是高產(chǎn)不抗?。ˋABB),另一種是低產(chǎn)抗?。╝abb),兩對性狀獨立遺傳,你們用什么方法能培育出高產(chǎn)抗病的小麥新品種呢?請將你們的設(shè)想用遺傳圖解表示出來。(課本例子)
學(xué)生思考,分組討論,討論完成后自己畫出,同時找兩位同學(xué)到黑板上來畫,先讓學(xué)生互相批改他們做的結(jié)果,并說明理由,在學(xué)生匯報的時候老師給予適當(dāng)?shù)囊龑?dǎo),讓學(xué)生展示出自己的方案,最后通過生生、師生間的交流研討,總結(jié)出可行性的方案。共同完善寫出課本例子遺傳基因型圖解。
師生共同總結(jié):F2高產(chǎn)抗病植株繼續(xù)自交,淘汰性狀分離的類型,選育純種。但是,在水稻育種過程中,我們直接利用F1代的雜種優(yōu)勢。
通過問題展示和解答,教學(xué)課件輔助,展示學(xué)生所寫的遺傳圖解。最后由學(xué)生歸納雜交育種的概念,所利用的原理及我國在雜交育種方面的成就。
(雜交育種就是將兩個或多個品種的優(yōu)良性狀通過集中在一起,再經(jīng)過選擇和培育,就得到新品種的方法;基因重組,成就略)
學(xué)情預(yù)設(shè):與選擇育種比較,雜交育種有什么優(yōu)點?
學(xué)生思考、分組討論回答:能將兩個不同品種的優(yōu)良性狀集中在一起,產(chǎn)生新的性狀組合的新品種;育種的目的性較強。
思考與討論:綜上所述雜交育種的優(yōu)點是很明顯的,但是在實際操作中,會遇到不少困難。請從雜交后代可能出現(xiàn)的類型,以及育種時間等方面,分析雜交育種方法的不足。有沒有更好的育種方法來彌補這些缺點呢?
學(xué)生思考,分組討論回答:雜交育種只能利用已有基因的重組,按需選擇,并不能創(chuàng)造新的基因。雜交后代會出現(xiàn)性狀分離現(xiàn)象,育種進程緩慢(一般需5至7年),過程繁瑣。這些都是雜交育種方法的不足。
思考與討論:有沒有更好的育種方法來彌補這些缺點呢?
學(xué)生回憶學(xué)過的知識,并交流和討論:
3.誘變育種
教師引導(dǎo)學(xué)生回憶基因突變的內(nèi)容。
利用基因突變的原理應(yīng)用在育種中,就發(fā)展為一種新的方法――誘變育種。
教師引導(dǎo)學(xué)生閱讀教材P100頁,教材列舉了哪些誘變育種的實例?
學(xué)生閱讀教材并回答:如黑農(nóng)五號;衛(wèi)星“87-2”青椒、“航育1號”水稻、“豫麥13號小麥”等;青霉菌高產(chǎn)菌株等。
教師通過大量的圖片資料介紹了誘變育種的實例。
教師總結(jié):誘變育種的概念指什么?
誘變育種就是利用物理因素(如X射線、γ射線、紫外線、激光等)或化學(xué)因素(亞硝酸、硫酸二乙脂等)來處理生物,使生物發(fā)生基因突變。
教師引導(dǎo),組織開展生生、師生的討論:與雜交育種相比,誘變育種有什么優(yōu)點?聯(lián)系基因突變的特點,談?wù)務(wù)T變育種的局限性。要想克服這些局限性,可以采取什么辦法?
誘變育種的優(yōu)點是能夠提高突變率,在較短的時間內(nèi)獲得更多的優(yōu)良變異類型。誘變育種的局限性是誘發(fā)突變的方向難以掌握,突變體難以集中多個理想性狀。要想克服這些局限性,可以擴大誘變后代的群體,增加選擇的機會。
[關(guān)鍵詞]先兆性;偏頭痛;遺傳學(xué);治療
偏頭痛是一種在人群中較為普遍發(fā)生的神經(jīng)性血管疾病,它的特點是患者在病癥發(fā)生時頭疼劇烈且反復(fù)發(fā)作,疼痛的部位多位于大腦的一側(cè),同時還伴隨著惡心嘔吐、對光和聲音過度敏感,其病癥的發(fā)作還會影響到患者的情緒,出現(xiàn)神經(jīng)性紊亂等癥狀。其發(fā)病的持續(xù)時間在4小時以上,甚至可以達到3天之久,嚴重地影響了患者的正常學(xué)習(xí)與工作。偏頭痛的發(fā)病率極高,調(diào)查顯示,在普通人群中,男性的發(fā)病率約為6%,女性的發(fā)病率約為18%。由于偏頭痛發(fā)病時極為痛苦,且發(fā)病率高,又較難治愈,WHO將偏頭痛列為最殘酷的慢性疾病之一。根據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn),可以將偏頭痛分為六種基本類型,先兆性偏頭痛與無先兆性偏頭痛是最為主要的分類。先兆性偏頭痛在發(fā)病之前會出現(xiàn)暫時性的神經(jīng)特征,是偏頭痛發(fā)病的先兆。神經(jīng)特征的最常見的癥狀是視覺閃光黑點,嚴重的還有可能會出現(xiàn)感覺或動作障礙、失語癥等。臨床上判斷先兆性偏頭痛的標(biāo)準(zhǔn)是患者發(fā)病次數(shù)在2次以上,而無先兆性偏頭痛要在5次以上[1]。
對于偏頭痛的致病因素,先前的學(xué)者做了大量的研究,但是還未得出一個明確的發(fā)病機制。偏頭痛的發(fā)病同時受到遺傳和環(huán)境因素的影響,根據(jù)目前的研究,偏頭痛的發(fā)病牽涉到很多的因素,病因較為復(fù)雜,目前發(fā)現(xiàn)的可能致病因素有血管源病變、三叉神經(jīng)血管病變、遺傳基因等。在遺傳方面,偏頭痛表現(xiàn)出了典型的家族遺傳性,很多實驗對偏頭痛的具體致病基因進行了研究,也取得了一定的進展。下面對目前關(guān)于先兆性偏頭痛的遺傳學(xué)研究進展做一個介紹[2]。
一、先兆性偏頭痛遺傳表現(xiàn)模式
很多調(diào)查研究都顯示偏頭痛具有明顯的家族發(fā)病傾向,在偏頭痛的患者中將近有60%的人有家族患病史,且其遺傳致病率在性別方面也存在著差異。有研究以雙生子為對象進行了大量的調(diào)查,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在同卵雙生子中,有先兆形的偏頭痛發(fā)病率為35%;而在異軟雙生子中,該項數(shù)據(jù)為13%,在先兆形偏頭痛發(fā)病率上同卵與異卵雙生子表現(xiàn)出了較為明顯的統(tǒng)計學(xué)顯著,再一次提示了遺傳基因?qū)τ谄^痛的作用。而關(guān)于偏頭痛的遺傳模式,目前存在許多假說,例如有常染色體假說、線粒體遺傳假說、多基因遺傳假說等。但是每一種假說都無法單獨地解釋偏頭痛的致病原理,因此,目前學(xué)術(shù)界一致認為偏頭痛的遺傳模式并不是單一的,可能還存在多樣化的遺傳異質(zhì)性特點。針對男女在偏頭痛的遺傳致病率數(shù)據(jù)上表現(xiàn)出差異這一現(xiàn)象,有人提出了性別性狀遺傳假說,即在男性群體中,偏頭痛呈現(xiàn)出隱形遺傳的特點,而在女性群體中,偏頭痛表現(xiàn)為顯性遺傳。在常染色體上可能存在某種性狀基因,使得偏頭痛的致病因子在不同的性別當(dāng)中有著不同的表現(xiàn)。該理論還未得到實證的驗證,有待進一步的考察。
在偏頭痛的遺傳學(xué)臨床研究中,家族型偏癱性偏頭痛(familial hemiplegic migraine. FHM)是研究得較多的一種偏頭痛,它是一種先兆性偏頭痛,它的特點是在偏頭痛發(fā)病的之前會出現(xiàn)較為嚴重而持久的偏癱。其診斷標(biāo)準(zhǔn)是偏頭痛發(fā)病前期出現(xiàn)四肢無力;出現(xiàn)感覺、視覺、語言障礙的其中一種,并且這些癥狀是可逆的;有四例即以上的直系或旁系親屬患有此病癥。FHM是一種非常罕見的常染色體遺傳的先兆性偏頭痛,并且還是顯性遺傳,其遺傳模式遵循孟德爾遺傳定律[3]。而且還是目前唯一一個具有確定單基因遺傳的先兆性偏頭痛,為偏頭痛的遺傳學(xué)研究提供了一個得天獨厚的材料。下面對遺傳學(xué)的遺傳基礎(chǔ)研究進行一個簡單的介紹。
二、先兆性偏頭痛遺傳學(xué)基礎(chǔ)
1.基于線粒體的基因突變
在線粒體基因病變與偏頭痛關(guān)系的研究上,很多研究得出了相互矛盾的結(jié)果,至今還未得到確鑿的證據(jù)證實偏頭痛是由線粒體上的基因突變引起的。Ojaimi等人對35歲以下的偏頭痛患者進行研究,發(fā)現(xiàn)在線粒體上第4216與13708位核苷酸發(fā)生了突變,提示了少數(shù)的線粒體基因病變累計而成的效應(yīng)很有可能會引發(fā)偏頭痛。但是Shimomoura等人的研究否定了這個觀點,研究在53例日本偏頭痛患者中發(fā)現(xiàn)了有25%的人的線粒體在第11084位核苷酸上存在病變。Russell認為這種病變主要是出現(xiàn)在日本人群體中,而在丹麥偏頭痛患者中較為少見。Majamaa等人的研究結(jié)果與Buzzi等人的研究結(jié)果也出現(xiàn)了差異,前者在38位患者中發(fā)現(xiàn)6%的偏頭痛患者身上出現(xiàn)了線粒體A12308G病變,而后者在相同的研究中并沒有發(fā)現(xiàn)此種病變[4]。雖然目前還無法證明線粒體上的某種基因與偏頭痛有既定的關(guān)系,但是大多學(xué)者還是傾向于相信線粒體上某種未知基因突變可能與偏頭痛有關(guān)系。
2.基于染色體的基因突變
在染色體的基因突變研究中,F(xiàn)HM一直是研究的熱點,因為FHM是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一個具有確定單基因遺傳的先兆性偏頭痛,且遵循孟德爾遺傳定律。Ophoff等人發(fā)現(xiàn)在第19號染色體上的CACNAIA基因突變很有可能會導(dǎo)致FHM的發(fā)病。該基因所編碼的蛋白質(zhì)是鈣通道的主要成分,其病變會引起鈣通道的變異,影響神經(jīng)突觸間的離子傳遞。DeFusco等人認為19號染色體23區(qū)域基因的病變也和FHM有關(guān),該基因編碼與K離子泵有著密切的關(guān)系,其病變會引起細胞外k 離子的增多,一些Ca離子進入細胞內(nèi),在兩個因素的同時作用下,導(dǎo)致FHM的產(chǎn)生[4]。對染色體基因突變與偏頭痛關(guān)系的研究一直在進行著,近期又不斷的有研究發(fā)現(xiàn)和偏頭痛相關(guān)的新的定位點或新的作用機制。
3.基因多態(tài)突變
一些研究還發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)的突變也可能會引發(fā)偏頭痛,但是其作用模式還處于未知狀態(tài),現(xiàn)有研究表明很多基因多態(tài)的突變和偏頭痛之間并不是一種直接的關(guān)系,即基因多態(tài)并不是直接引起偏頭痛,而是增加了偏頭痛病發(fā)的幾率。與正常人群相比,偏頭痛患者的基因多態(tài)的分布普遍較高。在很多研究中都發(fā)現(xiàn)了多巴胺β水解酶、胰島素受體、5-經(jīng)色胺等基因多態(tài)病變與偏頭痛的發(fā)病存在著密切的關(guān)系[4]。關(guān)于這些基因多態(tài)的實際作用還需要做進一步的研究來確定其作用模式。
三、先兆性偏頭痛的治療
偏頭痛是現(xiàn)代人最為常見的慢性疾病之一,其發(fā)病時劇烈的頭疼,以及反復(fù)長時間發(fā)作的特點都嚴重影響了患者的身心健康與生活動作質(zhì)量,因此對于偏頭痛的有效治療措施極為重要。對于偏頭痛的治療包括急性發(fā)作期的治療與預(yù)防性治療。
1.預(yù)防性治療
預(yù)防性治療用于偏頭痛發(fā)病的之前,它的作用是減少偏頭痛的發(fā)病概率,降低發(fā)病時的疼痛程度,以及提高發(fā)病期間使用藥物的功效。它作為偏頭痛的一種輔助治療方式,在偏頭痛的治療過程中發(fā)揮著重要的作用。預(yù)防性治療的實施有幾個原則性的點需要注意的:①不提倡使用止痛型藥物;②使用藥物時,計量從小到大慢慢增加;③預(yù)防性治療需要保證一定的療程時間,一般在三個月到六個月之間;④選擇的藥物要有明確的療效且沒有副作用;⑤樹立患者對預(yù)防性治療的正確價值觀,讓患者認識到預(yù)防性治療在偏頭痛治療中的重要性,提高期望值,有利于藥效的發(fā)揮。
1.1預(yù)防性治療適用條件
預(yù)防性治療適合在以下情況下使用:月經(jīng)型偏頭痛;其他特殊類型的偏頭痛;當(dāng)患者在最近的三個月內(nèi)平均每個月發(fā)病次數(shù)在2次以上或者發(fā)病時間持續(xù)在4天以上的;當(dāng)由于各種因素?zé)o法對患者進行急性治療,或者急性治療的藥物對患者沒有效果[5]。
1.2預(yù)防性治療常用藥物
普蔡洛爾,目前研究對于普蔡洛爾的偏頭痛預(yù)防效果還未得出一致的結(jié)果,在一項兒童患者的實驗中,有81%的兒童在服用該藥物后頭痛的癥狀再也沒有出現(xiàn),或者其程度得到了減輕。證實了普蔡洛爾對于偏頭痛的治療確實是有效的。而在另外一項研究中,并沒有發(fā)現(xiàn)普蔡洛爾對偏頭痛的治療效果。
氟桂利嗦循,在許多研究中它對于偏頭痛的預(yù)防效果都得到了驗證。在一項對照實驗中使用了氟桂利嗦循的偏頭痛患者比未使用該藥物的對照組患者其發(fā)病的概率出現(xiàn)了顯著的降低,發(fā)病時的持續(xù)時間也出現(xiàn)了減短。但是這種藥物也有一定的副作用,使用了該藥物的患者經(jīng)常出現(xiàn)犯困、體重升高的癥狀;
丙戊酸,在一項兒童患者臨床實驗中發(fā)現(xiàn),讓患者停止使用偏頭痛發(fā)作期治療藥物,改服丙戊酸,也可使大部分的偏頭痛患者的癥狀得到減輕甚至完全消失。證實了丙戊酸對于偏頭痛的治療效果。但是該藥物也會出現(xiàn)一些副作用,即出現(xiàn)眩暈、嗜睡、腸胃不適等不良反應(yīng)。
阿米替林,在對青年患者的一次回訪研究中,發(fā)現(xiàn)使用阿米替林的患者發(fā)病的次數(shù)從一個月10次以上降低為了一個月4次。阿米替林的主要副作用是有輕微的鎮(zhèn)定作用。
2.發(fā)作期治療
發(fā)作期治療是指偏頭痛在發(fā)病期內(nèi)采用藥物對病情進行干預(yù)。其主要目的是緩解病情,防止其進一步惡化,減少患者的痛苦,使患者更快地得到恢復(fù),并減少之后的發(fā)病頻率。偏頭痛發(fā)作期的治療是偏頭痛的治療的主要環(huán)節(jié),其療效對于偏頭痛急性發(fā)作的患者極為重要。治療偏頭痛急性發(fā)作的藥物包括特異性藥物與非特異性藥物。
2.1特異性藥物
曲坦類藥物,它是偏頭痛急性發(fā)作的特異性藥物。它的作用原理是通過使血管發(fā)生收縮,從而減少神經(jīng)元釋放神經(jīng)遞質(zhì)從而減少患者的疼痛感。最近一些新研發(fā)的曲坦類藥物具有較長的效用時間與較好的藥效,能有效地減輕患者的頭痛感,減少發(fā)病的時間。相對于其他偏頭痛治療藥物,曲坦藥物更為有效及安全。但是曲坦類藥物也不是對所有的患者都能發(fā)揮作用,而由于曲坦類藥物能收縮血管,因此患有冠狀動脈等血管類疾病的患者不能使用該藥物。
麥角制劑,它被廣泛地用于偏頭痛的治療。麥角制劑能作用于腎上腺與5HT受體,抑制三叉神經(jīng),從而發(fā)揮治療效果。臨床上使用得較多的麥角制劑有麥角胺與DHE,一般適用于在發(fā)病前期未出現(xiàn)嘔吐的患者。麥角胺的用方法有口服與栓劑,其副作用表現(xiàn)主要是容易發(fā)生嘔吐,同樣也不能給患有心血管疾病的患者使用;DHE的使用方法有筋脈注射與肌肉注射,它的副作用較少,但是不能用于孕婦,或心血管類疾病的患者。
2.2非特異性藥物
NSAID,它適用于一些患有中等強度的偏頭痛患者。NSAID相對來說較為安全,且可以和其他偏頭痛藥物一同使用獲得更好地療效。NSAID的使用方法有口服與注射,當(dāng)患者在就醫(yī)之前已口服過該藥物,醫(yī)師可采用注射的方式來給藥。NSAID對腸胃消化功能不好或是腎功能較弱的患者有較強的傷害性,因此,不能給這類患者用此藥。
多巴胺超敏,它的作用原理是通過阻礙受體的運作來達到限制三叉神經(jīng)元向大腦傳遞神經(jīng)沖動,防止丘腦形成疼痛感的目的,從而能在很大程度上降低患者在偏頭痛發(fā)病時的疼痛感。多巴胺超敏在使用過程中不會產(chǎn)生嘔吐副作用,因此適應(yīng)于伴有嘔吐的偏頭痛患者。它的副作用主要是嗜睡。
巴比妥酸鹽,它的作用效果是通過降低中樞神經(jīng)敏感度來達到止痛的效果。但是它一般只作為鎮(zhèn)痛藥來服用,對偏頭痛不具有治療的效果。由于巴比妥酸鹽具有較為有效的止痛效果,很多患者會私自用藥,導(dǎo)致藥物的濫用。
抗組胺藥,主要用于患有中度以及重度的偏頭痛的患者,在曲坦類藥物不能發(fā)揮效用或是患者不能使用曲坦類藥物時,抗組胺藥能作為替代藥物。
另外,非特異性偏頭痛治療藥物還包括糖皮質(zhì)激素、阿司匹林、阿片類藥物、丙戊酸鈉等,這些藥物也會用于偏頭痛的治療的是療效不如前面的一些藥物,而且它們還存在著較多的不良反應(yīng),因此一般不會用在片頭痛的臨床治療中[6]。
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[關(guān)鍵詞]微衛(wèi)星;群體遺傳學(xué);道地藥材;遺傳成因;栽培起源;產(chǎn)地鑒別
[收稿日期]2013-07-01
[基金項目]國家自然科學(xué)基金面上項目(81274027);國家自然科學(xué)基金重點項目(81130070);中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所基本科研業(yè)務(wù)費自主選題項目(2011ZDXK-01);北京市共建項目專項
[通信作者]袁慶軍,Tel:(010)64014411-2956,E-mail: 中藥的道地性是自古延用至今評價中藥材質(zhì)量的一項獨特標(biāo)準(zhǔn),道地藥材就是指在特定自然條件、生態(tài)環(huán)境的地域內(nèi)所產(chǎn)的藥材,且生產(chǎn)較為集中,栽培技術(shù)、采收加工也都有一定的講究,以致較同種藥材在其他地區(qū)所產(chǎn)者品質(zhì)佳、療效好、為世所公認而久負盛名者稱之[1]。黃璐琦等指出道地藥材的生物學(xué)本質(zhì)是同種異地,即同一物種因其具有一定的空間結(jié)構(gòu),能在不同的地點上形成大大小小的群體單元,如果其中某一群體單元產(chǎn)生質(zhì)優(yōu)效佳的藥材,即為道地藥材[2]。這個同一物種在不同地點上形成的群體單元,在生物學(xué)上稱為居群。因此,道地藥材在生物學(xué)上就是指某一物種的特定居群,是在特定時間和空間里生長的自然或人為的同種個體群,居群水平的遺傳分化是道地藥材形成的遺傳基礎(chǔ),遺傳分化越明顯,道地藥材與同種其他居群藥材的差異越明顯[3],由此他對道地藥材的形成機制提出了“道地性越明顯,其基因特化越明顯”的模式假說[4]。
目前關(guān)于道地藥材遺傳基礎(chǔ)的研究多停留在遺傳多樣性的基本分析和描述,難以揭示道地藥材遺傳分化和遺傳成因的深層次問題,如①道地藥材居群是如何進化形成的,與非道地藥材居群的遺傳分化程度有多大?這種遺傳分化與道地性的形成是否相關(guān)?②道地栽培居群是否起源于道地野生居群,它們的種質(zhì)是否存在差異?這種差異是否產(chǎn)生種質(zhì)混雜而引起遠交衰退最終影響藥材的道地性?③道地藥材是否可能實現(xiàn)產(chǎn)地的分子鑒別(種內(nèi)鑒別)?如何篩選道地藥材的分子地理標(biāo)識?這些問題的解決必須深入了解道地居群形成的進化歷史,掌握影響道地居群遺傳分化的現(xiàn)代因素(如基因流、自然選擇或人工選擇等)和歷史性事件(如片斷化、快速擴展和拓殖現(xiàn)象等),這些屬于群體遺傳學(xué)范疇,需要將群體遺傳學(xué)的理論和方法引入道地藥材的研究。
群體遺傳學(xué)(population genetics)又稱種群遺傳學(xué),是根據(jù)遺傳學(xué)原理,采用數(shù)學(xué)、統(tǒng)計或其他方法研究生物居群的遺傳結(jié)構(gòu)及其演化規(guī)律的一門學(xué)科,即研究種內(nèi)進化(微進化microevolution)的科學(xué)。種內(nèi)進化促成了等位基因在居群水平的空間分布和不斷改變,從而引起居群間的遺傳分化。20世紀90年代以來,隨著PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用,RAPD,RFLP,AFLP等指紋技術(shù)[5]為群體遺傳學(xué)的研究提供了有效手段,而微衛(wèi)星與這些指紋技術(shù)相比又具有突出的優(yōu)勢。由于微衛(wèi)星具有高度多態(tài)性、在基因組中含量豐富且分布均勻等優(yōu)點,這一技術(shù)很快便發(fā)展為一種分子標(biāo)記,成為群體遺傳學(xué)研究的有力工具,本文旨在介紹微衛(wèi)星群體遺傳學(xué)基本理論和研究方法的基礎(chǔ)上,將其引入道地藥材的研究,為賦予道地藥材現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵提供新的研究手段。
1微衛(wèi)星的概念、分布及優(yōu)點
1.1微衛(wèi)星的概念及在真核生物基因組中的分布
微衛(wèi)星(microsatellites),又稱簡單序列重復(fù)(simple sequence repeats,SSR),是指以少數(shù)幾個核苷酸(一般為1~6個)為重復(fù)單位組成的簡單的串聯(lián)重復(fù)序列,由于重復(fù)的次數(shù)不同以及重復(fù)的程度不一致而造成這些序列的多態(tài)性[6]。微衛(wèi)星上不同長度的等位基因按簡單的孟德爾方式遺傳。
微衛(wèi)星序列普遍存在于大多數(shù)真核生物的核基因組中。據(jù)估計,人類基因組中每6 kb就存在一個微衛(wèi)星位點[7]。在不同分類群的物種之間以及同一分類群的不同物種之間微衛(wèi)星的平均密度差異很大,例如,植物基因組中的微衛(wèi)星約比動物基因組中的少5倍[8],而鳥類約比人類少6~7倍[9],目前尚無法解釋這種現(xiàn)象[10]。微衛(wèi)星的重復(fù)單位以1~2個核苷酸為主,也有一些微衛(wèi)星的重復(fù)單位為3個核苷酸,極少數(shù)為4個或4個以上核苷酸[8]。在以雙核苷酸為重復(fù)單位的微衛(wèi)星中,人和動物 (CA)n含量最高[7],植物中(尤其是作物中)以 (GA)n和 (AC)n為主[11]。
1.2微衛(wèi)星作為遺傳標(biāo)記的優(yōu)點
用微衛(wèi)星作為遺傳標(biāo)記與其他DNA分子標(biāo)記(如RAPD,RFLP,AFLP,小衛(wèi)星DNA等)相比具有以下優(yōu)點:①作為一種高度多態(tài)性的分子標(biāo)記,微衛(wèi)星DNA具有豐度高、共顯性標(biāo)記、選擇中性的特點;②微衛(wèi)星采用單位點DNA指紋技術(shù),檢測容易,重復(fù)性較好;③微衛(wèi)星DNA擴大了取樣范圍,減輕了取樣工作的困難和對研究對象的影響;④微衛(wèi)星DNA的出現(xiàn)為群體遺傳學(xué)家提供了空前豐富的遺傳信息資料,同時也促進了相應(yīng)的統(tǒng)計分析方法的發(fā)展[12],包括最大似然性法(maximum likelihood)、凝聚法(coalescent methods)和bayesian法(bayesian methods)。
2微衛(wèi)星在群體遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用
2.1居群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析
居群的遺傳多樣性是長期進化的產(chǎn)物,也是種質(zhì)資源創(chuàng)新和品種改良的物質(zhì)基礎(chǔ)。一個居群遺傳多樣性越高或遺傳變異越豐富, 對環(huán)境變化的適應(yīng)能力就越強, 越容易擴展其分布范圍和開拓新的環(huán)境。物種的遺傳多樣性往往與物種本身的特性相關(guān),如生活史的長短、系統(tǒng)和繁殖方式、地理分布及遺傳變異水平高低等[13-15]。遺傳結(jié)構(gòu)是指基因或基因型在空間和時間上的非隨機分布,居群的遺傳結(jié)構(gòu)包括居群內(nèi)的遺傳變異和居群間的遺傳分化。對遺傳結(jié)構(gòu)及其影響因子的研究是探討生物適應(yīng)意義、物種形成過程及其進化機制的基礎(chǔ),也是保護生物學(xué)的核心之一。一個物種的遺傳結(jié)構(gòu)是長期進化的產(chǎn)物,許多物種獨特的遺傳結(jié)構(gòu)反映了進化歷史上的一些特殊事件[16-17]。生物多樣性保護的關(guān)鍵之一是保護物種,更具體地說就是保護物種的遺傳多樣性或進化潛力,制定有效的保護策略和措施必須建立在對遺傳結(jié)構(gòu)充分了解的基礎(chǔ)上。微衛(wèi)星是進行居群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)研究的有效分子標(biāo)記,目前已對草本植物[18-19]、花卉[20]、樹木[21-24]等進行了研究,而對藥用植物,特別是道地藥材遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的深入研究還很缺乏。
2.2基因流分析
基因流是指生物個體從其發(fā)生地分散出去而導(dǎo)致不同居群之間基因交流的過程。植物的基因流主要靠花粉和種子的傳播來完成[25-29],基因流的大小直接影響著居群間遺傳物質(zhì)是否均質(zhì)化以及遺傳分化的程度,因此基因流是決定居群遺傳結(jié)構(gòu)的重要因素[30],通過基因流可以了解居群過去的進化歷史、掌握居群現(xiàn)在的遺傳結(jié)構(gòu)并預(yù)測居群將來的演化趨勢,由此作出保護和可持續(xù)利用的有效策略?;蛄鞯膫鹘y(tǒng)測定方法是通過收集器或染色跟蹤花粉和種子的運動,但這些方法常常低估居群的基因流,而且也無法計算有效基因流的大小[31]?;蛄骺梢酝ㄟ^親本分析來測定[32],采用親本分析方法確定種子或幼苗的雙親之后,可以根據(jù)雙親之間的距離精確地測定花粉的傳播距離,幼苗與母本間的距離(雌雄異株)或種子與雙親之間的平均距離(雌雄同株)即為種子散布距離。當(dāng)花粉或種子從一個居群擴散到另一個居群,就形成居群間基因流,這種基因流是阻止居群遺傳分化的重要進化因子。在后代的親本分析中,有些后代的親本不能由居群內(nèi)的個體形成,根據(jù)這些后代的比率可以估算出居群間基因流與居群內(nèi)基因流的相對強度。微衛(wèi)星高度的多態(tài)性、共顯性等特點,在親本分析中具有突出的優(yōu)勢,目前利用微衛(wèi)星對基因流進行的研究有很多[33-34],但對藥用植物基因流的研究基本沒有,特別是藥用植物在栽培過程中人為引起基因流改變而影響其進化潛能的研究還屬空白,這直接關(guān)系到中藥資源是否能可持續(xù)利用。
2.3進化顯著單元ESU的劃分
進化顯著單元(evolutionarily significant unit,簡稱ESU)是地理上離散的、歷史上被隔離的居群組,因而具有獨特的進化潛力。定義ESU的遺傳標(biāo)準(zhǔn)包括由遺傳距離反映的等位基因頻率的顯著分化和基于某些基因的系統(tǒng)分化程度。定義ESU的主要目的是要確保進化的產(chǎn)物被認識并受到保護和有效利用,使不同ESU固有的進化潛能得以保持[35],最終真正達到保護物種和可持續(xù)利用的目的。1986年,Ryder首次提出了進化顯著單元的概念,用作保持生物遺傳完整性和進化潛能的一種可操作方法,對地理上有顯著變異的居群組進行分別管理[36]。然而,正如物種的概念一樣,ESU在定義它的組成和界定它所要求的變異類型也還存在爭議[35]。Moritz(1994)定義ESU為歷史上被隔離的且獨立進化的居群組[35],這些居群組在動物中線粒體DNA(mtDNA)或植物葉綠體DNA(cpDNA)等位基因表現(xiàn)為交互單系,并在核等位基因上有顯著分化。根據(jù)這一定義,在獲取具有正確拓樸結(jié)構(gòu)系統(tǒng)樹的基礎(chǔ)上可確定ESU。對于有顯著遺傳分化、同時在線粒體或葉綠體基因組和核基因組上都是單系的居群,應(yīng)屬獨立的ESU。而對于與其他居群遺傳分歧度并非很高、在線粒體或葉綠體基因組上又是單系的居群,如果其核等位基因的頻率與其他居群有顯著的差異,也應(yīng)視為一個ESU;相反,如果其核等位基因的頻率與其他居群沒有顯著的差異,則不能視為一個獨立的ESU[37]。微衛(wèi)星作為一種多態(tài)性很高的核基因分子標(biāo)記,在界定顯著遺傳結(jié)構(gòu)和定義進化顯著單元具有其他分子標(biāo)記不可替代的優(yōu)勢。進化顯著單元ESU的研究目前主要集中在動物的保護遺傳學(xué)研究[38],在植物中也開始借鑒動物的研究方法進行一些進化顯著單元的劃分[39],而在道地藥材的保護、分子鑒定和可持續(xù)利用的研究中尚未深入到進化顯著單元的劃分。
3微衛(wèi)星在道地藥材群體遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用展望
3.1微衛(wèi)星在道地藥材群體遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用
近年來微衛(wèi)星群體遺傳學(xué)被生物科學(xué)界所重視,對于道地藥材的研究主要集中在遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性方面。如Chen等利用微衛(wèi)星群體遺傳學(xué)對唐古特大黃進行了遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析,闡明了其瀕危機制[40];肖冬長等利用研究了鐵皮石的遺傳結(jié)構(gòu),揭示了品種間的親緣關(guān)系[41];郭銀萍等研究了22份薏苡種質(zhì)的遺傳多樣性,反映了供試材料的親緣關(guān)系,從而為薏苡種質(zhì)改良提供理論依據(jù)[42];閆伯前等研究發(fā)現(xiàn)華中五味子具有較高的遺傳多樣性水平和較豐富的等位基因,可作為人工種植時優(yōu)先選用的種質(zhì)資源[43]。陳子易等應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記實現(xiàn)了人參與西洋參的種間鑒別[44]。這些研究初步揭示了微衛(wèi)星群體遺傳學(xué)在道地藥材研究中的優(yōu)勢,但前人的研究僅僅停留在遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)方面,未能從根本解釋道地藥材的遺傳變異和形成機制等問題,亟待在理論和方法上有所突破。
3.2微衛(wèi)星在道地藥材群體遺傳學(xué)研究中的展望
3.2.1道地藥材的遺傳成因研究生物的表型是由遺傳因素和環(huán)境因共同決定的,然而對于同一性狀中的控制可能只是其中某一因素占主導(dǎo)作用引起的,比如歐洲人的平均身高要高于亞洲人是由遺傳決定的,而中國北方人高于南方人的平均身高是由環(huán)境引起的。那么,道地藥材的優(yōu)質(zhì)性究竟是由遺傳因素還是環(huán)境因素所決定呢?這一直是道地藥材研究爭論的焦點。黃璐琦等提出了道地性形成的“邊緣效應(yīng)” [4],他認為物種分布區(qū)邊緣的極端環(huán)境有利于次生代謝產(chǎn)物的積累,因而物種分布區(qū)的邊緣往往成為道地產(chǎn)區(qū)。其他的一些研究也表明次生代謝產(chǎn)物(如黃酮)含量的差異取決于藥材的地理來源[45]。同時黃璐琦等又提出了“道地性越明顯,其遺傳分化越明顯”的模式假說[4],認為道地藥材的生物學(xué)本質(zhì)是同一物種特定居群與其他居群由于地理上的隔離而發(fā)生遺傳分化的結(jié)果。這些爭論一直沒有直接的科學(xué)證據(jù),使道地藥材的生產(chǎn)和質(zhì)量控制缺乏明確的標(biāo)準(zhǔn)。
在植物居群中,影響居群遺傳變異地理分布的重要因素是基因流或溯祖關(guān)系[46]。植物的基因流是靠種子和花粉的傳播來完成的,不同植物由于種子和花粉傳播方式不同而各自具有獨特的基因流模式,其順暢與否,直接影響居群間的分化程度及遺傳物質(zhì)是否均質(zhì)化[47-49]。溯祖關(guān)系是建立譜系分選(lineage sorting)現(xiàn)象的學(xué)說[50],即祖先居群原始的基因型多態(tài)性由于遺傳漂變逐漸消失,最終居群內(nèi)僅存單一基因型而形成單系群,不同的單系群在相互隔離的情況下基因會因突變的積累而逐漸發(fā)生遺傳分化。因此,現(xiàn)代基因流和譜系分選歷史決定了一個物種居群的遺傳結(jié)構(gòu),不同的遺傳結(jié)構(gòu)決定了居群表型(包括化學(xué)表型)的地理變異程度,從而在藥材上反映出道地性的明顯程度。因此,應(yīng)用微衛(wèi)星群體遺傳學(xué)對居群遺傳結(jié)構(gòu)的研究,對道地居群與非道地居群間的遺傳分化程度能夠作出定量判斷,結(jié)合化學(xué)表型地理變異進行相關(guān)性分析,能有效揭示遺傳因素對道地性的影響程度,如果道地居群與非道地居群存在顯著的隔離分化,那么道地性很可能是由遺傳的因素所引起;反之則可能是由環(huán)境的因素所決定。
3.2.2道地藥材的栽培起源研究藥用植物的栽培是滿足人們目前和將來對藥用植物需求、緩解野生藥用植物資源壓力的有效途徑,同時某些栽培方式,如傳統(tǒng)小規(guī)模的就地引種,能夠很好地保存植物的遺傳多樣性[51-52]。然而,栽培對藥用植物資源的保護作用要從多方面來理解[53],通過栽培而進行大規(guī)模的藥用植物生產(chǎn),對藥用植物資源的保護也可能帶來負面影響[54],例如,奠基者效應(yīng)和為了高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)而進行的人工選擇可能導(dǎo)致栽培藥用植物狹窄的遺傳背景,出現(xiàn)類似農(nóng)作物馴化過程中出現(xiàn)的遺傳瓶頸現(xiàn)象[55]。同時,在現(xiàn)代條件下的藥用植物栽培,由于高度發(fā)達的交通和藥材貿(mào)易市場,使得不同產(chǎn)地之間藥用植物種子的交流變得更加容易,種子從原產(chǎn)地流入其他環(huán)境可能導(dǎo)致栽培藥用植物遠交衰退[56],衰退的基因流可能從栽培居群流入附近的野生居群,從而引起野生居群對本地環(huán)境適應(yīng)性的下降[57]。
栽培起源研究能夠有效揭示栽培馴化過程中居群動態(tài)和遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的過程,是當(dāng)今國際上群體遺傳學(xué)研究的熱點之一。栽培植物和它們的野生祖先常常形成野生-栽培復(fù)合體并構(gòu)成植物繁演的重要遺傳資源[58-62]。伴隨著農(nóng)業(yè)上將植物從野生變?yōu)檫m合栽培和人類利用的引種馴化過程的開始,圍繞著野生-栽培復(fù)合體的基礎(chǔ)理論研究[60](作為一種植物進化的模式)和應(yīng)用研究也開始興起,例如,確定馴化植物的地理起源或評價作物進化的居群動態(tài)可以為合理利用和管理遺傳資源提供科學(xué)指導(dǎo)[61]。其中對野生和馴化兩種形式下表型分化的遺傳潛力研究尤為受到關(guān)注[62],近來開始探測栽培的野生植物對附近自然居群的基因流[63]。所有這些研究是彼此相關(guān)的,例如,對居群進化歷史的研究是分析人工選擇作用[64]或基因流模式的前提[65]。目前栽培起源的研究多集中在對主要農(nóng)作物的研究,如水稻、玉米、大豆等[66-68],而藥用植物的栽培起源研究基本上沒有涉及,將微衛(wèi)星群體遺傳學(xué)引入道地藥材的栽培起源研究,能有效揭示道地栽培居群是否起源于道地野生居群,并進一步比較它們的品質(zhì)差異,最終闡明道地藥材的栽培是否只有道地野生居群就地引種才能保持道地性、道地野生居群在非道地產(chǎn)區(qū)或非道地野生居群在道地產(chǎn)區(qū)異地引種對道地性的影響程度有多大、異地引種栽培居群的基因流對本地原生野生居群的種質(zhì)可能產(chǎn)生的影響等科學(xué)問題,這些問題的解決必將把道地藥材的栽培起源研究引向深入,充分掌握處于引種馴化初期的道地藥材在人類干預(yù)下遺傳演變的規(guī)律,為道地藥材遺傳資源的管理和合理利用及品種選育提供科學(xué)指導(dǎo),避免在作物馴化過程中已經(jīng)發(fā)生的不利于人類利用和植物進化的過程重演,有效地進行科學(xué)引種。
3.2.3道地藥材的產(chǎn)地鑒別產(chǎn)地鑒別是指對不同產(chǎn)地的同一藥材進行鑒別,道地藥材具有特定的地域,尋找反映道地藥材地域特征的鑒定評價標(biāo)準(zhǔn)一直是道地藥材研究的關(guān)注點,然而道地藥材的產(chǎn)地鑒別一直是藥材鑒別的一大難題:一方面不同產(chǎn)地藥材形態(tài)和組織差異很小,傳統(tǒng)的經(jīng)驗鑒別和顯微鑒別無能為力;另一方面不同產(chǎn)地藥材的有效成分差異難以達到質(zhì)的差別,同時受生長年限和取樣時間等的影響,也很難勾畫出同種藥材不同產(chǎn)地的化學(xué)特征。那么,DNA分子鑒別能否解決這一難題呢?關(guān)于道地藥材的DNA分子鑒定,肖小河等指出“目前DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)在道地藥材鑒定中受到2個方面的局限:一是來自技術(shù)本身的,如目標(biāo)基因的真實性與DNA同源性,DNA分子標(biāo)記結(jié)果的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性;二是來自研究對象的,不是所有的道地藥材形成都會留下DNA差異‘烙印’,同時這種DNA差異也不見得與道地性的形成有直接或內(nèi)在的相關(guān)”[69]。近來迅速發(fā)展的DNA條形碼技術(shù)很好地解決了第一方面的局限,而無法解決第二方面的局限,其主要集中在物種水平的分類和鑒定,在藥材鑒定方面的應(yīng)用只能作真?zhèn)纹返蔫b別,其所依據(jù)的理論是分子系統(tǒng)學(xué)(phylogeny),所選用的DN段相對保守,實驗也證明DNA條形碼對當(dāng)歸這類藥材的產(chǎn)地鑒別是無效的[70]。
道地藥材的產(chǎn)地鑒別實質(zhì)上是生物種下居群水平的遺傳分化問題,所依據(jù)的理論是分子譜系地理學(xué)(phylogeography)和群體遺傳學(xué),所選用的DN段相對于用于物種水平鑒別的DNA條形碼具有更快的進化速率。目前很多研究表明,葉綠體基因間序列在許多植物類群中已經(jīng)顯示了充分的變異,可用于植物分子譜系地理分析和進化顯著單元的確定[71-72],在藥用植物的道地居群和非道地居群間也存在顯著分化,具有道地居群特有的單倍型可用于產(chǎn)地鑒別[70, 73]。葉綠體分子譜系地理分析反映了居群間種子流的大小和母系遺傳DNA的分化程度,而控制化學(xué)表型的功能基因存在于核基因中,其分化程度與道地性的相關(guān)性更大。核基因在居群間通過花粉流傳遞,為雙親遺傳。然而由于功能基因多存在高度保守、多拷貝、雜合等特點,直接利用功能基因進行群體遺傳學(xué)分析難度較大,沒有可操作性。微衛(wèi)星特有的優(yōu)勢全面反映了核基因組的遺傳信息,用于群體遺傳學(xué)分析能有效闡明居群間花粉流的大小、核基因的分化程度、基因型純合或雜合程度等,從而揭示核基因的居群遺傳結(jié)構(gòu)。只有同時考慮葉綠體DNA和核基因的居群遺傳結(jié)構(gòu),才能正確劃分進化顯著單元,由此判斷道地居群和非道地居群是否存在隔離分化或基因流,也即道地藥材的形成是否留下了DNA差異的‘烙印’,最終闡明道地藥材能否實現(xiàn)產(chǎn)地鑒別。對于沒有DNA差異‘烙印’的道地藥材不能實現(xiàn)產(chǎn)地鑒別;對于存在DNA差異‘烙印’的道地藥材,根據(jù)分子譜系地理學(xué)和微衛(wèi)星群體遺傳學(xué)分析的結(jié)果建立道地藥材的分子地理標(biāo)識,從而實現(xiàn)道地藥材的產(chǎn)地鑒別。
4結(jié)語
目前道地藥材形成規(guī)律的研究已取得階段性成果,但在道地藥材形成的演化規(guī)律以及人工馴化過程人為影響道地藥材進化潛能等方面的研究需要進行種內(nèi)進化(微進化)的深入研究,將微衛(wèi)星群體遺傳學(xué)引入道地藥材研究,突破了道地藥材遺傳成因研究長期在理論和方法上的局限以及藥材分子鑒別停留在真?zhèn)舞b別(種間鑒別)的瓶頸,有效填補道地藥材栽培起源研究的空白,為揭示道地藥材的遺傳成因、實現(xiàn)道地藥材栽培科學(xué)的引種和產(chǎn)地鑒別(種內(nèi)鑒別)提供新的理論和方法。
雖然微衛(wèi)星是研究道地藥材非常理想的遺傳標(biāo)記,但在實際的應(yīng)用中仍有不足之處,除了一些已知大量序列信息的研究對象以外(如人類,常規(guī)的實驗動物和一些農(nóng)作物),對于一個序列信息完全未知的新種,必須首先建立基因文庫并篩選微衛(wèi)星位點,實驗工作繁瑣且耗時費力。微衛(wèi)星位于非編碼區(qū)的概率比編碼區(qū)高,因此在某些情況下不能反應(yīng)出功能基因組范圍內(nèi)的遺傳水平。總之,隨著實驗技術(shù)的改進,統(tǒng)計分析方法和檢驗手段的日趨完善,微衛(wèi)星群體遺傳學(xué)將在道地藥材研究中發(fā)揮更大的作用,在具體科研中應(yīng)該針對需要解決的問題,選擇合適的分子標(biāo)記和分析方法,才能更好的解釋道地藥材的本質(zhì)。
[參考文獻]
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毫無疑問 癌癥已成為人類的頭號殺手,其高死亡率令人談癌色變。全世界各個國家都投入了大量的人力物力進行癌癥防治研究,無數(shù)的科研工作者都在爭分奪秒地探尋癌癥的發(fā)病機理和治療途徑。馮寶章與他帶領(lǐng)的韋爾柏(V-erb)基因治療公司,專門從事癌癥基因治療產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用,已經(jīng)率先取得重大突破。
韋爾柏基因治療公司具有雄厚的科研實力,其創(chuàng)始人馮寶章已經(jīng)從事白血病等癌癥發(fā)病原理研究近40年。他是中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院,中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)血液學(xué)研究所教授、研究員 碩士生導(dǎo)師政府特貼專家,香港金紫荊勛章獲得者,曾擔(dān)任中華醫(yī)學(xué)會醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會腫瘤遺傳學(xué)組組長,天津市遺傳學(xué)會理事、國家醫(yī)學(xué)成果評審專家等職,主編、參編專著5本,參與發(fā)表的論文多達五十余篇、
從國際經(jīng)驗來看,控制癌癥肆虐的根本出路在于預(yù)防,如果癌癥發(fā)展到中晚期再進行治療,治愈率低,治療成本高,對于患者,患者家庭乃至整個國家都是一件代價高昂的事情,中國每年癌癥病人的醫(yī)療費用高達近千億元,占全國醫(yī)療衛(wèi)生總費用的20%以上,遠高于其他慢性病的醫(yī)療費用。而預(yù)防癌癥的成本遠遠低于治療癌癥因此“早發(fā)現(xiàn),早診斷、早治療”是抗擊癌癥的關(guān)鍵 馮寶章說,轉(zhuǎn)變?nèi)裼^念,將晚期治療提前到早期預(yù)防,將大大節(jié)省癌癥醫(yī)治的社會和家庭成本。
但是長期以來,癌癥預(yù)防存在著一個難題――癌癥組織的早期標(biāo)本很難獲取 研究人員得到的癌癥標(biāo)本大多是晚期癌組織,不能很好地認識癌癥的本質(zhì)、馮寶章和他的研究團隊注意到,由于人口遷徙流動較少,我國中西部及農(nóng)村地區(qū)有著豐富的疾病家系資源,其中包括癌癥家系資源。馮寶章充分利用了這些資源 以家族性白血病為研究突破口,對白血病等癌癥的病因、發(fā)病和癌變原理進行了深入研究、他發(fā)現(xiàn),迄今為止骨髓增生異常綜合征(MDS)病人中白血病前期的診斷都是回顧性的,即待病人發(fā)生白血病時方才認識到該病人曾存在MDS時期。他還通過應(yīng)用雞原始紅細胞增多癥病毒癌基因V-erbB和V-erbB+A為探針進行印跡雜交,結(jié)果提示人類白血病的發(fā)病原理和病因可能與禽類紅白血病相似,j在人類進化過程中,由于禽類紅白血病病毒感染,其癌基因V-erbB反轉(zhuǎn)和插入而成為人類內(nèi)源性V-erbB。當(dāng)它發(fā)生突變和擴增而激活時,導(dǎo)致人骨髓干/組細胞異常增生并在其他相關(guān)基因擴增的配合下發(fā)展為白血病,他的發(fā)現(xiàn)酮明了白血病等癌癥的發(fā)病基因及其異常,這些研究成果是國內(nèi)外前所未有的創(chuàng)新。通過潛心研究在此基礎(chǔ)上,馮寶章發(fā)明了“反基因V-erbB寡核苷酸及其應(yīng)用’(專利號ZL001090232)。這項技術(shù)是針對癌癥早期致病基因異常而設(shè)計和合成的,涉及反基因V-erbB寡核苷酸,其多肽產(chǎn)物,萁的藥物組合物及其在診斷和冶療骨髓增生異常綜合征,白血病和其他多種腫瘤中的應(yīng)用 它首次證明人類癌癥確實是由腫瘤病毒癌基因引起的,同時解答了癌癥的共同遺傳背景和發(fā)病早期。經(jīng)過實地應(yīng)用,在我國兩個食管癌高發(fā)區(qū)――河北省磁縣和涉縣,這項基因治療技術(shù)實現(xiàn)了將癌癥早期逆轉(zhuǎn)為正常,馮寶章認為在癌癥高發(fā)區(qū)開展群防群治,堅持3~5年。有望將其癌癥發(fā)病率和病死率降到正常水平。
基因在決定個體表型方面起著決定性作用,通過賦予個體對疾病的易感性或抵抗力,以及影響機體與環(huán)境因素的相互作用,基因?qū)膊〉陌l(fā)生起著間接或直接作用。因此,人們希望通過識別疾病相關(guān)基因,以最終實現(xiàn)疾病的基因診斷和基因防治[1]。
因絕大多數(shù)疾病是多個微效基因協(xié)同作用并與環(huán)境因素共同導(dǎo)致,此類基因賦予患者易感性,故稱為疾病易感基因(susceptibility genes)。隨著分子遺傳學(xué)和人類基因組計劃的發(fā)展和實施,分析復(fù)雜疾病的遺傳因素,定位疾病易感基因成為可能,從而為疾病的早期診斷和預(yù)警帶來了希望[2]。迄今為止,對符合孟德爾規(guī)律的單基因病已經(jīng)建立了一套行之有效的研究體系并定位克隆了近千個致病基因。但對于多基因病,因其不完全符合孟德爾規(guī)律,所以在其易感基因的定位和遺傳分析中仍存在很多問題。多基因病易感基因的定位和遺傳分析成為近年來醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究的熱點和難點。
多基因病涉及的主要為一些常見疾病,如原發(fā)性高血壓、糖尿病、哮喘、銀屑病、神經(jīng)及精神疾病等,其群體總患病率近6 %[3]。它們雖有一定程度的家族傾向,但不遵從典型的孟德爾遺傳規(guī)律,其表型與基因型之間的關(guān)系錯綜復(fù)雜,對其致病基因的分離尚缺乏成熟的技術(shù),必需在人群與遺傳標(biāo)志的選擇、數(shù)學(xué)模型的建立、統(tǒng)計方法的改良等方面進行不斷的探索和艱苦的工作。當(dāng)今國內(nèi)外學(xué)者所采取的基本策略主要是從改進實驗技術(shù)和遺傳分析方法等方面開展研究,其中常用的方法是大規(guī)模全基因組掃描和分型的連鎖分析[4,5],即首先選定研究樣本如家系、同胞對或人群,用遺傳位標(biāo)對樣本成員針對全基因組、某染色體區(qū)段或某候選基因進行掃描,最后將所得數(shù)據(jù)用相應(yīng)統(tǒng)計方法分析,確定哪些區(qū)段或基因與所研究的疾病間存在連鎖或相關(guān)關(guān)系。
一、全基因組掃描策略
全基因組掃描(genomewide search)利用DNA多態(tài)性標(biāo)記(主要是微衛(wèi)星DNA)或消減雜交等策略,對基因組逐個點進行篩查,進行全基因組掃描,尋找與疾病相關(guān)的易感基因。用多態(tài)性遺傳位標(biāo)對樣本個體進行基因掃描和分型,定出每一個體遺傳位標(biāo)的等位基因。用統(tǒng)計軟件(如GENEHUNTER等)進行遺傳統(tǒng)計分析,確定與疾病相連鎖的染色體區(qū)段,通過增加掃描密度或單倍型分析等方法,將定位區(qū)域盡可能縮小。遺傳位標(biāo)目前大多采用微衛(wèi)星多態(tài)標(biāo)記(short tandem repeats, STR),單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNP)被認為是很有前途的新一代遺傳位標(biāo)。
1.樣本的收集和提取DNA樣本:當(dāng)前全基因組掃描基因定位主要是采用以家系為基礎(chǔ)的分析方式。
選擇理想家系。所謂理想家系應(yīng)符合(1)診斷準(zhǔn)確,且為遷移較小、相對封閉的人群;(2)家系的數(shù)目及大小需達到一定要求;(3)有明確的遺傳相關(guān)數(shù)據(jù),如遺傳方式、遺傳度、外顯率等。家系材料的收集應(yīng)盡可能全面,包括血液樣本、組織切片、分離的細胞株、臨床檢驗結(jié)果等[6]。
此外,還有以患病同胞對、核心家庭或以人群為基礎(chǔ)的分析形式,選擇相對應(yīng)的不同樣本。
2.DNA短串聯(lián)重復(fù)序列STR方法:(1)選擇與制備。全基因組掃描中利用的微衛(wèi)星標(biāo)記,是一種廣泛存在于人類基因組、以2~6個堿基為單位、串聯(lián)重復(fù)排列的序列,具有高度的多態(tài)性,并以孟德爾共顯性遺傳,可以作為一種遺傳標(biāo)記。目前商品化的AB I PR ISMTM Linkage Mapping Set(PE公司出品)共包含400個STR,分辨率達
在上述區(qū)段內(nèi)選擇覆蓋密度更高的微衛(wèi)星標(biāo)記,進行精細定位,盡量縮小致病基因的范圍,明確基因位點。第三代遺傳標(biāo)志系統(tǒng)—單個核苷酸多態(tài)性,因其數(shù)目更多、覆蓋密度更大(有可能達到人類基因組遺傳多態(tài)性標(biāo)志位點數(shù)目的極限),故在基因定位研究中具有其它標(biāo)志系統(tǒng)不可比擬的優(yōu)越性和潛力,目前被大量使用。
3.SNP的發(fā)展:1990年開始啟動的人類基因組計劃(human genome project, HGP)揭開了人類遺傳信息的秘密。隨著研究的深入,人類基因組單核苷酸多態(tài)性( single nucleotide poly-morphisms, SNPs)的研究應(yīng)運而生,并且得到迅猛的發(fā)展。SNPs數(shù)量大、分布廣且在不同人群中的分布頻率也有差異,這些差異可以代表某一種族或人群間的遺傳差異[8]。SNPs是指基因組DNA序列中由于單個堿基(A、T、C、G)的變異而形成的多態(tài)性,并且這種變異人群中出現(xiàn)的頻率大于1 %[9]。SNP的位點及其豐富,幾乎遍及整個基因組。據(jù)估計基因組中大約平均每1 000 bp,就會出現(xiàn)一個SNP,這樣SNP在整個基因組的分布就會達到300萬個。
由于SNP在基因組中的高密度的特點,與以前的微衛(wèi)星或其它遺傳標(biāo)記相比,利用SNP可以在上述的研究中對目的片段或基因作出更加精細的標(biāo)定,從而使研究不斷深入。目前,幾個相對有前景的半自動或全自動地進行大量SNP檢測的方法已經(jīng)初露端倪。包括小型測序、多重反向點雜交、DNA芯片或微列陣,以及TaqMAN的方法[10]。
4.基因芯片:基因芯片的基本原理是應(yīng)用已知的核苷酸序列作為探針與標(biāo)記的靶核苷酸序列進行雜交,通過對信號的檢測進行定性與定量分析。它將許多探針同時固定在同一芯片上,在一次試驗中,可以同時平行分析成千上萬個基因[11]。因此它和傳統(tǒng)雜交法相比具有操作簡單、效率高、成本低、自動化程度高、檢測靶分子種類多、結(jié)果客觀性強等明顯的優(yōu)點。
基因芯片現(xiàn)已廣泛使用于基因表達分析,疾病診斷與治療等方面。例如基因芯片技術(shù)對血友病、杜氏肌營養(yǎng)不良癥、地中海貧血、異常血紅蛋白病、苯酮尿癥等的檢測均已取得了較大的成功[12]。隨著“人類基因組計劃”和“后基因組計劃”的開展,越來越多的遺傳病相關(guān)基因會被揭示出來,這為在基因水平上揭示遺傳病,并進行早期診斷奠定了基礎(chǔ)。
二、全基因組掃描數(shù)據(jù)分析方法
1.連鎖分析:在遺傳過程中,2個基因或遺傳標(biāo)志被一起分配到子代而不發(fā)生交換,稱為連鎖(linkage)。兩個基因位點發(fā)生交換的可能性反映了這兩個基因的遺傳距離,所以由標(biāo)記位點與疾病位點間的重組率可估算出兩者間的遺傳距離及連鎖程度。根據(jù)疾病有無合適的遺傳模式,可分別進行參數(shù)分析與非參數(shù)分析。(1)參數(shù)分析法。亦稱模式依賴的連鎖分析法,即一般所指的連鎖分析法。兩位點連鎖分析最常用的是LODS 連鎖分析,即對數(shù)優(yōu)勢計分法(log odds score ,LODS) 是基于最大似然比檢驗的參數(shù)連鎖分析方法[13],主要檢測在兩基因以某一重組率相連鎖時,出現(xiàn)這種情況的似然性有多大。該分析方法利用一個家系中所有成員之間的遺傳信息,適用于已知遺傳方式的單基因遺傳病的基因定位。目前該計算有相應(yīng)軟件包可供使用,如Linkage, Lipid,Vitesse,Gene, Hunter[14~17]等。(2)非參數(shù)分析法。此法不依賴于疾病的遺傳模式,被認為是多基因疾病的理想分析法。其研究對象限于家系中成對的患病成員,常用的非參數(shù)分析法有患病同胞對法和患病家系成員法。但非參數(shù)分析法在檢出效力及分析可靠性上較參數(shù)連鎖分析低,它也不能象LODS法那樣得出遺傳標(biāo)記和易感基因之間的距離?;疾⊥麑Ψ?affected sibpair ,ASP)原理是,如同胞對均為患者,他們將共有帶有致病基因的那段染色體,通過標(biāo)記物確定個體的基因型,可找出染色體上共有超出理論值的區(qū)域,從而對疾病基因進行定位?;疾〖蚁党蓡T法(affected pedigree member ,APM)原理與ASP法相同,只是把研究對象擴展到整個家系的所有成員(包括患病的成對遠親),從而解決ASP法分析時家系資料不足的問題,其分析遺傳標(biāo)記和易感基因連鎖的有效性則比ASP低。它只能確定致病基因與一個較大的染色體區(qū)域的連鎖關(guān)系,而不能用于致病基因的精細定位[18]。目前,APM法較多用于同胞對收集較困難的晚發(fā)性多基因遺傳病的遺傳分析。
2.人群相關(guān)性分析:在一個群體中設(shè)立病人組和對照組,確定遺傳位標(biāo)頻率在兩組中是否存在差別,即分析遺傳位標(biāo)基因型與性狀基因間有否連鎖不平衡,進而在該遺傳位標(biāo)附近尋找目標(biāo)基因。選用隔離人群進行連鎖不平衡分析更為理想。
3.傳遞- 連鎖不平衡檢驗:染色體上遺傳位標(biāo)與疾病位點間的距離較近,它們在傳遞過程中一起傳遞給子代,表現(xiàn)為共分離,即連鎖不平衡(linkage disequilibrium )[19]。由于群體相關(guān)分析可能產(chǎn)生因群體分層而導(dǎo)致的假陽性,近年來有人提倡用患者核心家系成員(雙親及同胞)作為相關(guān)分析對照組,即Spielman創(chuàng)立的傳遞- 連鎖不平衡檢驗(transmission/disequilibrium test, TDT)[20]。TDT基于連鎖不平衡的分析方法,一般用于親代的標(biāo)記等位基因是雜合型,觀察可能的易感標(biāo)記等位基因傳遞給患病子代的概率。一般情況下,當(dāng)通過病例-對照研究已經(jīng)揭示在人群水平上某標(biāo)記位點與某性狀(如疾病)間存在某種關(guān)聯(lián)性(無論是真實還是虛假的關(guān)聯(lián))時,進行傳遞/不平衡檢驗可排除可能的虛假關(guān)聯(lián)[20]。
三、展望
多基因病的遺傳模式尚未確定,性狀的變異往往受眾多基因與環(huán)境的共同調(diào)控,相互間又存在一定程度的互作[21]。基因與基因間、基因與環(huán)境因素間的相互作用到目前為止還無法檢測,所以多基因疾病的定位結(jié)果往往不盡如人意。然而SNP和DNA芯片等新技術(shù)的出現(xiàn),為多基因遺傳病易感基因的定位展示了廣闊的前景。多基因疾病的發(fā)病存在種族、地區(qū)差異,所以易感基因的定位應(yīng)開展國際性各地區(qū)多個實驗室合作研究。我國地大人稠、民族眾多,由于歷史、地理、傳統(tǒng)等原因,保存著許多相對隔離群體,這是我們開發(fā)人類疾病相關(guān)基因研究一項不可多得的資源優(yōu)勢。充分利用我國豐富的家系資源,迅速開展多基因疾病全基因組掃描和分型的連鎖分析、相關(guān)分析研究,對推動我國多基因疾病研究和提高我國人類遺傳學(xué)科研水平具有極為重要的現(xiàn)實意義??傊?,重視遺傳統(tǒng)計學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展,易感基因的定位才能有所突破。
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