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【關(guān)鍵詞】 多態(tài)性,單核苷酸;出生體重;胰島素;敏感性與特異性;雙生研究
【中圖分類號】 R 179 R 339.3+5 Q 987 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】 A 【文章編號】 1000-9817(2008)03-0238-03
A Twin Study on Association of SHP Polymorphisms with Birth Weight and Insulin Sensitivity/CHEN Tian-jiao, JI Cheng-ye, WANG Ying, et al. Institute of Child and Adolescent Health, Peking University, Beijing (100083), China
【Abstract】 Objective To study the effect of SHP (small heterodimer partner gene) polymorphisms on birth weight and insulin resistance, and to detect the SHP rs7504 polymorphisms. Methods DNA microstatellite polymorphism was used to diagnose zygosity of 393 twin pairs (MZ 256, DZ 137). Birth weight was gained by questionnaire and insulin sensitivity was estimated with logarithm transformed homeostasis model assessment (HOMA). PCR-RFLP analysis was performed to detect the SHP rs7504 polymorphisms. Identity by state (IBS) of non-Parametric Linkage Analysis Methods was used to analyze the association of polymorphisms with birth weight and insulin sensitivity. Results The genotype frequencies of TT, TC and CC were 84.9%, 14.1% and 1.0%. The interclass co-twin correlations of blood glucose, and HOMA-IR of those twin pairs sharing 2 alleles of IBS were greater than those sharing 0-1 alleles of IBS. BMI, blood glucose and birth weight of those carrying the mutant C allele were higher, but the differences had no statistical significance. Conclusion SHP polymorphisms might be associated with insulin resistance and birth weight, further studies are necessary to confirm the results.
【Key words】 Polymorphism, single nucleotide; Birth weight; Insulin; Sensitivity and specificity; Twin studies
胰島素抵抗和高胰島素血癥是代謝綜合征的基礎(chǔ)[1],并被認(rèn)為是聯(lián)系肥胖與冠心病、高血壓、糖尿病的中心環(huán)節(jié)。兒童和青少年雖很少發(fā)生上述明顯的疾病,但是其潛在危險(糖、脂代謝異常和高血壓傾向)卻普遍存在[2]。近年來越來越多的流行病學(xué)研究顯示,低出生體重與青少年及成年期的胰島素抵抗綜合征的發(fā)生密切相關(guān),發(fā)生機(jī)制尚不明確,可能是由于早期營養(yǎng)不良導(dǎo)致的程序化,也可能是由于共同的遺傳基因作用。
雙生子研究是研究遺傳和環(huán)境影響的重要手段。雙生子又是研究基因多態(tài)性與功能關(guān)系的特殊人群,雙生子同胞年齡相同,宮內(nèi)環(huán)境及早期生活環(huán)境相似,在研究基因和表型之間的相關(guān)性時可以更好地控制混雜因素,在驗(yàn)證胎源性假說時有特殊意義[3-4]。
微小異源二聚體伙伴基因(small heterodimer partner gene,SHP) 編碼的蛋白產(chǎn)物是核受體超家族的成員之一,與其他多種激素受體相互作用,同時能增強(qiáng)過氧化物酶體增強(qiáng)激活受體(PPAR) 的轉(zhuǎn)錄活性,參與膽固醇代謝。有研究發(fā)現(xiàn),SHP基因與日本人輕、中度肥胖及出生體重增加有關(guān),提示SHP基因可能參與胎兒宮內(nèi)發(fā)育的調(diào)節(jié)[5]。筆者的研究目的是檢測SHP基因的SNP 位點(diǎn)rs7504多態(tài)性。
1 對象與方法
1.1 對象 依據(jù)山東省青島市雙生子登記系統(tǒng),收集5~18歲雙生子393對,其中單卵雙生子(MZ)256對,二卵雙生子(DZ)137對;平均年齡(12.0±3.5)歲。同一對雙生子在同一天受檢,并取得家長及本人的知情同意。經(jīng)嚴(yán)格體檢和問卷詢問,排除影響血糖或胰島素疾病者、各類繼發(fā)性肥胖及1個月內(nèi)服用減肥、降糖降脂等藥物者。
1.2 方法
1.2.1 卵型鑒定 卵型鑒定應(yīng)用DNA短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)進(jìn)行。酚氯仿法提取血凝塊中DNA,PCR復(fù)合擴(kuò)增4個多態(tài)性位點(diǎn)D16S539, D7S820, D13S317, D5S818(美國Promega公司試劑盒),熒光標(biāo)記引物,產(chǎn)物經(jīng)垂直凝膠電泳和激光掃描后,比較4個位點(diǎn)的一致性以鑒別卵型,可靠性達(dá)99.6%以上。該項(xiàng)工作在北京法醫(yī)鑒定中心生物物證室完成。
1.2.2 測量指標(biāo) 包括身高(cm)、體重(kg)、體質(zhì)指數(shù)(BMI,kg/m2)、腰臀圍比(WHR)、血糖(GLU,mmol/L)、胰島素(INS,mU/L)、出生體重(g)。出生體重由問卷詢問得到;身高及體重測量按《中國學(xué)生體質(zhì)健康狀況調(diào)研細(xì)則》進(jìn)行;體質(zhì)量指數(shù)計(jì)算為體重(kg)/身高2(m2)。受檢雙生子于清晨空腹采血(禁食至少8 h),同一對雙生子間隔采血時間小于5 min;葡萄糖氧化酶法測定血糖,放射免疫法測定血胰島素(中國原子能科學(xué)研究所)?,F(xiàn)場和實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控均符合要求。胰島素敏感性評估采用穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment insulin resistance index,HOMA-IR):HOMA-IR =FPG×FINS/22.5(FPG為空腹血糖,F(xiàn)INS為空腹胰島素),模型建立基于血糖和胰島素在不同器官的相互影響,反映機(jī)體的胰島素抵抗。
1.2.3 基因多態(tài)性檢測 應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法檢測SHP rs7504多態(tài)性。PCR上游引物為:5'-GGACCTCTTCTTTCGCCCTATC-3';下游引物為:5'-TGGTCCAATAAGCAGCCTAAGC-3'(北京奧科公司合成)。25 μL的PCR反應(yīng)體系中,模板DNA 100 ng,Tag酶0.5 IU。反應(yīng)條件為:(1)預(yù)變性94℃,5 min;(2)35個循環(huán),每個循環(huán)94℃變性1 min,63℃退火1 min,72℃延伸1 min;(3)終末延伸72℃,5 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物以BsiHKA-Ⅰ(NEB)酶切,65℃水浴16 h。2.5%瓊脂糖凝膠電泳,150 V,25 min,紫外燈下讀取基因型。共3種SHP基因型:TT(363 bp) ,TC(101 bp,262 bp,363 bp),CC(101 bp,262 bp)。
1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 在基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡的雙生子人群中進(jìn)行如下分析。
比較具有相同等位基因的二卵雙生子同胞對內(nèi)變量的相關(guān),采用非參數(shù)連鎖分析方法,以基因多態(tài)性為標(biāo)記,分別比較當(dāng)狀態(tài)一致(identity by state,IBS)為0,1和2時雙生子同胞間各性狀指標(biāo)差值平方的大小及雙生子組內(nèi)相關(guān)系數(shù)。W檢驗(yàn)分布正態(tài)性,HOMA-IR為偏態(tài)分布,統(tǒng)計(jì)分析時經(jīng)自然對數(shù)轉(zhuǎn)換。正態(tài)資料比較采用配對t檢驗(yàn),非正態(tài)資料采用配對的非參數(shù)檢驗(yàn)(Wilcoxon Matched-Pairs,Signed-Ranks Test)。調(diào)整性別和年齡。分析采用SPSS 13.0軟件完成。
2 結(jié)果
2.1 基因多態(tài)性結(jié)果 SHP基因多態(tài)性鑒定結(jié)果如圖1。TT,TC和CC基因型頻率分別為84.9%,14.1%和1.0%。T,C等位基因頻率分別為92.0%和8.0%。χ2檢驗(yàn)顯示,該雙生子人群基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡,說明該群體基因已達(dá)到遺傳平衡,具有代表性。
2.2 基因多態(tài)性與各性狀水平的關(guān)系 隨機(jī)抽取雙生子對中的一個,分析基因型和各性狀水平的關(guān)系。將CC與TC合并在一起,雙生子分為未攜帶突變等位基因的野生型(TT)和攜帶突變等位基因的突變型(TC,CC)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)突變者BMI、血糖和出生體重與未突變者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。SHP基因野生型和突變型對象出生體重與各性狀指標(biāo)關(guān)系的比較顯示,野生型和突變型中BMI均與出生體重正相關(guān),血糖均與出生體重負(fù)相關(guān);而對于胰島素抵抗指數(shù),野生型與出生體重負(fù)相關(guān),突變型為弱正相關(guān)。見表2。提示野生型出生體重越低,胰島素抵抗指數(shù)越高;而突變型似乎對此有保護(hù)作用。
2.3 雙生子同胞間IBS不同時各指標(biāo)的組內(nèi)相關(guān)系數(shù) 單卵雙生子中,以SHP基因多態(tài)性為Marker,比較當(dāng)IBS為0,1和2時雙生子同胞間各性狀指標(biāo)的差異及組內(nèi)相關(guān)系數(shù),見表3。
SHP位點(diǎn)雙生子同胞間IBS為0,1,2的雙生子分別有1,18,118對。因IBS為0的雙生子對數(shù)太少,將其放入IBS為1組參加分析。見圖2,3。
IBS為1時,有WHR和GLU雙生子對內(nèi)差異大于IBS為2時,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IBS為2時,血糖和反映胰島素敏感性的HOMA-IR在雙生子兩者間的相關(guān)系數(shù)較大,而血糖在IBS為1時相關(guān)系數(shù)很低,且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;IBS為2時組內(nèi)相關(guān)系數(shù)有顯著性。提示這些指標(biāo)與SHP的多態(tài)性有關(guān)。其余各指標(biāo)相關(guān)系數(shù)在IBS為1時稍大于IBS為2時,可能與IBS為2時雙生子對數(shù)較多有關(guān),提示其與SHP的多態(tài)性關(guān)系不大。
3 討論
本研究雙生子人群TT,TC和CC基因型頻率分別為84.9%,14.1%和1.0%;T,C等位基因頻率分別為92.0%和8.0%。與國內(nèi)某研究結(jié)果相似,但與白種人明顯不同,與美國印第安人相近[6]。
本研究采用源于患病同胞對分析的IBS概念,分析基因多態(tài)性與各性狀指標(biāo)的關(guān)系。IBS為2時雙生子同胞間血糖和HOMA-IR組內(nèi)相關(guān)系數(shù)大于IBS為1時,說明SHP基因多態(tài)性與血糖和胰島素敏感性有某種程度的關(guān)聯(lián)。而比較當(dāng)未攜帶C(TT)和攜帶C(TC,CC)基因時各指標(biāo)的均值發(fā)現(xiàn),突變者BMI,血糖和出生體重高于未突變者,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與突變者出生體重更高且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果不一致,這可能是由于雙生子人群較為特殊,平均出生體重較低,難于發(fā)現(xiàn)區(qū)別;或SHP基因多態(tài)性并非是胰島素抵抗或者出生體重的主要遺傳因素,也可能是衡量胰島素敏感性的指標(biāo)不夠精確引起[6]。比較野生型和突變型對象出生體重與各性狀指標(biāo)關(guān)系發(fā)現(xiàn),野生型和突變型中出生體重越低,BMI越低,血糖越高。對于胰島素抵抗指數(shù),野生型出生體重越低,胰島素抵抗指數(shù)越高;而突變型卻相反,似乎對此有保護(hù)作用。某大型雙生子研究結(jié)果顯示,低出生體重和糖尿病可能存在由宮內(nèi)環(huán)境引起的程序化影響,不排除有共同遺傳因素作用[7]。筆者認(rèn)為二者之間也存在相互作用。
有研究認(rèn)為,SHP基因突變導(dǎo)致其抑制HNF-4а轉(zhuǎn)錄活性的功能下降,從而HNF2-а的活性增強(qiáng),導(dǎo)致胰島素分泌增加[5]。胎兒胰島素增加致使胎兒生長加速,出生體重增加,為日后肥胖奠定基礎(chǔ)。另外,SHP基因突變可能增強(qiáng)脂肪合成中起重要作用的PPARs的轉(zhuǎn)錄活性[8],可能與脂肪細(xì)胞分化和肥胖有關(guān)。本研究中突變與BMI、血糖和出生體重的關(guān)系似乎也從一方面支持以上結(jié)果,但仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本研究。筆者本次也檢測了雙生子中PPARγ2的Pro12Ala基因多態(tài)性,結(jié)果發(fā)現(xiàn),這2個基因可能對BMI、腰臀圍比、血糖、胰島素、HOMA-IR等指標(biāo)有聯(lián)合作用[9]。
SHP基因多態(tài)性可能與血糖、胰島素敏感性及出生體重有關(guān),但仍有待于進(jìn)一步研究。
4 參考文獻(xiàn)
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關(guān)鍵詞:分子標(biāo)記;藥用植物;簡單序列重復(fù)(SSR);擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP);單核苷酸多態(tài)性分析技術(shù)(SNPs)
中圖分類號:S567 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:0439-8114(2017)13-2401-05
DOI:10.14088/ki.issn0439-8114.2017.13.001
Progress and Application of Molecular Marker Technology in Medicinal Plants
CHEN Hong-boa, YU Jin-ruib, YANG Chun-xianb, QIAN Ganga
(a.Department of Cell Biology and Genetics; b.School of Dentistry, Zunyi Medical College, Zunyi 563003, Guizhou, China)
Abstract: By summarizing the principle and technical characteristics of the commonly used molecular marker technology in recent years and its application in the field of medicinal plant research,this paper provides a reference for the development and evaluation of medicinal plant resources, and further provides ideas for the screening and verification of functional gene of medicinal plants.
Key words: molecular marker; medicinal plants; simple sequence repeat(SSR); amplified fragment length polymorphisms(AFLP); single nucleotide polymorphisms(SNPs)
中是野生中藥材資源最為豐富的國家,目前已識別有11 000多種,無論其種類或數(shù)量均列世界之首[1],為中國中藥文化產(chǎn)業(yè)的國際化創(chuàng)造了豐富的資源條件。但近年來,隨著人們對養(yǎng)生、保健等意識的不斷提高,導(dǎo)致中藥材的市場需求極度擴(kuò)增,一些以野生種質(zhì)消耗為主的名貴中藥材正面臨瀕危甚至滅絕。傳統(tǒng)的研究利用方法在藥用植物識別、開發(fā)、利用以及保護(hù)等方面都相對落后。然而近些年,以RFLP[2]為代表的DNA分子標(biāo)記技術(shù)的興起,為實(shí)現(xiàn)當(dāng)代藥用植物研究的現(xiàn)代化提供了現(xiàn)實(shí)手段與條件。分子標(biāo)記技術(shù)(亦或分子鑒別技術(shù)或DNA分子標(biāo)記技術(shù))[3,4],是一種基于遺傳物質(zhì)的研究方式,這使其具備了不受生長環(huán)境的影響、檢驗(yàn)精度高及重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)的不斷運(yùn)用與革新,以分子雜交為基礎(chǔ)的第一代標(biāo)記技術(shù),由于操作過程復(fù)雜、周期長等原因,正逐漸退出分子研究領(lǐng)域。而圍繞PCR技術(shù)為核心的新型分子標(biāo)記技術(shù)正廣為使用,并日臻成熟。
1 常用分子標(biāo)記技術(shù)的原理及特點(diǎn)
1.1 簡單序列重復(fù)(Simple sequence repeat,SSR)
SSR亦稱為微衛(wèi)星DNA,它由2-5個堿基組成,如(GA)n、(TG)n、(GAC)n等,其中最常見為二核苷酸重復(fù)形式。SSR序列的長度在不同基因組間由于重復(fù)次數(shù)以及程度的不同具有高度的變異性,而展現(xiàn)出較高的多態(tài)性。SSR標(biāo)記原理是根據(jù)其兩端的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物,經(jīng)過PCR擴(kuò)增后,再利用變性或者非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離,繼而體現(xiàn)不同樣本基因組DNA的多態(tài)性。
簡單重復(fù)序列具有較多優(yōu)點(diǎn),其共顯性可區(qū)分純合型與雜合型,以及還有靈敏度高、穩(wěn)定性好以及操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。但目前SSR獲得的方式參差不齊,前提都是要提前知道目的基因的序列信息。
1.1.1 簡單重復(fù)區(qū)間序列(Inter-simple sequence repeat,ISSR) ISSR是Zietkiewicz等[5]于1994年發(fā)展起來的一種加錨SSR技術(shù)。它的原理是在SSR引物的5′或3′端錨定2個或以上的SSR堿基,引起特定位點(diǎn)退火,從而提高擴(kuò)增專一性,得到的特異性片段再通過變性或非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行分離,最后根據(jù)不同的多態(tài)性條帶分析多態(tài)性。
其優(yōu)點(diǎn)在于無需提前知道樣品基因序列,ISSR可為研究者快速高效地提供基因組信息;引物序列相對較長,通過提高退火溫度進(jìn)而保證了結(jié)果的可靠性;樣本DNA質(zhì)量要求不高,且所需量少;引物的通用性廣,不具種屬特異性。但在實(shí)際應(yīng)用中也存在一定缺陷,如:穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)體系條件需要探索構(gòu)建,且顯性標(biāo)記亦不能區(qū)分純合型和雜合型。
1.1.2 表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed sequence tags,ESTs) 表達(dá)序列標(biāo)簽是基于EST數(shù)據(jù)庫或cDNA文庫的一種標(biāo)記技術(shù),是一種能快速、高效地揭示基因容量的標(biāo)記方法,由1989年Venter首次提出。它能特異地展示出基因某一位點(diǎn)的表達(dá)情況,能夠直接反映出功能基因的生物信息[6],同時也為地道藥用植物的鑒別、開發(fā)利用提供了新的候選基因。因此,基于ESTs開發(fā)的SSR技術(shù)(即EST-SSR)是一種穩(wěn)定、可靠的分子標(biāo)記技術(shù)[7],可直接用于基因作圖[8],從而指導(dǎo)功能基因的預(yù)測。
EST-SSR與傳統(tǒng)SSR技術(shù)相比較,無需構(gòu)建DNA文庫而節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本。而且,在功能基因研究方面,EST-SSR更接近功能基因組;表達(dá)序列標(biāo)簽直接來源于編碼序列,從而為基因組比較學(xué)以及同源基因的研究提供更可靠的途徑。但也有不足之處:與SSR相比,多態(tài)性較低;同時,ESTs只代表了基因組DNA的一部分,所包含的信息不夠全面,且現(xiàn)行的一些序列拼接軟件也存在一定的局限性,分析過程中也可能丟失一些重要的基因組信息。
1.2 擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(Amplified fragment length polymorphisms,AFLP)
AFLP是1992年荷蘭科學(xué)家Zabeau和Vos發(fā)明的一項(xiàng)新專利[9]。其原理是植物基因組DNA經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切后(通常采用雙酶切),與特定的接頭相結(jié)合而得到帶有特定接頭的特異性片段,這些片段再與PCR引物的3′端識別后進(jìn)行特異性擴(kuò)增,最后再將擴(kuò)增產(chǎn)物通過聚丙烯酰氨凝z電泳篩選,進(jìn)而分析其多態(tài)性。
AFLP是RFLP技術(shù)與PCR技術(shù)的結(jié)合,其具備了高多態(tài)性、操作簡易、可以同時處理大量樣品等優(yōu)點(diǎn)。近年來,AFLP已廣泛應(yīng)用于藥用植物遺傳圖譜的繪制、物種遺傳多樣性分析及分類研究、輔助育種、功能基因定位等多方向的研究[10,11],且AFLP目前已被公認(rèn)為構(gòu)建DNA指紋圖譜最可靠的分子標(biāo)記。其缺點(diǎn)主要是對樣品DNA的質(zhì)量要求較高,實(shí)驗(yàn)成本也較昂貴,擴(kuò)增所得結(jié)果的分析也相對困難。
1.3 DNA條形碼技術(shù)
2003年Guelph大學(xué)的Hebert等首次提出DNA條形碼的概念。它是以足夠變異且相對較短的DNA序列為標(biāo)準(zhǔn),建立的一種新的生物身份鑒別系統(tǒng),從而實(shí)現(xiàn)對物種快速、精準(zhǔn)地識別和鑒定,其類似于超市使用條形碼鑒別不同商品。通過特異DNA的比對,對于新種和隱種的發(fā)現(xiàn)也具有現(xiàn)實(shí)性的幫助[12]。Lahaye等[13]通過單獨(dú)使用matK基因?qū)? 000多種蘭科植物進(jìn)行系統(tǒng)分析,結(jié)果證明單獨(dú)使用matK基因能夠發(fā)現(xiàn)蘭科隱種并證明了DNA條形碼分析的可行性;Newmaster等[14]運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)發(fā)現(xiàn)了感應(yīng)草屬的3個隱種以及草沙蠶屬的1個新種。在2008年召開的植物無國界會議上提出了“超級條形碼”技術(shù)[15],決定將葉綠體全基因組序列作為條形碼序列應(yīng)用在植物物種的鑒別上。Shinozaki等[16]第一次完成了單一物種葉綠體全基因組的測序;2008年Diekmann等[17]又提出了一套較為標(biāo)準(zhǔn)的葉綠體DNA提取方法。Parks等[18]通過對松屬37個樣本進(jìn)行葉綠體全基因組測序分析,驗(yàn)證了葉綠體基因組可以作為植物物種水平上的條形碼。近年來,DNA條形碼技術(shù)在藥用植物研究中的報道也逐漸增多,對于加快中國生物進(jìn)化研究的步伐具有重要意義[19,20]。
1.4 基因芯片技術(shù)
基因芯片又稱DNA芯片或寡核苷酸陣列,它是將大量已知的探針固定在支持物上[21,22],通過核酸雜交,再利用激光掃描及分析,來實(shí)現(xiàn)對目的基因表達(dá)水平或多態(tài)性的分析。其高通量、自動化的優(yōu)勢使其廣泛用于基因的定位、藥物的靶向分析及新藥研發(fā)中。Schena于1995年第一次在論文中發(fā)表了DNA chip相關(guān)研究,F(xiàn)odor又于第二年年底研制出了第一塊DNA芯片[23]。
基因芯片技術(shù)目前主要應(yīng)用于一些新藥的研發(fā)[24,25]、藥物靶向研究以及疾病的診斷等方面。Watanabe等[26]采用高密度基因芯片技術(shù),對經(jīng) Egb761處理的小鼠的皮層和海馬細(xì)胞的基因表達(dá)進(jìn)行了研究,分析得出其具有拮抗神經(jīng)病變的藥理作用。李美德[27]應(yīng)用全基因組表達(dá)芯片來檢測從黃芩根中分離出的漢黃芩素作用于肝癌細(xì)胞后的基因表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)406個差異明顯的表達(dá)基因,通過差異基因的篩選和分析,從而確定了漢黃芩素抗肝癌的分子機(jī)制,對藥物靶向基因的確定,以及抗癌藥物的開發(fā)提供了新的依據(jù)。郭旭東[28]通過基因芯片技術(shù)對急性心肌梗死(AMI)患者和健康者外周血的RNA進(jìn)行差異分析,發(fā)現(xiàn)其中的差異基因CYP4F3和USP25可能為AMI診斷的基因標(biāo)記。張玉金等[29]通過利用從中國2010年版藥典中篩選出的基原植物以及從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載的相應(yīng)序列進(jìn)行分析,得到13 814條特異性探針,為中國藥典中基原植物檢測芯片的建立做出了重要貢獻(xiàn)。近年來,不同領(lǐng)域的實(shí)用芯片陸續(xù)都有報道,且基因芯片技術(shù)目前已是高通量藥物篩選的主要途徑,同時也是中藥活性成分篩選的重要手段。
1.5 單核苷酸多態(tài)性分析技術(shù)(Single nucleotide polymorphisms,SNPs)
SNPs是等位基因之間的單個核苷酸差異,如單個核苷酸的缺失、插入或者是突變等[30]。SNPs標(biāo)記技術(shù)相比微衛(wèi)星技術(shù)而言,SNPs描述的是一種雙等位基因的多態(tài)性,而SSR則是多位點(diǎn)等位基因之間的多態(tài)性,故SNPs在數(shù)量上遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過SSR,因此具有更高的多態(tài)性。在人的基因組中,大概1 000 bp就會出現(xiàn)一個SNP,因此可以其作為DNA的一種特異性標(biāo)記[31]。Xu等[32]通過對水稻親本9 311的SNP檢測,得到了768萬個多態(tài)位點(diǎn),從而繪制了1張高密度的Bin圖譜并成功定位了1個QTL。目前,由于SNP技術(shù)主要依靠于基因組DNA的大量測序或者是基因芯片技術(shù),且技術(shù)要求高以及實(shí)驗(yàn)成本大等原因,導(dǎo)致在藥用植物方面的研究也相對匱乏。
2 DNA分子標(biāo)記技術(shù)在藥用植物中的研究應(yīng)用
2.1 中藥材種質(zhì)資源的鑒定、評價及道地性研究
種質(zhì)資源是指親本遺傳給子代的遺傳物質(zhì),其包括“道地性”種質(zhì)資源、新種及重要培育品系等。徐蕾等[33]通過運(yùn)用SSR標(biāo)記技術(shù)在鐵皮石斛種群遺傳多樣性的研究,證實(shí)了鐵皮石斛具有較高的遺傳多態(tài)性,并順利將36份鐵皮石斛材料分成了3個類別。Shen等[34]利用篩選出的ISSR引物準(zhǔn)確地鑒別出了8個野生種石斛藥品。李永清等[35]利用ISSR技術(shù)成功將36份鐵皮石斛材料劃分為6個類群。趙香妍等[36]通過ISSR標(biāo)記技術(shù)在北京地區(qū)野生柴胡種質(zhì)資源中的研究,得出北京地區(qū)野生柴胡具有一定的地域性分布特征,應(yīng)加以保護(hù)及推廣種植。
2.2 中藥材真?zhèn)蔚蔫b別及品種鑒定
隨著中藥材市場需求的不斷擴(kuò)大,中藥材市場魚目混珠的情況時有發(fā)生,同類藥材由于道地性等導(dǎo)致藥效也相差甚遠(yuǎn),而常規(guī)的檢測方式卻很難區(qū)別。但現(xiàn)行的DNA分子鑒別技術(shù)基于高穩(wěn)定性、不受環(huán)境因素及個體發(fā)育影響等優(yōu)點(diǎn),可以保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。馬曉沖等[37]通過研究證明基于SNP的分子標(biāo)記技術(shù)能夠穩(wěn)定地鑒別中藥材澤瀉。滕艷芬等[38]利用matK基因已成功將正品與混淆產(chǎn)品鑒別開來。
2.3 遺傳多樣性及種屬親緣關(guān)系的研究
藥用植物遺傳多樣性及親緣關(guān)系的研究,對于認(rèn)識物種的進(jìn)化歷程、遺傳育種及物種改良等均具有重要意義。傳統(tǒng)的研究方法均是基于對表達(dá)產(chǎn)物的研究探索,但藥用植物的化學(xué)成分及其含量、外部形態(tài)等均會由于生長環(huán)境及其他因素影響而有所差別。因此,從傳統(tǒng)研究的角度探索藥用植物的遺傳多樣性就存在很大的局限性,而從分子角度出發(fā)的分子標(biāo)記技術(shù)能有效地揭示物N進(jìn)化演變過程中遺傳物質(zhì)流動的真實(shí)本質(zhì),從而使得分子標(biāo)記技術(shù)能夠闡明物種進(jìn)化、遺傳背景以及種內(nèi)或種間遺傳關(guān)系,為中國珍貴及瀕危中藥材的開發(fā)、利用和資源保護(hù)提供真實(shí)依據(jù)。
近年來,隨著分子標(biāo)記技術(shù)的不斷應(yīng)用與發(fā)展,已有多種DNA標(biāo)記技術(shù)成功運(yùn)用于中藥材遺傳多樣性研究及親緣性分析中。YANG等[39]運(yùn)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對吉林省5個不同產(chǎn)地的人參材料進(jìn)行分析,得出不同產(chǎn)地的人參在遺傳物質(zhì)上呈現(xiàn)出較高的多態(tài)性。Li等[40]于2013年利用SSR標(biāo)記法對洋玉蘭葉綠體全基因組進(jìn)行近緣物種比對分析,結(jié)果顯示洋玉蘭葉綠體基因組的重復(fù)序列保守性相對較高。2014年,Galina等[41]又運(yùn)用SSR標(biāo)記技術(shù)對俄羅斯瀕臨滅絕的人參進(jìn)行了種群遺傳性狀的分析。朱田田等[42]利用ISSR對甘肅不同產(chǎn)地中麻黃的遺傳關(guān)系進(jìn)行了分析,得出中麻黃遺傳距離跟地理距離有一定的關(guān)系。黃穎楨等[43]通過使用ISS標(biāo)記技術(shù)對金線蓮遺傳多樣性進(jìn)行分析,得出在野生種質(zhì)資源間金線蓮具有豐富的遺傳多樣性。葉煒等[44]通過利用ISSR對金線蘭及其近緣物種的遺傳多樣性進(jìn)行研究,得出種群間可能存在基因的交流。唐曉清等[45]利用AFLP技術(shù)對不同農(nóng)家栽培類型的丹參進(jìn)行分析,結(jié)果表明AFLP技術(shù)可以作為識別丹參不同栽培類型間遺傳差異的手段。李勇等[46]利用AFLP技術(shù)通過對金蓮花遺傳多樣性的研究,得出地理位置較近的種質(zhì)遺傳相似度較高。唐美瓊等[47]利用AFLP技術(shù)對廣西草珊瑚遺傳性狀進(jìn)行研究分析,結(jié)果顯示廣西草珊瑚遺傳多樣性偏低,須盡快采取相應(yīng)措施。沈亮等[48]通過AFLP技術(shù)分析梭梭遺傳多態(tài)性得知該物種種內(nèi)豐度較高,各地區(qū)之間的分化較小。李永清等[49]通過ISSR在37份藥用石斛親緣關(guān)系研究中的應(yīng)用,得出ISSR分子標(biāo)記技術(shù)完全可以應(yīng)用于石斛物種親緣關(guān)系的分析。朱田田等[50]通過對不同黃芪和黨參栽培品種遺傳關(guān)系的ISSR分析,得出不同品種的黃芪和黨參擁有較高的遺傳多樣性,而且種間差異較大。蔣雨晗等[51]利用ISSR分子技術(shù)對14份不同來源的白芍進(jìn)行研究分析,證明了4個栽培種跟野生種之間有一定的遺傳差異性,而且可以從基因水平把外型相似的白芍栽培品種區(qū)別開來。
2.4 DNA遺傳圖譜的構(gòu)建及數(shù)量控制基因定位
DNA遺傳圖譜也稱基因遺傳圖譜或連鎖圖譜,系指基因在染色體上相對應(yīng)的位置。自從第一張遺傳圖譜的構(gòu)建以來,越來越多關(guān)于藥用植物DNA圖譜的構(gòu)建也相繼報道。周志勇等[52]首次用AFLP技術(shù)構(gòu)建了人參和西洋參的DNA指紋圖譜,這對人參的鑒別提供了非常有效的工具。虞泓等[53]利用AFLP對石斛4個內(nèi)種和1個外群種進(jìn)行DNA多態(tài)性分析,用篩選得到的引物構(gòu)建了5個種的DNA圖譜,并應(yīng)用bootstrap進(jìn)行了檢驗(yàn),該研究證明了AFLP標(biāo)記技術(shù)可用于構(gòu)建石斛基因組指紋圖譜。趙紅燕[54]則利用EST-SSR、ISSR、RAPD、SRAP等4種分子標(biāo)記技術(shù)成功構(gòu)建了浙江鐵皮石斛563個遺傳連鎖。鄭偉耀等[55]運(yùn)用SSR標(biāo)記天麻基因組DNA,分析得出擴(kuò)增位點(diǎn)與天麻素含量有關(guān)。巫桂芬等[56]通過黃麻基因DNA分子指紋圖譜的構(gòu)建,得出每一種被識別出的物種均有其特有的分子“身份證”。
3 展望
中國藥用植物種質(zhì)資源非常豐富,但是近年來由于氣候的變化以及過度的開采,使得一些稀少的野生藥材資源更是急劇減少,市場也相對混亂,因此從生物本質(zhì)出發(fā)的DNA分子標(biāo)記技術(shù)對于中國藥用植物的鑒定、保護(hù)、開采、利用及改造就顯得格外重要。目前,分子標(biāo)記技術(shù)在藥用植物中的研究主要體現(xiàn)在遺傳多樣性研究、種質(zhì)鑒別及評價、DNA指紋圖譜構(gòu)建以及基因定位幾個方面。
目前在藥用植物研究應(yīng)用中的DNA分子標(biāo)記技術(shù)尚存在以下幾個問題:DNA標(biāo)記技術(shù)在中藥材研究中的應(yīng)用較少,而且存在方向聚集現(xiàn)象,近年關(guān)于藥用植物親緣性的研究越來越多,然而在其他一些領(lǐng)域,如藥材活性成分分離與提取以及相關(guān)成分控制基因定位等方面的研究卻少有報道,研究范圍不夠全面和深入。另外,每一種分子標(biāo)記技術(shù)都有其各自的優(yōu)缺點(diǎn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一定片面性,而標(biāo)記技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用也處于相對空白狀態(tài);技術(shù)要求高,技術(shù)培訓(xùn)相對缺乏。因此,需要加大分子標(biāo)記技術(shù)的研究應(yīng)用,以便增加其在藥用植物研究中的實(shí)用性和可靠性,通過以不同分子技術(shù)的研究為基礎(chǔ),可達(dá)到明確中藥材有效藥用成分的基因構(gòu)成,以及各種藥用植物基因的調(diào)控原理及產(chǎn)物的靶向作用原理,以便對中國中藥品種的保護(hù)利用及產(chǎn)業(yè)化做出更大的貢獻(xiàn),以此實(shí)現(xiàn)中國中藥文化的規(guī)范化、產(chǎn)業(yè)化以及國際化。
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提要 尋找與高血壓以及血壓調(diào)節(jié)有關(guān)的基因,已成為當(dāng)前心血管領(lǐng)域的研究焦點(diǎn)之一,一些屬于單基因遺傳病的繼發(fā)性高血壓的致病基因已被識別。原發(fā)性高血壓是一種多基因遺傳病,其發(fā)病系遺傳與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果,這為高血壓易感基因研究帶來很大困難。迄今大多用候選基因法進(jìn)行高血壓相關(guān)基因研究。在人和動物模型的研究中,有關(guān)高血壓候選基因多態(tài)性的報道已有四十多種,但各家結(jié)果不一致。近年來用微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行全基因組掃描和連鎖分析,它已成功地用于多基因病相關(guān)基因的定位克隆研究。應(yīng)用該技術(shù)對原發(fā)性高血壓易感基因的定位研究正在進(jìn)行中。
Gene studies in hypertension:State-of-art
Abstract The search for genes influencing blood pressure or hypertension has become one of the focal point of cardiovascular research. A few disease genes causing secondly hypertension,as a result of a single gene defect, have been identified. However,essential hypertension is a polygenic disease and both genetic and environmental factors play important roles in its development. This fact makes the identification of its susceptibility genes more difficult. So far most studies to reveal the genes related to essential hypertension have employed a candidate gene approach.Using this strategy,the associations between polymorphisms of over forty genes with essential hypertension have been reported in human or in animal models.However,the results are not consistent .Recently,a genome-wide scan and linkage analysis using microsatellite markers becomes a useful approach in the positional cloning of genes in polygenic diseases.Its application for mapping susceptibility genes of hypertension is ongoing.
Key words essential hypertension;gene;candidate gene approach;genome-wide scan
和平利用原子能、登月和人類基因組計(jì)劃(HGP)是本世紀(jì)最重要的三大科技成就。1990年啟動的美國HGP的研究目標(biāo)是在2005年最終闡明人類基因組DNA的全序列、發(fā)現(xiàn)所有人類基因、完成它們在染色體上的定位。目前人類基因組遺傳圖和物理圖已經(jīng)完成,大規(guī)模測序技術(shù)和生物信息學(xué)獲得迅速發(fā)展,提前達(dá)到HGP研究目標(biāo)已成定局。在“結(jié)構(gòu)基因組學(xué)”獲得巨大進(jìn)展的推動下,一個以破譯基因功能信息為目標(biāo)的“功能基因組學(xué)”已應(yīng)運(yùn)而生。為應(yīng)對激烈的國際競爭和日新月異的科技進(jìn)步,我國科學(xué)家率先提出了“疾病基因組學(xué)”這一新概念,從而確立了我國人類基因組研究的重點(diǎn)和特色。在“863”計(jì)劃等相關(guān)項(xiàng)目的研究基礎(chǔ)上,集合了國內(nèi)一批一流研究單位,一項(xiàng)以創(chuàng)立“疾病基因組學(xué)”理論和技術(shù)體系為目標(biāo)和“國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃”研究項(xiàng)目,已于今年初正式啟動,這標(biāo)志著我國疾病基因研究已經(jīng)跨入積極參與大規(guī)模國際競爭的時代。
1 繼發(fā)性高血壓基因研究現(xiàn)狀與展望
在高血壓基因研究方面,迄今已有10多種屬于單基因遺傳病性質(zhì)的繼發(fā)性高血壓的致病基因已被定位或克隆。它們是:與腎上腺皮質(zhì)激素代謝有關(guān)的基因:如醛固酮合成酶基因與11β羥化酶基因形成嵌合基因,導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素可抑制性醛固酮增多癥;與離子轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的基因:如已查明Liddle綜合征系上皮細(xì)胞鈉通道β.γ亞單位突變所致;一些因兒茶酚胺產(chǎn)生過量導(dǎo)致高血壓的常染色體顯性遺傳疾病,它們的致病基因已被識別。此外,某此類型的多囊腎致病基因也已被定位。需要指出單基因性質(zhì)的高血壓基因研究
并未結(jié)束,可能還有一些尚未認(rèn)識的新病種有待發(fā)掘,如在土耳其發(fā)現(xiàn)一種以嚴(yán)重高血壓伴短指畸形為特征的常染色體顯性遺傳病,新近其基因已被定位。此外,闡明致病基因在高血壓發(fā)病中的分子生物學(xué)和病理生理機(jī)制、探索基因治療等方面有待進(jìn)一步研究。
2 原發(fā)性高血壓基因研究現(xiàn)狀與展望
單基因病致病基因的識別,猶如池塘中的魚已釣一個少一個;而多基因病易感基因卻似深海中的魚,若隱若現(xiàn)、深不可測。當(dāng)前疾病基因的研究重點(diǎn)從單基因病轉(zhuǎn)向多基因病已成趨勢,但難度也越來越大。原發(fā)性高血壓(EHT)是一多基因遺傳病,其發(fā)病率高、危害性大、家系樣本收集相對比較容易,因此已成為當(dāng)前多基因病研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。
EHT發(fā)病是遺傳因素與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果,一般認(rèn)為,人群中血壓變異的30%~60%是由遺傳因素決定的。遺傳因素賦予個體對于EHT的易感程度,因此與EHT發(fā)病相關(guān)的基因稱為易感基因而不是致病基因。
自90年代起識別EHT相關(guān)基因的研究開展得十分活躍,目前最常用的方法為候選基因法,其基本策略和步驟為:以參與血壓調(diào)節(jié)機(jī)制的蛋白為對象,確定候選基因;進(jìn)行遺傳連鎖分析,確定該候選基因座位與高血壓是否連鎖;篩查該候選基因的各種突變體;基因多態(tài)性與高血壓間的關(guān)聯(lián)研究,以確定該基因突變體是否與EHT相關(guān)。相關(guān)基因識別后到最終確定為EHT易感基因還有很多工作要做。
在已研究過的所有EHT候選基因中,以血管緊張素原(AGT)基因的研究最為深入。多數(shù)報道指出AGT基因與EHT相連鎖,不少研究發(fā)現(xiàn)AGT基因的M235T變異體(即基因突變導(dǎo)致AGT第235號氨基酸由甲硫氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸)與高血壓相關(guān)聯(lián),235T純合個體的血漿AGT水平顯著高于235M純合個體。但也有一些研究無法證實(shí)AGT基因M235T多態(tài)性與高血壓有關(guān)。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)基因存在插入型(Insertion,I)或缺失型(Deletion,D)多態(tài)性。目前一般認(rèn)為ACE基因這一多態(tài)性與高血壓關(guān)系不大,但似與心、腦、腎等靶器官損害有關(guān)。盡管薈萃分析結(jié)果支持這一觀點(diǎn),但ACE基因的DD基因型是否為心腦血管病的危險因子,需待前瞻性研究加以證實(shí)。一組意大利學(xué)者對α-adducin基因與高血壓關(guān)系進(jìn)行過系列研究,提出α-adducin基因突變是鹽敏感性高血壓的遺傳基礎(chǔ)之一,從而引起廣泛重視,但目前多數(shù)報道不能證實(shí)這一結(jié)果。目前已經(jīng)研究過的EHT候選基因不下四、五十個,不能一一介紹。但迄今為止用這一方法未能肯定哪個基因與EHT相關(guān)。盡管如此EHT候選基因?qū)ο笕栽跀U(kuò)大,對于已研究過的候選基因?qū)ふ倚碌淖儺愺w,并探索它們與EHT間的關(guān)系還將繼續(xù)。另一方面,候選基因多態(tài)性的民族和地區(qū)差異的研究,尤其對于基因多態(tài)性分型用于指導(dǎo)臨床的可能性探討正越來越受到重視。
近年來應(yīng)用微衛(wèi)星引物進(jìn)行基因組掃描的技術(shù)已經(jīng)成熟,多色熒光標(biāo)記的微衛(wèi)星DNA引物已經(jīng)商品化。用300多對覆蓋整個基因組的微衛(wèi)星引物,選擇大樣本的EHT家系或同胞對進(jìn)行連鎖分析,有可能將EHT相關(guān)基因位點(diǎn)定位到某一染色體區(qū)域內(nèi),分辨率可達(dá)10cM。進(jìn)一步用區(qū)域內(nèi)DNA多態(tài)標(biāo)記進(jìn)行精細(xì)定位,如能將范圍縮小到1cM以內(nèi),便可直接大規(guī)模DNA測序,分離并克隆出EHT相關(guān)基因。全基因組掃描的應(yīng)用,在個別多基因遺傳病基因定位中已有成功報道。目前國內(nèi)外一些實(shí)驗(yàn)室正采用此技術(shù)進(jìn)行EHT相關(guān)基因的染色體定位研究,但迄今尚未見正式報道。
患者對藥物的反應(yīng)、藥物副作用以及藥物在體內(nèi)的代謝,都存在明顯的個體差異,這種差異都有一定的遺傳背景。如能在基因水平上闡明有關(guān)機(jī)制,將有可能通過檢測某個或某一組基因的多態(tài)性,預(yù)測藥物療效、減輕甚至避免副作用。“藥物基因組學(xué)”的出現(xiàn)為實(shí)現(xiàn)高血壓個體化治療帶來了希望。
橄欖(CanariumalbumL.)為橄欖科(Burseraceae)橄欖屬植物,是中國南方特有的亞熱帶水果。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),目前在我國主要分布和種植的橄欖品種(系)共180多個[1-2],其中廣東有80多個,福建有70多個,四川、浙江、廣西和云南也有少量分布。粵東地區(qū)作為橄欖的主產(chǎn)區(qū)至今仍保存著眾多優(yōu)質(zhì)橄欖資源。但是,由于農(nóng)業(yè)栽培的選擇性種植以及粗放的管理模式,導(dǎo)致橄欖的遺傳多樣性正在遭受破壞。因此,亟待利用現(xiàn)代科學(xué)方法對橄欖遺傳多樣性進(jìn)行保護(hù)。遺傳資源的數(shù)量是相關(guān)育種和研究的基礎(chǔ),然而大量的遺傳資源也給種質(zhì)資源的研究、保存和開發(fā)利用帶來困難。1984年Frankel[3-4]提出核心種質(zhì)(Corecollection)的概念,為種質(zhì)資源保存和研究開創(chuàng)了新的方向。目前,國內(nèi)外對核心種質(zhì)構(gòu)建方法的研究多是依據(jù)表型形狀或農(nóng)藝形狀[5-6]。目前,以分子標(biāo)記數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)構(gòu)建核心種質(zhì)的研究也有一些報道[7-16],但仍然不夠深入。通常核心種質(zhì)的構(gòu)建是根據(jù)一定的原則將相似的種質(zhì)材料歸為一組,再以一定的取樣策略選擇優(yōu)先保存的種質(zhì)材料構(gòu)成核心種質(zhì)。胡晉等[17]提出了多次聚類的核心種質(zhì)構(gòu)建方法,其優(yōu)點(diǎn)是能保存原有種質(zhì)的遺傳變異模式。該方法是依據(jù)聚類結(jié)果,隨機(jī)選取最低分類水平內(nèi)的一個種質(zhì)材料進(jìn)入下一輪聚類分析,如組內(nèi)只有一份材料,則直接進(jìn)入下一輪聚類分析;對剩余的材料再次聚類、取樣,直至所取種質(zhì)材料量達(dá)到設(shè)定的要求,即構(gòu)成核心種質(zhì)。此方法已用于山茱萸(Cornusofficinalis)[13]和柚類(Citrussp.)[18]等的核心種質(zhì)構(gòu)建。橄欖作為我國南方的特色植物資源,一直以來缺乏相應(yīng)的研究。雖然目前在廣東和福建均建有種質(zhì)資源苗圃,但以資源收集為主,還未有核心種質(zhì)構(gòu)建的研究報道。本研究主要探討利用分子標(biāo)記數(shù)據(jù)構(gòu)建橄欖核心種質(zhì)的取樣方案,從而為橄欖種質(zhì)資源的保存、管理和開發(fā)利用提供指導(dǎo),也可為其它地方特色植物種質(zhì)資源的研究提供借鑒。
1材料和方法
1.1材料和處理供試的64份橄欖(CanariumalbumL.)種質(zhì)材料分別來自廣東省東部地區(qū)的汕頭市、潮州市、揭陽市和梅州市(表1)。ISSR-PCR反應(yīng)體系為前期優(yōu)化的20μL反應(yīng)體系,包括2μL10×PCRbuffer,Mg2+3.0mmol/L,dNTP0.225mmol/L,TaqDNA聚合酶1U,模板DNA80ng和引物0.25μmol/L。擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性4min;每個循環(huán)94℃變性1min,49℃退火1min,72℃延伸1.5min,30個循環(huán);72℃延伸8min;于4℃保存[19]。從48個ISSR引物中篩選8個多態(tài)性強(qiáng)、重復(fù)性好的引物,對64份材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增,對擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜進(jìn)行0或1計(jì)數(shù)獲得ISSR分子標(biāo)記數(shù)據(jù)。
1.2橄欖核心種質(zhì)構(gòu)建方法利用ISSR分析數(shù)據(jù),分別依據(jù)Nei&Li和SM計(jì)算遺傳距離,采用UPGMA法進(jìn)行聚類分析。根據(jù)聚類分析結(jié)果,在不同分組的情況下采用多次聚類隨機(jī)取樣法構(gòu)建核心種質(zhì)。具體方法為:采用P策略(proportionalstrategy)、L策略(logarithmicstrategy)、S策略(squarerootstrategy)和G策略(geneticdiversitydependentstrategy)等取樣策略確定各個分類亞組的取樣比例[20];組內(nèi)取樣利用多次聚類隨機(jī)取樣的方法逐步刪減達(dá)到目標(biāo)數(shù)量;如果組內(nèi)僅有1份材料,直接選取構(gòu)成核心種質(zhì)。依據(jù)上述方法共確定8種取樣方案,代號分別為:P-SM、L-SM、S-SM、G-SM、P-Nei&Li、L-Nei&Li、S-Nei&Li、G-Nei&Li;每種方案分別抽取32、29、26、23、19、16、13、10和6個樣品組成樣品群,并比較各個樣品群的遺傳多樣性指數(shù)。
1.3橄欖樣品群數(shù)據(jù)分析利用各個樣品群的原始數(shù)據(jù),通過PopGen32軟件計(jì)算各樣品群的觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei's遺傳多樣性指數(shù)(H)、Shannon's信息指數(shù)(I)、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)和多態(tài)性位點(diǎn)百分率等遺傳多樣性參數(shù),并利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對相應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn),進(jìn)而對其代表性進(jìn)行檢驗(yàn)。
2結(jié)果和分析
2.1樣品群遺傳多樣性比較分析比較各樣品群的遺傳多樣性指數(shù),從圖1可見,不同取樣策略獲取的樣品群,其觀測等位基因數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)和多態(tài)性比率等指數(shù)均隨取樣量的減少呈遞減趨勢(圖1:A、B、C)。然而Ne、H、I等基本上是隨取樣量的減少先上升后下降(圖1:D、E、F),且它們的最大值一般都出現(xiàn)在樣品數(shù)為16或13時??紤]到取樣量問題,應(yīng)將16份樣品作為核心種質(zhì)的取樣量,不同取樣方案所篩選的核心種質(zhì)如表2所示。同時,結(jié)果也表明以Nei&Li法計(jì)算遺傳距離并采用G策略取樣,在樣品數(shù)為16時上述3個指數(shù)均為所有取樣方案的最大值(表3)。因此,將該方法獲得的16份材料:果樹所1號、果樹所4號、馬崗3號、黃都、青皮、雞心、三棱Ⅰ、甜種、小黃仔、細(xì)粒、普寧甜種欖、鐵節(jié)欖、鹽埕赤欖、麒麟納種、車酸1號、東聯(lián)香欖確定為粵東橄欖種質(zhì)資源的核心種質(zhì)。
2.2初始種質(zhì)與核心種質(zhì)的比較從表4可看出,該核心種質(zhì)保留了初始種質(zhì)25%的樣品,核心種質(zhì)的多態(tài)性位點(diǎn)和多態(tài)性位點(diǎn)百分率保留率分別達(dá)到了92.93%和98.31%,而觀測Na、Ne、H、I等的保留率分別為99.26%、102.56%、107.39%、106.29%。這說明該種質(zhì)庫最大量的保存了原有種質(zhì)庫的基因資源。利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對初始種質(zhì)和核心種質(zhì)的Ne、H、I分別作t檢驗(yàn),結(jié)果見表5。由t檢驗(yàn)結(jié)果可知,上述遺傳多樣性指數(shù)核心種質(zhì)與初始種質(zhì)均未有顯著性差異,因此核心種質(zhì)能很好的代表初始種質(zhì)。
2.3核心種質(zhì)與保留種質(zhì)的比較保留種質(zhì)是指除去核心種質(zhì)之后剩下的種質(zhì)資源,可以作為核心種質(zhì)的后備資源。利用PopGen32軟件計(jì)算保留種質(zhì)的各項(xiàng)遺傳多樣性參數(shù)并與核心種質(zhì)進(jìn)行比較,結(jié)果見表6和表7。可以看出,保留種質(zhì)除了種質(zhì)數(shù)量以及多態(tài)性位點(diǎn)外,Na、Ne、H、I、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)和多態(tài)性位點(diǎn)百分率等均小于核心種質(zhì)。此外,保留種質(zhì)的Ne、H、I等指數(shù)和核心種質(zhì)的并沒有顯著差異。因此,雖然本研究中篩選出的核心種質(zhì)可以有效地代表原有種質(zhì),但是依然不可忽視保留種質(zhì),當(dāng)核心種質(zhì)中無法獲得所需性狀時,可以從保留種質(zhì)中篩選。
3討論
3.1核心種質(zhì)的有效性核心種質(zhì)的有效性,是指核心種質(zhì)代表原種質(zhì)資源遺傳多樣性的程度或者是要選擇具有代表性、異質(zhì)性和多樣性的樣品構(gòu)建核心種質(zhì)。本研究中構(gòu)成核心種質(zhì)的16份材料中有7份來自潮州,5份來自揭陽,3份來自汕頭和1份來自梅州,表明材料能較好地代表粵東地區(qū)橄欖品種資源的地域分布。同時,構(gòu)成核心種質(zhì)的材料按照果實(shí)用途可分為鮮食類型(馬崗3號、青皮、三棱Ⅰ、甜種、麒麟納種、車酸1號、東聯(lián)香欖、普寧甜種欖)、加工類型(果樹所1號、果樹所4號、雞心、細(xì)粒、鐵節(jié)欖、鹽埕赤欖、小黃仔)和鮮食兼加工類型(黃都)。核心種質(zhì)與初始種質(zhì)的有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei's遺傳多樣性指數(shù)(H)、Shannon's信息指數(shù)(I)等遺傳指數(shù)經(jīng)t檢驗(yàn)均差異不顯著。并且,核心種質(zhì)的Ne、H、I均高于初始種質(zhì)和保留種質(zhì),因此該核心種質(zhì)較好地保留了原有種質(zhì)資源的遺傳多樣性。
1基因突變與健康
一個基因內(nèi)部可遺傳的結(jié)構(gòu)的改變稱為基因突變或基因變異(gene mutation)或更廣的概念基因損傷(gene damage)。人類基因組中的變異有許多類型,主要有:單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)重復(fù)序列的不同數(shù)目和基因結(jié)構(gòu)的交替[1],DN段范圍從千堿基(kilobases,Kb)至百萬堿基(megabases,Mb)規(guī)模的一類豐富的亞微觀變異,DN段的缺失(delations)、嵌入(insertions)、復(fù)制(duplicaltion)和復(fù)合多位點(diǎn)變異(complex multisite variation)即拷貝數(shù)變異(copy number variation,CNVs )或拷貝數(shù)多態(tài)性(copy number poly morphismsm,CNPs)等[2,3]。
基因的突變和各類基因變異將影響健康,甚至誘發(fā)相關(guān)的疾病如早衰、局部出血、老年癡呆癥及癌癥等,所以,基因突變和基因損傷與健康和疾病密切相關(guān)。
2氧化應(yīng)激及其對基因變異和健康的影響
在人類生活過程中,紫外線、電離輻射,環(huán)境、水和食品污染,亞硝酸鹽和亞硝胺,代謝產(chǎn)生的活性物質(zhì)如活性氧(reactive oxygen species,ROS)等易引起基因突變或損傷,從而有害健康。
對紫外線、電離輻射,環(huán)境、水、食品污染以及亞硝酸鹽和亞硝胺等可以從生活方式和飲食中加以避免,而代謝產(chǎn)生的ROS則難以避免?,F(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究表明,代謝產(chǎn)生的ROS包括超氧自由基(Oˉ)、羥自由基(OHˉ)、脂質(zhì)過氧化自由基(ROOˉ)等,過量ROS導(dǎo)致氧化應(yīng)激(oxygen stress),是造成基因突變或損傷的重要因素之一[4]。
3個性化健康食譜
2000年提出的新的營養(yǎng)理論――基因營養(yǎng)學(xué),從基因的分子水平選擇健康食品制定食譜補(bǔ)充特定的營養(yǎng)成分,以彌補(bǔ)由于基因突變或損傷造成對健康的影響,有的還可能防止基因突變或損傷,提高有關(guān)基因的活性,促進(jìn)健康[5]。
亞健康是國際醫(yī)學(xué)界20世紀(jì)80年代后期的醫(yī)學(xué)新思維,消除亞健康是世界衛(wèi)生組織(WHO)的一項(xiàng)預(yù)防性的健康策略,也是21世紀(jì)醫(yī)學(xué)與健康的熱點(diǎn)之一。進(jìn)入21世紀(jì)以來,隨著基因營養(yǎng)學(xué)的發(fā)展,對消除亞健康有了更新的認(rèn)識。
個性化健康食譜是針對易患某種疾病人群的預(yù)防或某病患者康復(fù)的個性化基因營養(yǎng)食譜。
對亞健康的中老年人群和防止有關(guān)基因由于氧化應(yīng)激所致的突變或損傷的體弱人群,擬選擇或多食用富含抗氧化活性成分的食物。蔬菜如:藕、油菜、豇豆、菠菜、花椰菜(西蘭花)、番茄、胡蘿卜、卷心菜等;水果如:山楂、冬棗、番石榴、獼猴桃、葡萄、草莓、青皮橘子、橙、紅蕉蘋果及菠蘿等。此外,可以適當(dāng)補(bǔ)充服用可強(qiáng)力清除活性氧自由基的健康飲食補(bǔ)充劑,如含原花青素(procyanidins)及白藜蘆醇(resveratrol)等成分的葡萄皮及籽的提取物,番茄紅素(lycopene)等。
對防止基因變異導(dǎo)致的老年癡呆癥或癡呆癥患者,可以促進(jìn)腦細(xì)胞代謝的,營養(yǎng)食譜主要有:(1)首烏粥何首烏50 g洗凈水煮煎,去渣取濃汁與洗凈的大米加水煮粥;(2)蘑菇鵪鶉蛋;(3)蒸青魚。應(yīng)多食用富含大豆磷脂和葉酸的食物。研究表明:葉酸缺乏引起血漿中的高半胱氨酸水平升高導(dǎo)致腦內(nèi)β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積,補(bǔ)充富含葉酸的食物如紅莧菜、菠菜、蘆筍、花椰菜等,可降低高半胱氨酸水平,防止老年癡呆或延緩老年癡呆的發(fā)展。同時應(yīng)適當(dāng)食用含有神經(jīng)營養(yǎng)成分的猴頭菇,其活性成分可以刺激神經(jīng)生長因子(NGF)的合成和分泌[5]。已經(jīng)證實(shí)NGF不僅是腦正常發(fā)育所必需的,也是腦的保養(yǎng)和功能所需,NGF有可能具有中止各種進(jìn)行性癡呆癥甚至逆轉(zhuǎn)認(rèn)知功能下降的作用[6] 。
帕金森?。≒arkinsom’s disease,PD)患者的營養(yǎng)食譜主要有:銀耳蓮子湯(適用于震顫伴隨低熱、口干、消瘦患者)、紅棗糯米粥(適用于震顫伴隨便泌、肢體乏力的患者)和桂圓赤豆飲(適用于震顫兼貧血、心悸、多夢的患者)。
近年來對于PD的病因雖然已有了新的發(fā)現(xiàn)[7],但目前尚無預(yù)防良策。2008年芬蘭赫爾辛基國家公共衛(wèi)生研究所科學(xué)家們在《神經(jīng)病學(xué)》上報道了他們的一項(xiàng)研究成果:年齡在24~54歲的人,高膽固醇水平的人群會增加患PD的風(fēng)險,患PD的可能性會增加86%。所以,補(bǔ)充富含降血脂降膽固醇活性成分的水果,如富含金絲桃苷的山楂、富含維生素C及果膠的草莓和紅蘋果,不但可預(yù)防心腦血管疾病而且可以降低患PD的風(fēng)險。
胃癌患者的營養(yǎng)食譜主要有:陳皮肉末粥。將陳皮小棗煮粥至熟,去陳皮加入瘦肉末,煮爛即可食用,可通氣,健脾,適合于腹部脹痛和嘔吐癥狀的患者。乳腺癌患者可食用蘑菇小米粥。對于癌癥預(yù)防的基因營養(yǎng)擬多食用富含抗氧化活性成分的蔬菜和水果。
近年來隨著人們生活水平的提高和基因營養(yǎng)學(xué)的深入研究,個性化基因營養(yǎng)的健康飲食受到了越來越多人的重視。我們相信,對生命過程的不同階段和不同個人具有特定生物效應(yīng)的健康飲食的發(fā)展,將使醫(yī)學(xué)保健提高到一個新的水平。
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關(guān)鍵詞:遺傳標(biāo)記 遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn) SSR 棗樹 分子遺傳
Application and practice of SSR marker in the teaching of genetics experiment
Pang Xiaoming, Li Yingyue
Beijing forestry university, Beijing, 100083, China
Abstract: The well-designed experiment is a successful case of making full use of scientific research achievements in the teaching of genetic experiment, which includes the experiment of DNA fingerprinting construction and paternity analysis of the seedlings. Through the experiment, the students will have the experience of PCR technology, DNA isolation and the separation of DNA by different methods. Furthermore, the involvement in the experiment will help to strengthen several important concepts in the genetics including gene locus/allele, heterozygosity/homozygosity, diploid/triploid, the Mendelian inheritance laws and DNA fingerprinting etc. Taken together, the experiment will be important to invoke the interest to learn the course for the students.
Key words: genetic marker; genetic experiment; SSR; jujube; molecular genetics
“DNA指紋”是指可以利用DNA差異來進(jìn)行與傳統(tǒng)指紋相似的個體身份識別。DNA指紋是以DNA的多態(tài)性為基礎(chǔ)。SSR(Simple sequence repeat,簡單重復(fù)序列),又稱微衛(wèi)星DNA,一般是由2~6個核苷酸堿基組成的基序并串聯(lián)而成的DNA序列,在真核生物基因組中廣泛存在。SSR標(biāo)記具有多態(tài)性高、實(shí)驗(yàn)操作簡單、穩(wěn)定性好、可重復(fù)性高、對DNA模板質(zhì)量和數(shù)量要求均較低的共顯性標(biāo)記,現(xiàn)廣泛應(yīng)用于親本分析、遺傳多樣性研究、指紋圖譜和遺傳圖譜構(gòu)建等方面,是一種目前發(fā)展較為成熟的分子標(biāo)記技術(shù)[1]。
在植物的遺傳及育種試驗(yàn)和實(shí)踐中(如實(shí)生選種中),獲得的子代苗母本來源是確切知道的,但經(jīng)常缺乏父本信息。利用共顯性分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合統(tǒng)計(jì)分析方法可以幫助我們尋找可能的父本來源。父本分析(Paternity analysis)對了解群體間或世代間的基因流動及性別選擇適合度有重要的理論意義[2]。SSR的高分辨力及其共顯性遺傳特點(diǎn)使其成為雜交種親本鑒定使用最多的標(biāo)記。
常用的父本分析方法包括排除分析法、最大似然性分析法和父性拆分法等,在植物群體中利用親本排除法進(jìn)行父本分析的例子較多[2]。排除分析法根據(jù)孟德爾遺傳規(guī)律檢測母本與可疑父本基因型組合能否產(chǎn)生子代基因型,否則排除相應(yīng)可疑父本。另外,也可以利用軟件Cervus 3.0進(jìn)行分析。Cervus 3.0是一款使用共顯性標(biāo)記的軟件,是Marshall于1998年開發(fā)的,這款軟件可以鑒定單親本未知或雙親本未知的情況,基于最大似然法進(jìn)行親本分析,通過等位基因頻率來計(jì)算各個非排除父本作為親生父本的概率,進(jìn)而確定最大可能的父本。用LOD值來進(jìn)行結(jié)果分析。由于便于操作,是目前最普遍應(yīng)用的親本分析軟件[3]。
該實(shí)驗(yàn)是體現(xiàn)遺傳學(xué)原理和技術(shù)在生產(chǎn)和生活中應(yīng)用的例子,可達(dá)到鞏固和學(xué)習(xí)如下重要知識點(diǎn)的目的:(1)通過提取棗樹DNA,熟悉植物DNA的提取步驟;(2)鞏固分離定律和自由組合定律的學(xué)習(xí);(3)鞏固PCR技術(shù)原理;(4)通過SSR標(biāo)記的檢測,掌握SSR標(biāo)記的原理、檢測技術(shù)和應(yīng)用;(5)通過二倍體和多倍體基因型差異,鞏固復(fù)等位基因和基因座等概念;(6)學(xué)習(xí)利用SSR標(biāo)記進(jìn)行親子鑒定的原理和技術(shù)。學(xué)生通過實(shí)驗(yàn)了解到遺傳學(xué)技術(shù)和理論知識可解決生產(chǎn)生活中的具體問題,可有效調(diào)動學(xué)生學(xué)習(xí)遺傳學(xué)知識和技術(shù)的興趣和熱情,有助于消除科學(xué)研究高不可攀的心理,激發(fā)學(xué)生對基本實(shí)驗(yàn)和科學(xué)研究的興趣,增強(qiáng)學(xué)生分析問題和解決問題的能力。
1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
冬棗、映山紅、贊皇大棗(3n)、梨棗、柿餅棗和辣椒棗及6個不同的雜交后代基因型(已知母本為冬棗,假定父本未知)共12個基因型的植物材料。
1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
PCR MIX(北京博邁德科技發(fā)展有限公司),6~8對SSR引物,瓊脂糖,DNA分子量標(biāo)準(zhǔn),ddH2O,溴酚藍(lán)加樣緩沖液,5×TBE濃貯液〔稱取27.5 g硼酸與54 g Tris堿,稱量20 ml EDTA(0.5 mol/L),加入蒸餾水定容至1 000 mL,待溶解后室溫保存待用〕,使用時稀釋為0.5×TBE,Goldviewer II(染液)等。
2 實(shí)驗(yàn)方法
2.1 實(shí)驗(yàn)儀器
微量移液器,小型離心機(jī),恒溫水浴鍋,PCR儀,電泳儀,紫外透射儀,照相機(jī)或(國產(chǎn)凝膠成像系統(tǒng)),槍頭和離心管(使用前高溫滅菌)。
2.2 實(shí)驗(yàn)步驟
(1)DNA提?。簭奈倚?shí)驗(yàn)苗圃采集各植物材料葉片,對各樣品進(jìn)行準(zhǔn)確編號記錄,應(yīng)用CTAB法或試劑盒法提取總DNA。
(2)DNA質(zhì)量檢測:取5μL DNA樣品混合1μL 6×Loading Buffer,用0.5×TBE液配制0.8%瓊脂糖凝膠對總DNA進(jìn)行電泳質(zhì)量檢測;取3 μLDNA樣品液,在超微量紫外分光光度計(jì)上測量其DNA含量(μg/mL)、A260 nm/A280 nm的值及其在260 nm處的吸收峰,檢測DNA的純度,對DNA進(jìn)行稀釋,直至工作濃度10 ng/μL。
(3)SSR-PCR擴(kuò)增:應(yīng)用6對SSR引物(見表1)進(jìn)行PCR反應(yīng)[4],引物由北京金唯智生物公司合成。熒光引物為M13(-21)-ROX:TGTAAA ACGACGGCCAGT。
表1 SSR引物信息表
20.0 μL PCR反應(yīng)體系包括:2×PCR MIX(10 μL)、DNA模板(1.0 μL),1?M上游引物(1.0 ul),1?M下游引物(1.0 μL)和ddH2O(7.0 μL)。如果采用毛細(xì)管測序電泳檢測,則體系中加入1 ?M的M13引物3.2 μL。按上述體系混合好后,PCR程序設(shè)置如下:94℃ 5min;94℃ 30s-55℃(相應(yīng)退火溫度)30s-72℃ 45s,30個循環(huán);94℃ 30s-53℃ 30s-72℃ 30s,8個循環(huán);72℃ 10min;4℃ forever。
(4)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測:擴(kuò)增結(jié)果按照公司提供的手冊進(jìn)行ABI Prism 3730XL型測序儀測序檢測,所得數(shù)據(jù)利用GeneMarker V1.75軟件進(jìn)行讀取?;蛘卟捎?%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測:用1×TBE液配制70 mL+3.5 μL Goldviewer II;每管加入5 μL溴酚藍(lán)上樣緩沖液,瞬時離心取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物上樣;穩(wěn)壓100V,電泳1~1.5 h;UVP凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并拍照。
2.3 分析結(jié)果
圖示各品種的基因型,計(jì)算相關(guān)指標(biāo)或采用軟件分析確定子代的未知父本;當(dāng)用于檢驗(yàn)的位點(diǎn)間非連鎖遺傳時,每一個位點(diǎn)可以計(jì)算出一個父權(quán)指數(shù)PI(paternity index)值(疑似父親獲得父權(quán)的可能性與失去父權(quán)可能性的比值,也稱為非父排除率),多位點(diǎn)的累積PI值(CPI)等于各位點(diǎn)PI值的乘積,計(jì)算公式為:CPI=PI1×PI2×PI3×…×PIn(1,2,3…n代表第1,2,3…n個位點(diǎn)的PI值)。由PI值得到的相對親權(quán)概率RCP=[CPI/(CPI+1)]×100%≥99.73%時,可認(rèn)為疑似親本得到父權(quán),RCP
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
微衛(wèi)星位點(diǎn)BFU0277的基因分型峰圖如圖1所示。分型結(jié)果理想,可以較為準(zhǔn)確地判斷等位基因大小。由圖1可知贊皇大棗含三等位基因,驗(yàn)證的基三倍體的特點(diǎn),其余樣品為二倍體。二倍體樣品中除梨棗是純合體以外,其他樣品為雜合體。對除贊皇大棗以外的其他個體共分析了8對SSR引物,每個個體的基因型見表2。從表2可以看出,11個個體在這8個基因座的基因型是不一樣的,這也構(gòu)成了區(qū)分這11個樣品的SSR指紋圖譜。
圖1 12個樣品在BFU0277號引物中的毛細(xì)管電泳檢測圖
表2 11個樣品在8個基因座的SSR基因型
子代1~5的母本為冬棗,通過排除分析法,子代1~4不可能以柿餅棗、辣椒棗或梨棗為父本,因?yàn)镾SR等位基因遺傳違反孟德爾遺傳規(guī)律,子代出現(xiàn)與這幾個疑似親本完全不同的等位基因位點(diǎn),排除它們之間有親緣關(guān)系。而映山紅不能排除為父本。按照方法中所述公式計(jì)算CPI和RCP,結(jié)果見表3,可推測映山紅為子代1~4的父本。對于子代5,所有的可能父本都被排除,因此在供選材料中沒有子代5的父本。而子代6為雙親都未知的個體,通過排除法發(fā)現(xiàn),供選親本中沒有合適的樣本可能為其父母本。
表3 4個子代的父本分析指標(biāo)
由Cervus 3.0軟件分析發(fā)現(xiàn),子代1~4的父本為映山紅的LOD值見表3,4個LOD值都大于零,與RCP計(jì)算結(jié)果相一致。對于子代5,所有的可能父本的LOD值都為負(fù)值;對于子代6,各種父母本組合的LOD值均為負(fù)值。因此,與排除法所得的結(jié)果相一致,疑似親本中沒有這兩個個體的父(母)本。
4 結(jié)束語
本實(shí)驗(yàn)為基于課題組最新的科學(xué)研究成果設(shè)計(jì)成的學(xué)生容易操作的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,把與實(shí)踐掛鉤的親子鑒定內(nèi)容設(shè)計(jì)到實(shí)驗(yàn)中,可以增加學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣[6]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們看到,本實(shí)驗(yàn)涉及基因位點(diǎn)/等位基因、純合體/雜合體、二倍體/三倍體、孟德爾遺傳規(guī)律和DNA指紋圖譜等多個(對)重要的遺傳學(xué)概念,使學(xué)生能形象地掌握相關(guān)概念。
根據(jù)學(xué)生專業(yè)和課時長短的不同,教師可以對實(shí)驗(yàn)內(nèi)容有選擇地進(jìn)行。生物科學(xué)和技術(shù)類專業(yè)課時較長,可以選擇用常規(guī)的CTAB方法進(jìn)行DNA提?。欢r(nóng)業(yè)和林業(yè)等應(yīng)用性專業(yè)學(xué)時相對較短,可采用試劑盒進(jìn)行DNA提取,以節(jié)省時間。如果時間和實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)允許,SSR的產(chǎn)物檢測可采用毛細(xì)管電泳的方法。而凝膠電泳的方法相對便宜,時間短,而且可以更好地鍛煉學(xué)生的動手操作能力,有利于學(xué)生在實(shí)驗(yàn)過程中自信心的培養(yǎng)。
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【摘要】
介紹了數(shù)據(jù)挖掘的意義和任務(wù),綜述了近幾年來數(shù)據(jù)挖掘在中醫(yī)各領(lǐng)域中的應(yīng)用,分析了目前存在的問題,并探討了今后的發(fā)展趨勢。
【關(guān)鍵詞】 數(shù)據(jù)挖掘 中醫(yī)
隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)和網(wǎng)絡(luò)技術(shù)的快速發(fā)展,在中醫(yī)藥的現(xiàn)代化過程中建立了很多的數(shù)據(jù)庫。堆積在數(shù)據(jù)庫中的信息呈超指數(shù)爆炸式增長。例如中醫(yī)藥科技信息數(shù)據(jù)庫就有50個子數(shù)據(jù)庫、110個表單及數(shù)百個自動生成的中間表、800余個著錄項(xiàng)目,涵蓋所有中醫(yī)藥有關(guān)醫(yī)、藥及學(xué)術(shù)的內(nèi)容。而數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)的發(fā)展使我們有可能從這些海量數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)新的知識,發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)背后隱藏的關(guān)系和規(guī)則,還可以對未知的情況進(jìn)行預(yù)測。多學(xué)科交叉目前正成為增強(qiáng)科技創(chuàng)新的重要途徑,數(shù)據(jù)挖掘正是從統(tǒng)計(jì)學(xué)、數(shù)據(jù)庫、機(jī)器學(xué)習(xí)等多門學(xué)科中發(fā)展起來的。
1 數(shù)據(jù)挖掘介紹
1.1 數(shù)據(jù)挖掘的定義
數(shù)據(jù)挖掘(datamining)也稱為數(shù)據(jù)庫知識發(fā)現(xiàn),為解決上述矛盾提供了強(qiáng)有力的工具[1]。數(shù)據(jù)挖掘這一術(shù)語出現(xiàn)于1989年,其定義幾經(jīng)變動,本研究中引用Frayyad UM等提出的對數(shù)據(jù)挖掘的定義[2]。
數(shù)據(jù)挖掘是從數(shù)據(jù)庫中識別出有效的、新穎的、潛在有用的并且最終可理解的模式的非平凡過程。其中:
① 有效性要求挖掘前要對被挖掘的數(shù)據(jù)進(jìn)行仔細(xì)檢查,具備該特性,才能保證挖掘出來信息的可靠性。
② 新穎性要求發(fā)現(xiàn)的模式應(yīng)該是從前未知的,甚至是違背直覺的信息或知識,挖掘出的信息越是出乎意料,就可能越有價值。
③ 潛在有用性是指發(fā)現(xiàn)的知識將來有實(shí)際效用,即這些信息或知識對于所討論的業(yè)務(wù)或研究領(lǐng)域是有效的、是有實(shí)用價值和可實(shí)現(xiàn)的,常識性的結(jié)論或已被人們掌握的事實(shí)或無法實(shí)現(xiàn)的推測都是沒有意義的。
④ 最終可理解性要求發(fā)現(xiàn)的模式能被用戶理解,目前它主要是體現(xiàn)在簡潔性上。發(fā)現(xiàn)的知識要可接受、可理解、可運(yùn)用,最好能用自然語言表達(dá)所發(fā)現(xiàn)的結(jié)果。實(shí)際上,所有發(fā)現(xiàn)的知識都是相對的,是有特定前提和約束條件,面向特定領(lǐng)域的。
⑤ 非平凡是一個數(shù)學(xué)概念,即數(shù)據(jù)挖掘既不是把數(shù)據(jù)全部抽取,也不是一點(diǎn)兒也不抽取,而是抽取出隱含的、未知的、可能的有用的信息。要有一定程度的智能性、自動性(僅僅給出所有數(shù)據(jù)的總和不能算作是一個發(fā)現(xiàn)過程)。
數(shù)據(jù)挖掘的結(jié)果通常表示為概念(concepts)、規(guī)則(rules)、規(guī)律(regularities)、模式(pattern)、約束(constraint)、可視化(visualization)等形式。這些知識可以直接提供給決策者,用于輔助決策過程;或者提供給領(lǐng)域?qū)<遥拚龑<业囊延械闹R體系;也可以作為新的知識轉(zhuǎn)存到應(yīng)用系統(tǒng)中,作為實(shí)際事務(wù)處理中決策的依據(jù)[3]。
2 數(shù)據(jù)挖掘的任務(wù)
數(shù)據(jù)挖掘的任務(wù)主要是預(yù)測和描述。預(yù)測是指用一些變量或數(shù)據(jù)庫的若干已知字段預(yù)測其他感興趣的變量或字段的未知的或未來的值。描述是指找到描述數(shù)據(jù)的可理解模式。預(yù)測方法有統(tǒng)計(jì)分析、關(guān)聯(lián)規(guī)則和決策樹預(yù)測、回歸樹預(yù)測等。其中關(guān)聯(lián)規(guī)則反映了一個事務(wù)與其他事務(wù)之間存在關(guān)聯(lián),那么就能根據(jù)其他已知事務(wù)預(yù)測到另一個事務(wù)。描述性方法主要有數(shù)據(jù)分類、回歸分析、聚類、變化和偏差分析、模式發(fā)現(xiàn)等。
3 數(shù)據(jù)挖掘在中醫(yī)藥中的應(yīng)用
中醫(yī)藥的發(fā)展也需要多門學(xué)科的交叉應(yīng)用。數(shù)據(jù)挖掘最初在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用是在對基因組測序數(shù)據(jù)的分析,因?yàn)槿祟惢蚪M計(jì)劃研究中產(chǎn)生了數(shù)十億的核苷酸和上百萬的氨基酸,傳統(tǒng)的統(tǒng)計(jì)方法無能為力。中醫(yī)學(xué)具有系統(tǒng)性、整體性、復(fù)雜性、不確定性等特點(diǎn),不適宜運(yùn)用傳統(tǒng)的還原論的方法研究,而適宜與數(shù)據(jù)挖掘類似的從整體觀上入手的研究方法。數(shù)據(jù)挖掘可以從海量數(shù)據(jù)中挖掘出潛在的規(guī)律,數(shù)據(jù)挖掘的結(jié)果一部分可能與傳統(tǒng)的診療規(guī)律相符,不符合的部分可能是潛在的新知,也可能是沒有意義的,這都需要在相應(yīng)目標(biāo)領(lǐng)域?qū)<业闹笇?dǎo)下進(jìn)行解釋和評價。將數(shù)據(jù)挖掘(DM)和知識發(fā)現(xiàn)(DMKD)應(yīng)用于中醫(yī)藥領(lǐng)域的研究,是中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的重要組成部分[1],必將促進(jìn)中醫(yī)藥的發(fā)展。而數(shù)據(jù)挖掘在中藥藥譜研究和新藥開發(fā)中取得了一定進(jìn)展,本研究主要對其在中醫(yī)以下領(lǐng)域的研究作一介紹。
3.1 證實(shí)質(zhì)的研究
中醫(yī)的“證”又稱“證候”,是疾病在某一階段病變的本質(zhì)反映,是由一組能反映疾病本質(zhì)的癥狀組成的,能揭示病因、病位、病性、病勢,為論治提供依據(jù)。證候是中醫(yī)診斷的核心概念和理論精髓,具有整體性、抽象性、時間性和相對穩(wěn)定性的特點(diǎn)?,F(xiàn)在對證實(shí)質(zhì)的研究多從西醫(yī)的生理理化指標(biāo)來揭示證的實(shí)質(zhì),但實(shí)踐中卻發(fā)現(xiàn)缺少證的特異性指標(biāo)。如果從分子生物學(xué)的角度,利用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)對中醫(yī)證與相關(guān)基因的對應(yīng)關(guān)系,可能取得更好的結(jié)果。通過研究“證”和基因多態(tài)性之間的內(nèi)在聯(lián)系,從基因多態(tài)性所帶來的該基因功能上的變化,由此探尋“證”的相關(guān)基因表達(dá)譜。
3.2 中醫(yī)診斷
中醫(yī)診斷過程主要是對證的判定。而現(xiàn)在證的標(biāo)準(zhǔn)不太規(guī)范,缺乏定量的標(biāo)準(zhǔn),而且其分類與描述也存在不同的觀點(diǎn)。數(shù)據(jù)挖掘則可能完成證的規(guī)范化研究,也可輔助臨床醫(yī)生對病人進(jìn)行證的判定。
陳明等[5]嘗試運(yùn)用關(guān)聯(lián)規(guī)則發(fā)現(xiàn)診斷模式,他把《傷寒論》中的病名、癥狀、舌脈分別作為數(shù)據(jù)表建立數(shù)據(jù)庫,挖掘得出規(guī)則:發(fā)熱、惡寒、脈浮太陽病(支持度65%,置信度5%),可以認(rèn)為發(fā)熱,惡寒的確是太陽病的診斷依據(jù)。
秦中廣等[6]運(yùn)用粗糙集進(jìn)行中醫(yī)類風(fēng)濕證候的診斷,共收集了224個病例,每個病例有81個屬性,并從這224個病例中隨機(jī)抽取學(xué)習(xí)樣本180例,進(jìn)行預(yù)測診斷44例。他們利用屬性約簡得到寒濕阻絡(luò)、濕熱阻絡(luò)、痰閼阻絡(luò)、氣陰兩虛、寒熱錯雜5種證的必定規(guī)則和可能規(guī)則。在44例預(yù)測診斷中診斷正確率達(dá)到90%以上,高于傳統(tǒng)的模糊數(shù)學(xué)方法,并認(rèn)為粗糙集有可能是中醫(yī)診斷研究的動態(tài)理想工具。
劉晉平[7]運(yùn)用數(shù)據(jù)挖掘的手段對中醫(yī)脈象進(jìn)行研究,并開發(fā)出初步的軟件。以明清、近現(xiàn)代3000余例病案為研究分析對象,將病案分為病名、證型、脈象、舌象及癥狀幾項(xiàng),然后進(jìn)行統(tǒng)一化及規(guī)范化處理,得出醫(yī)案中細(xì)脈出現(xiàn)頻率最高,占34.39%。其脈象軟件可以進(jìn)行脈象與病名,脈象與證型之間的相互關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)其內(nèi)在的規(guī)律。
4 方劑配伍規(guī)律的研究
方劑配伍理論是中藥方劑理論的核心,也是研究方劑的關(guān)鍵問題。采用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)進(jìn)行基于中醫(yī)藥理論的方劑配伍規(guī)律研究,既能為中醫(yī)新藥的臨床和實(shí)驗(yàn)研究提供目標(biāo)和思路,減少盲目性,縮短研究周期;同時又為大量古今驗(yàn)方研究探索出一條有價值的研究途徑和方法[8]。
何前鋒等[9]運(yùn)用高頻集挖掘的方法,對中國方劑數(shù)據(jù)庫、中藥新藥品種數(shù)據(jù)庫、中藥成方制劑標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫中各方劑藥物組成數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析,分別得到3個庫的前20味高頻藥,可以看出古今用藥頻率的變化。并把高頻用藥組合與經(jīng)驗(yàn)藥對進(jìn)行比較分析,提示可能成為新藥對的組合。
姚美村等[10]應(yīng)用關(guān)聯(lián)規(guī)則分析技術(shù),以文獻(xiàn)中收錄的106個治療消渴病的中藥復(fù)方為對象,經(jīng)解析后建立復(fù)方特征數(shù)據(jù)庫,以數(shù)據(jù)挖掘系統(tǒng)Enterprise Miner為平臺,關(guān)聯(lián)規(guī)則分析為工具,在單味藥層次上進(jìn)行消渴病復(fù)方組成藥味之間的關(guān)聯(lián)模式研究。得到了藥物與上中下三消的關(guān)聯(lián)以及藥物之間的關(guān)聯(lián),與中醫(yī)專家對于消渴病的治療在主要藥物的配伍方面基本一致,這在一定程度上反映出歷代中醫(yī)在消渴病治療方面認(rèn)識和治療的整體規(guī)律性。
陳波等[11]應(yīng)用關(guān)聯(lián)規(guī)則對李東垣的脾胃方從藥物間關(guān)聯(lián)、癥狀間關(guān)聯(lián)、處方結(jié)構(gòu)與癥狀關(guān)聯(lián)進(jìn)行分析,得出當(dāng)出現(xiàn)當(dāng)歸、黃芪、升麻時,同時出現(xiàn)柴胡的次數(shù)為60次,支持度為10.91%,可信度為84.51%;當(dāng)出現(xiàn)當(dāng)歸、黃芪、柴胡時,同時出現(xiàn)升麻的次數(shù)為60次,支持度為10.91%,可信度為84.51%。兩者的支持度和可信度都較高,提示他們常共同使用。此反映出李東垣補(bǔ)氣與升陽同用的學(xué)術(shù)思想,此藥組也是補(bǔ)中益氣湯的基本組成部分。
現(xiàn)在的研究中存在著方法比較簡單,頻繁模式、關(guān)聯(lián)規(guī)則為其主要方法。方劑配伍不僅是各藥味之間的組合,還包含著各藥劑量比例的搭配,這也是臨床組方的關(guān)鍵,但現(xiàn)在對其進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘的研究還很少。
數(shù)據(jù)挖掘的方法不僅可以運(yùn)用于中醫(yī)基礎(chǔ)理論中的傷寒、溫病等研究,也可用于臨床各科的研究。但高質(zhì)量的數(shù)據(jù)挖掘不僅需要有被處理數(shù)據(jù)的質(zhì)量,更要在中醫(yī)藥專業(yè)背景知識引導(dǎo)下,針對具體問題,選擇合適的數(shù)據(jù)挖掘方法,利用各種工具的效能和應(yīng)用的可能性,取長補(bǔ)短。
對中醫(yī)藥知識進(jìn)行規(guī)范化、數(shù)字化、信息化是促進(jìn)中醫(yī)藥國際化和現(xiàn)代化進(jìn)程的重要內(nèi)容[12]。通過數(shù)據(jù)挖掘,就可以對中醫(yī)藥發(fā)展過程中某些缺失的信息進(jìn)行預(yù)測完善并可以避免主觀性的干擾。數(shù)據(jù)挖掘還可以發(fā)現(xiàn)一些新的模式和規(guī)則,為中醫(yī)藥知識的創(chuàng)新和發(fā)展提供一條新途徑。
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11 陳波,蔣永光,胡波,等.東垣脾胃方配伍規(guī)律之關(guān)聯(lián)分析評述.中醫(yī)藥學(xué)刊,2004,22(4):611~612.
受體學(xué)的發(fā)展已近一個世紀(jì)的歷史,歷經(jīng)四個發(fā)展階段:第一階段為受體概念的提出。1878年,Langley提出“接受物質(zhì)(receptivesubstance)”及1900年Ehrlich提出“受體(receptor)”一詞為代表,當(dāng)時提出的受體的兩個基本特征:結(jié)合、結(jié)合后引起生物效應(yīng),仍為我們現(xiàn)在延用的標(biāo)準(zhǔn)。第二階段為藥理學(xué)研究階段。其代表為1937年Clark的工作。第三階段為放射配體結(jié)合研究階段。1962年Jensen和Jacobson首先用高放射比度的氚標(biāo)雌二醇(3H-E2)證實(shí)大鼠子宮、陰道存在雌激素受體(ER),該階段最大貢獻(xiàn)是可以將受體作為實(shí)體進(jìn)行研究,這是受體的生化和臨床研究的里程碑。目前該方法仍是我們研究受體的基本方法。第四階段為分子生物學(xué)研究階段。從N-乙酰膽堿受體的α-亞單位的核苷酸順序推出該受體的α-亞單位的一級結(jié)構(gòu)的氨基酸順序,這一成果標(biāo)志著受體研究進(jìn)入分子生物學(xué)研究階段。此后受體研究就有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展,已闡明數(shù)十種受體的一級結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系。在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面也取得重大進(jìn)展。目前受體分子的三維結(jié)構(gòu)的研究也已開始取得可喜的進(jìn)展。
隨著受體學(xué)的基礎(chǔ)研究的深入,臨床受體學(xué)的研究也不斷深入,已發(fā)現(xiàn)了多種激素受體病,從而解釋了為何該激素水平正常或升高,仍產(chǎn)生該激素缺乏的臨床表現(xiàn)。如女性化綜合征,睪酮水平正常,但雄性器官不發(fā)育,呈女性外表。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)由于雄激素受體(AR)基因突變,導(dǎo)致AR結(jié)構(gòu)異常及功能喪失。國內(nèi)有作者報告7例,其中2例基因突變點(diǎn)為國際上首先報告。關(guān)于激素及藥物敏感性問題也是人們關(guān)心的問題,激素、藥物敏感性及時辰差異也與受體改變有關(guān)。我們的研究發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素受體(GR)存在晝夜節(jié)律,峰值在6:00~8:00之間,谷值在0:00。合理解釋了為何晨起一次服用糖皮質(zhì)激素類藥物療效比分次服用更好。國外有報告褪黑素(M)傍晚應(yīng)用對免疫系統(tǒng)有興奮作用,晨起同樣劑量則無此作用。有人發(fā)現(xiàn)褪黑素受體(MR)晚20:00明顯高于晨8:00,由于MR晝夜節(jié)律導(dǎo)致機(jī)體對M反應(yīng)性的時辰差異。Lipman報告用糖皮質(zhì)激素治療淋巴細(xì)胞性白血病,其療效與GR有關(guān),GR高糖皮質(zhì)激素療效佳;開始有效,后來無效,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)這時GR降低,停藥待GR恢復(fù)后,又出現(xiàn)療效,提示檢測GR,可預(yù)測糖皮質(zhì)激素療效。相信隨著受體學(xué)研究的深入及擴(kuò)大,有越來越多的激素抵抗及敏感性改變的機(jī)制將被闡明。
受體與腫瘤關(guān)系的研究,也是受體學(xué)研究的一個熱門課題。癌基因通過其編碼的癌蛋白導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。癌蛋白可以是生長因子,也可是受體,目前已發(fā)現(xiàn)數(shù)種癌基因產(chǎn)物與受體有同源性。如細(xì)胞癌基因c-erb-A是編碼甲狀腺激素受體的基因。受體分子結(jié)構(gòu)異常,如V-erb-B是c-erb-B〔原癌基因,為表皮生長因子受體(EGFR)〕的同源物,基因產(chǎn)物為一個去頭去尾的EGFR(相當(dāng)于EGFR557-1158肽鏈、含跨膜域及包括酪氨酚蛋白激酶(PTK)活性在內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)區(qū)段,但缺少膜外的配體結(jié)合域及C端的自身磷酸化區(qū)段,這種轉(zhuǎn)變使EGFR轉(zhuǎn)變?yōu)榻M成性激活狀態(tài),導(dǎo)致紅細(xì)胞增多癥及肉瘤。在腫瘤組織中可使原有受體消失,可以發(fā)現(xiàn)一個新受體,這些變化的意義有待進(jìn)一步研究?,F(xiàn)發(fā)現(xiàn)某些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展受某些內(nèi)分泌激素調(diào)控,這種腫瘤稱為內(nèi)分泌激素依賴性腫瘤。從而應(yīng)運(yùn)而生的是繼手術(shù)、化療、放療、生物制劑后出現(xiàn)的第五大治療—內(nèi)分泌治療。據(jù)報告在歐美,有50%的女性癌和20%的男性癌,具有不同程度的激素依賴性,其中乳腺癌是最常見的激素依賴性腫瘤??梢詰?yīng)用雌激素拮抗劑治療乳腺癌,用孕酮治療子宮體癌及腎癌,糖皮質(zhì)激素治療淋巴細(xì)胞白血病及淋巴瘤。但該類激素療效與其受體的結(jié)合量有關(guān)。隨著研究深入,將發(fā)現(xiàn)越來越多的激素依賴性腫瘤,可通過內(nèi)分泌治療來提高這類腫瘤患者的存活率。
隨著研究深入,人們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)傳染病發(fā)生的起始環(huán)節(jié)是病原體(包括細(xì)胞、病毒和原蟲等)和宿主細(xì)胞的粘附。這種粘附首先依賴于相互識別和結(jié)合,因此這種結(jié)合有一定的特異性。病原體上識別宿主細(xì)胞的組分稱為配體或粘附素。宿主細(xì)胞識別病原體的成分成為病原體受體。
由于病原體受體的研究,有助于認(rèn)識為何同樣接觸一種病原體,在同樣環(huán)境下,有人生病有人不生病,也就是說含有該病病原體受體才能生病。在研究病原體配體和病原體受體同時,人們又設(shè)計(jì)防治感染性疾病的措施。如病原體粘附及定位于宿主細(xì)胞是第一步,失去粘附能力則失去致病性,應(yīng)用粘附素抗體或受體類似物阻斷粘附素與受體的結(jié)合;也可采取相應(yīng)措施使病原體粘附素分解,使病原體失去致病力,從而達(dá)到防治疾病的目的。
隨著受體研究的深入,人們把目光又集中到受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程。受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常與多種疾病有關(guān)。如腫瘤、糖尿病等。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異??梢允沁z傳性的、自身免疫或繼發(fā)性的。其中信息轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的基因突變與疾病關(guān)系是目前研究的熱點(diǎn)之一。體細(xì)胞的基因突變可發(fā)生腫瘤。基因突變分為失活性突變和組成性激活突變,前者導(dǎo)致信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白功能的減弱或消失,而后者導(dǎo)致信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白持續(xù)激活。
由于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中某一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的缺失、減少或結(jié)構(gòu)異常,可使該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程減弱,若無其它通路替代,就會使靶細(xì)胞對該信號不敏感,導(dǎo)致對配體(激素)的抵抗綜合征,如胰島素抵抗性糖尿病。某種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的過度表達(dá),或基因突變使其成為異?;虺掷m(xù)激活狀態(tài),就可使細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)失控,造成該信號的功能亢進(jìn)性疾病。
關(guān)鍵詞生物芯片技術(shù);臨床應(yīng)用
AbstractThe chip biotechnology is the microanalysis and automation analytic method and has high flux level and quick parallelism year by years.It has become an important means of life and a tool to study disease at present.The paper was written to review the use of the technology for diagnosis of diseases.
Key wordsThe chip biotechnology;clinical
生物芯片(Biochip)SL稱微陣列(Microarray)技術(shù),是近年來生命科學(xué)與微電子學(xué)等學(xué)科相互交叉發(fā)展起來的一門高新技術(shù),是隨著人類基因組計(jì)劃(HGP)的研究發(fā)展應(yīng)運(yùn)而生。90年代初,Fodor等發(fā)明了一種利用光刻技術(shù)在固相支持物上光導(dǎo)合成多肽的方法,并在此基礎(chǔ)上于1993年設(shè)計(jì)了一種寡核苷酸生物芯片;1996年世界上第一塊商品化的生物芯片問世。僅十余年,生物芯片技術(shù)在臨床病原菌、毒力基因、抗藥性基因、致病因子的快速檢測等方面已取得了突破性進(jìn)展,除此之外,該技術(shù)還應(yīng)用于新藥開發(fā),食品與環(huán)境監(jiān)督等眾多領(lǐng)域而且提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。生物芯片技術(shù)已日益成熟和完善,顯示出誘人的應(yīng)用前景。
1生物芯片技術(shù)的概述
1.1生物芯片技術(shù)原理
生物芯片技術(shù)的基本原理是分子雜交。類似于Southern和Northern印跡雜交技術(shù)。具體來講,就是通過微加工工藝將大量生物識別分子,如核酸片段、多肽分子、甚至組織切片、細(xì)胞等[1-4]按照預(yù)先設(shè)置的排列方式 固定在厘米見方的芯片片基(基質(zhì)或載體)上,利用生物分子之間特異性親和反應(yīng),實(shí)現(xiàn)對基因、配體、抗原等生物活性物質(zhì)的檢測分析。
1.2根據(jù)探針分子種類劃分
基因芯片(又稱DNA芯片,DNA陣列,DNA微陣列,寡核苷酸陣列等) 探針分子為單鏈基因級DNA或mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA,這種探針分子一般為某種病原體或組織所特有的。其具有穩(wěn)定、點(diǎn)密度較高、探針分子對疾病的針對性強(qiáng)等特點(diǎn)[5-7]。
寡聚核苷酸芯片探針分子為寡聚核苷酸,主要用于病原體的分類、基因的突變檢測。
肽、蛋白芯片 探針分子為多肽或蛋白包括酶、抗體、受體等。該方法不僅適用于抗原、抗體的篩選,同樣也適用于受體配體的相互作用的研究。但其穩(wěn)定性、重復(fù)性問題較突出[8-9]。
1.3根據(jù)支持介質(zhì)劃分
傳統(tǒng)雜交分析技術(shù)以硝酸纖維素膜或尼龍膜為載體,雜交反應(yīng)后經(jīng)放射性自顯影、生物素或地高新等方法進(jìn)行檢測。由于硝酸纖維素膜或尼龍膜等材料有滲透作用,易使被分析的材料擴(kuò)散,因此生物芯片分析利用固相表面作為載體。固相表面無滲透滲透作用,少量的生化物質(zhì)可準(zhǔn)確地沉淀特定位置上;同時固相片基能夠提供一個均勻的接觸面,可以提高定量分析的質(zhì)量。制作生物芯片的載體材料很多,大致可分為4類:無機(jī)材料、天然有機(jī)聚合物、人工合成的有機(jī)高分子聚合物和各種高分子聚合物制成的膜。目前,適用于制作生物芯片的載體材料只有少數(shù)幾種,如:玻璃片、金屬片、各種有機(jī)高分子制作的薄膜等。生物芯片按載體可分為:硅晶片芯片、玻璃芯片、塑料芯片和磁珠芯片等[10]。
1.4根據(jù)制備方法劃分芯片制備的方法有“原位合成”和“合成點(diǎn)樣”兩種方法
原位合成指直接在芯片上用4種核苷酸合成所需探針的基因芯片制備技術(shù),主要包括:原位光刻合成、原位噴印合成、分子印章多次壓印合成。合成點(diǎn)樣是指將合成好的探針、cDNA或基因組DNA通過特定的高速點(diǎn)樣機(jī)器人直接點(diǎn)在芯片片基上。主要包括:微型機(jī)械點(diǎn)樣法、化學(xué)噴射法[11]。
2生物芯片技術(shù)在臨床疾病診斷中的應(yīng)用
2.1生物芯片技術(shù)在病原體檢測中的應(yīng)用
生物芯片在病毒檢測中應(yīng)用較為廣泛。目前,全球每年艾滋病感染者急劇增加,80%集中在發(fā)展中國家。生物芯片在HIV檢測及相關(guān)研究中發(fā)揮了一定的作用。1996年底Kozal等研制了一種DNA芯片,對HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶及蛋白酶基因突變進(jìn)行篩查,他們提取了102個病人HIV-1的RNA,利用高密度寡核苷酸陣列進(jìn)行測序,發(fā)現(xiàn)了167種序列。其后,Mfymetrix公司和Roche Molecular公司合作生產(chǎn)的新一代診斷試劑盒,利用RMS實(shí)驗(yàn)室的PCR擴(kuò)增技術(shù)和DNA芯片技術(shù)結(jié)合檢測艾滋病病人的HIV耐藥反應(yīng)。HIVPRT440也已廣泛用于HIV-1病毒的測序、分型及多態(tài)性分析[12]。
生物芯片技術(shù)也能對所有肝炎病毒的分型、變異、突變和病毒核酸含量進(jìn)行高通量、平行檢測。該方法不僅簡便易行,而且實(shí)驗(yàn)成本大為降低,為臨床的準(zhǔn)確診斷、合理用藥、判定預(yù)后提供確實(shí)可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[13]。如對抗-HCV IgG進(jìn)行c區(qū),NS3、NS4、NS5不同區(qū)域檢測和甲~庚型肝炎病毒的檢測。Zhu等利用DNA芯片對人巨細(xì)胞病毒(HCMV)感染宿主引起的細(xì)胞基因表達(dá)改變進(jìn)行了全面分析[14]。對約6600個人mRNA的表達(dá)進(jìn)行監(jiān)測,結(jié)果感染前后258種mRNA水平改變4倍以上,其中一些mRNA編碼的基因產(chǎn)物在病毒致病性中起關(guān)鍵作用,值得進(jìn)一步研究。生物芯片同樣用于細(xì)菌檢測中。1998年底,Troesch等[15]開始研制一種DNA芯片,針對分枝桿菌屬感染的病人進(jìn)行檢測,部分病人對利福平產(chǎn)生耐藥,設(shè)計(jì)研制此種DNA芯片可對耐藥機(jī)制有進(jìn)一步了解。De Saizieu等[16]用64OO0個寡核苷酸陣列來檢測100個肺炎雙球菌的基因,其敏感性比Northern印跡要好一些。他們測量了肺炎球菌在指數(shù)生長和靜止期的基因表達(dá)差異。例如在靜止期,多糖莢膜合成、長鏈脂肪酸合成、細(xì)胞分裂相關(guān)的酶的表達(dá)水平極低,這些與預(yù)期結(jié)果一致。
2.2在癌癥方面的應(yīng)用研究
由于腫瘤是對人類健康威脅最大的疾病之一,而且目前尚無有效的治療方法,所以很多學(xué)者期望能夠?qū)δ[瘤進(jìn)行快速鑒定和分類,從而為早期診斷和治療創(chuàng)造條件。生物芯片目前是一種廣泛用于檢測癌癥的強(qiáng)大工具,并且可以基于共同的分子特征和臨床表現(xiàn)有效區(qū)分癌癥的亞型。斯坦福大學(xué)的Uma[17]是第一個使用DNA芯片研究包括癌癥在內(nèi)的多種疾病基因表達(dá)特征的人。乳腺癌是危害婦女健康的主要惡性腫瘤,全世界每年約有120萬婦女發(fā)生乳腺癌,它對病人的健康和生命造成嚴(yán)重的威脅。維生素D受體(VitamiD Receptor,VDR)是維生素D通路上的重要調(diào)節(jié)因素,與乳腺癌發(fā)病有密切關(guān)系。Trabert[18]通過對人群進(jìn)行病例一對照研究,進(jìn)而發(fā)現(xiàn)VDR基因3'端的多態(tài)性(特別是BsmI和Poly A)和乳腺癌危險因素之間的關(guān)系,去除混雜因素后,結(jié)果表明,高加索人群中,絕經(jīng)后女性的BsmI基因的bb基因型是乳腺癌發(fā)病的顯著性危險因素(OR=1.53)。
急性淋巴性白血病是以母細(xì)胞失調(diào)和分化為特征的快速進(jìn)展型白血病。Notch基因家族成員Notch在T細(xì)胞急性淋巴性白血病(T-cell acutelymphoblastic leukemia,T-ALL)發(fā)生中扮演著重要的角色,大約50%~60% 的T-ALL病人中都存在該基因的突變,使其成為T-ALL中最常見的活化癌基因[19]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantarget of rapamycin,mTOR)的通路異常與遺傳病、腫瘤等有關(guān)。在T-ALL細(xì)胞中,Notch可以調(diào)節(jié)mTOR通路的活性[20]。Steven[19]通過蛋白芯片技術(shù)研究13種人類T細(xì)胞白血病細(xì)胞株中,82種信號蛋白中的108抗原決定簇蛋白的磷酸化狀態(tài),結(jié)果表明,如果用小分子抑制劑同時阻斷mTOR和Notch的通路可以協(xié)同抑制T-ALL的發(fā)展。
這種藥物聯(lián)合作用可能成為治療“基于Notch腫瘤”的一種新型治療方法。對于惡性腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療是腫瘤患者獲得長期生存的主要途徑。腫瘤標(biāo)志物的檢測對于腫瘤的早期診斷,以及亞健康人群普查有很大價值。王江濤[21]采用蛋白芯片進(jìn)行多種腫瘤標(biāo)志物的檢測,可同時檢測肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌等12種常見腫瘤標(biāo)志物。結(jié)果表明,通過蛋白芯片的檢測結(jié)果與臨床診斷基本吻合,從而充分說明多腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片在腫瘤的臨床診斷中有較好的應(yīng)用價值。
2.3 對自身免疫性疾病的應(yīng)用研究
自身免疫性疾病是指由機(jī)體自身產(chǎn)生的抗體或致敏淋巴細(xì)胞破壞、損傷自身的組織和細(xì)胞成分,導(dǎo)致組織損害和器官功能障礙的原發(fā)性免疫性疾病。很多自身免疫性疾病以檢測到特異性抗體為診斷依據(jù),例如:系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的抗雙鏈DNA抗體和抗Smith抗體;多結(jié)締組織疾病中的抗U1-snRNP抗體;Graves病中的抗甲狀腺刺激激素受體抗體等。采用蛋白芯片可以在一張芯片上同時檢測上百種自身抗體,對于初篩自身免疫性疾病具有很大價值[22]。
自身抗體的檢測不僅可以提供診斷信息,還可以提示預(yù)后信息。例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的抗雙鏈DNA抗體和活動性腎炎有關(guān);抗R0抗體和皮膚狼瘡、光敏性皮炎及新生兒狼瘡綜合征等有關(guān)。臨床醫(yī)生可以根據(jù)這些信息預(yù)測病人的預(yù)后。Robinson實(shí)驗(yàn)室目前開發(fā)出了多種疾病特異性抗原蛋白芯片,其中包括多結(jié)締組織疾病檢測芯片(含來自多種風(fēng)濕病人的200多種自身抗原);滑膜蛋白檢測芯片,其中包括650種以上的自身抗原;髓磷脂蛋白檢測芯片,其中包括500種以上的髓磷脂蛋白等[23]。
多發(fā)性硬化癥是一種慢性神經(jīng)脫髓鞘性疾病,最終會導(dǎo)致神經(jīng)軸突的損傷??梢宰R別髓磷脂抗原的免疫細(xì)胞和抗體(例如伽瑪干擾素、IL-17等)與發(fā)病有關(guān)。尚無公認(rèn)的治療方法,目前治療的重點(diǎn)在于抑制或者耐受患者的抗原特異性自身免疫反應(yīng),可以通過編碼一種或多種髓磷脂抗原的質(zhì)粒DNA疫苗達(dá)到上述目的。Bar[24]研制了一種可以編碼人類髓磷脂基礎(chǔ)蛋白全長的,名為BHT-300的DNA疫苗,治療了復(fù)發(fā)性和繼發(fā)進(jìn)行性多發(fā)性硬化癥的3O個病人。結(jié)果表明,BHT-3009安全、藥物反應(yīng)易于被患者接受,并且可以有效改善患者的腦部核磁共振掃描結(jié)果。
2.4對遺傳疾病的應(yīng)用研究
老年黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)是一種可遺傳的視網(wǎng)膜退化病變,患者的黃斑點(diǎn)退化導(dǎo)致中央視覺受損,已成為老年人重要的致盲性眼病之一[25]。Haines[26]通過基因芯片技術(shù),對2個獨(dú)立的數(shù)據(jù)集(162個核心家庭關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)集和399例病人、159例對照組成的病例一對照數(shù)據(jù)集)發(fā)現(xiàn)基因LRP6、基因VEGF和基因VLD.LR是產(chǎn)生AMD的危險因素。Leber遺傳性視神經(jīng)病變(Leber S hereditary opticneuropathy,LHON)是第一個被鑒定出與線粒體DNA點(diǎn)突變有關(guān)的母系遺傳性致盲性視神經(jīng)疾病。臨床上以兩側(cè)連續(xù)急性或亞急性中央視力衰退為特征,主要累及男性青少年[27]。Danielson[28]通過基因芯片技術(shù)研究了LHON線粒體的基因表達(dá)變化,結(jié)果表明,醛糖還原酶在LHON的轉(zhuǎn)線粒體細(xì)胞中具有較高的表達(dá)水平。醛糖還原酶的產(chǎn)物之一是山梨醇,此物質(zhì)與視神經(jīng)病變有關(guān),而且在LHON轉(zhuǎn)線粒體細(xì)胞中,山梨醇的水平較高。因此,初步推斷醛糖還原酶抑制劑對LHON有一定治療作用。
3結(jié)束語
生物芯片技術(shù)誕生至今已有十幾年的歷史了,其發(fā)展具有三個主要特點(diǎn):①生物芯片的品種繁多,目前用于檢測生物組分的技術(shù)如雜交、電泳、質(zhì)普分析、熒光染色等,均被用于生物芯片技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用,使得生物芯片技術(shù)呈現(xiàn)百花齊放,百家爭鳴的格局;②生物芯片的發(fā)展方向是微縮芯片實(shí)驗(yàn)室,盡管生物芯片的種類繁多,各有優(yōu)點(diǎn)。但各種芯片的最終發(fā)展目標(biāo)是將樣品制備和檢測微縮成一體,即微縮芯片實(shí)驗(yàn)室;③生物芯片技術(shù)由實(shí)驗(yàn)研究走向臨床應(yīng)用,AtheNA Multi-Lyre芯片通過FDA 認(rèn)證是生物芯片從實(shí)驗(yàn)室進(jìn)入臨床應(yīng)用的標(biāo)志。隨著新材料、新技術(shù)的不斷開發(fā),生物芯片技術(shù)將得到進(jìn)一步的完善和發(fā)展。相信不久的將來,包含所有步驟的縮微芯片實(shí)驗(yàn)室將不斷涌現(xiàn)。
盡管生物芯片技術(shù)從產(chǎn)生到現(xiàn)在已顯示出巨大的優(yōu)勢,發(fā)揮了一定潛力。但其技術(shù)仍有一些亟待解決的問題,如:① 提高生物芯片的特異性;② 簡化樣本制備和標(biāo)記操作;③ 增加信號檢測的靈敏度;④高度集成化樣本制備、基因擴(kuò)增、核酸標(biāo)記及檢測儀器的研制和開發(fā)等。但它的出現(xiàn)必將在人類疾病的診斷中發(fā)揮巨大的作用??梢灶A(yù)測,生物芯片技術(shù)帶來了檢測分析領(lǐng)域的一場革命。
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