表觀遺傳學(xué)主要研究精選(九篇)

前言：一篇好文章的誕生，需要你不斷地搜集資料、整理思路，本站小編為你收集了豐富的表觀遺傳學(xué)主要研究主題范文，僅供參考，歡迎閱讀并收藏。

第1篇：表觀遺傳學(xué)主要研究范文

基因表達(dá)正確與否，既受控于DNA序列，又受制于表觀遺傳學(xué)信息。表觀遺傳學(xué)主要通過DNA的甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑和非編碼RNA調(diào)控等方式控制基因表達(dá)。近年發(fā)現(xiàn)，副突變也包含有表觀遺傳性質(zhì)的變化。

1.DNA甲基化

DNA甲基化是由酶介導(dǎo)的一種化學(xué)修飾，即將甲基選擇性地添加到蛋白質(zhì)、DNA或RNA上，雖未改變核苷酸順序及組成，但基因表達(dá)卻受影響。其修飾有多種方式，即被修飾位點(diǎn)的堿基可以是腺嘌呤N-6位、胞嘧啶的N-4位、鳥嘌呤的N-7位和胞嘧啶的C-5位，分別由不同的DNA甲基化酶催化。在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化學(xué)性修飾堿基，CG二核苷酸是最主要的甲基化位點(diǎn)。DNA甲基化時(shí)，胞嘧啶從DNA雙螺旋突出，進(jìn)入能與酶結(jié)合的裂隙中，在胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶催化下，有活性的甲基從S-腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)移至胞嘧啶5-位上，形成5-甲基胞嘧啶（5mC）。DNA甲基化不僅可影響細(xì)胞基因的表達(dá)，而且這種影響還可隨細(xì)胞分裂而遺傳并持續(xù)下去。因此，它是一類高于基因水平的基因調(diào)控機(jī)制，是將基因型與表型聯(lián)系起來的一條紐帶。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組DNA中，約有3%～5%的胞嘧啶是以5-甲基胞嘧啶形式存在的，同時(shí)70%的5-甲基胞嘧啶參與了CpG序列的形成，而非甲基化的CpG序列則與管家基因以及組織特異性表達(dá)基因有關(guān)。因而CpG的甲基化與否在基因的表達(dá)中起重要作用。高度甲基化的基因，如女性兩條X染色體中的一條處于失活狀態(tài)，而為細(xì)胞存活所需一直處于活性轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的持家基因則始終處于低水平的甲基化。在生物發(fā)育的某一階段或細(xì)胞分化的某種狀態(tài)下，原先處于甲基化狀態(tài)的基因，也可以被誘導(dǎo)去除甲基化，而出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄活性。

2.組蛋白修飾

組蛋白是真核生物染色體的基本結(jié)構(gòu)蛋白，是一類小分子堿性蛋白質(zhì)。組蛋白有兩個(gè)活性末端：羧基端和氨基端。羧基端與組蛋白分子間的相互作用和DNA纏繞有關(guān)，而氨基端則與其他調(diào)節(jié)蛋白和DNA作用有關(guān)，且富含賴氨酸，具有極度精細(xì)的變化區(qū)，這類變化由乙酰化、磷酸化、甲基化等共價(jià)修飾引起。這些修飾可作為一種標(biāo)記或語言，是“組蛋白密碼”的基本組成元素。這種組蛋白密碼可被一系列特定的蛋白質(zhì)所識(shí)別，并將其轉(zhuǎn)譯成一種特定的染色質(zhì)狀態(tài)以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的調(diào)節(jié)，這顯著地?cái)U(kuò)大了遺傳密碼的信息儲(chǔ)存量。

3.染色質(zhì)重塑

真核生物染色質(zhì)是一切遺傳學(xué)過程的物質(zhì)基礎(chǔ)，染色質(zhì)構(gòu)型局部和整體的動(dòng)態(tài)改變，是基因功能調(diào)控的關(guān)鍵因素。染色體重塑是指染色質(zhì)位置和結(jié)構(gòu)的變化，主要涉及在能量驅(qū)動(dòng)下核小體的置換或重新排列，它改變了核小體在基因啟動(dòng)子區(qū)的排列，增加了基因轉(zhuǎn)錄裝置和啟動(dòng)子的可接近性。染色質(zhì)重塑的發(fā)生和組蛋白N端尾巴修飾密切相關(guān)，尤其是對(duì)組蛋白H3和H4的修飾。修飾直接影響核小體的結(jié)構(gòu)，并為其他蛋白提供了和DNA作用的結(jié)合位點(diǎn)。染色質(zhì)重塑主要包括兩種類型：一類是含有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和脫乙酰酶的化學(xué)修飾;另一類是依賴ATP的物理修飾，利用ATP水解釋放的能量解開組蛋白和DNA的結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄得以進(jìn)行。

4.非編碼RNA

調(diào)控有多種功能性非編碼RNA可對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行干擾。各種生物中雙鏈RNA（dsRNA）可通過不同途徑被分割成小的干涉RNA（siRNA）或RNAi。RNA干涉（RNAi）屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默，它可使轉(zhuǎn)錄后的同源mRNA降解，使同系的DNA序列發(fā)生修飾性變化（甲基化），使rRNA甲基化，從而使目的基因表達(dá)沉默。

5.副突變

副突變是指一個(gè)等位基因可以使其同源基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生穩(wěn)定可遺傳變化，即一個(gè)等位基因被另外一個(gè)等位基因在轉(zhuǎn)錄水平上被沉默且這種能力可遺傳。這種現(xiàn)象是1956年R.A.Brink在研究玉米的R基因座位時(shí)發(fā)現(xiàn)的。此后在其他植物、真菌甚至小鼠中發(fā)現(xiàn)。

二、遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)的關(guān)系

傳統(tǒng)遺傳學(xué)認(rèn)為遺傳信息儲(chǔ)存于DNA的序列中，它主要研究基因序列改變所致的基因表達(dá)水平的變化，是基因質(zhì)的變化;表觀遺傳學(xué)則認(rèn)為遺傳信息是DNA甲基化形式和組蛋白密碼、RNA干涉等，它實(shí)際上是以基因表達(dá)水平為主的量變遺傳學(xué)。表觀遺傳變異也能遺傳，并具重要的表型效應(yīng)，但其不同于基因突變。在整個(gè)生命過程中，表觀遺傳學(xué)機(jī)制能對(duì)激素、生長(zhǎng)因子等調(diào)節(jié)分子傳遞的環(huán)境信息在不改變DNA序列的情況下做出反應(yīng)。因此，只有二者彼此協(xié)同，生命過程才能按序正常進(jìn)行，否則就會(huì)出現(xiàn)異常。由此可見，遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)系統(tǒng)既相區(qū)別、彼此影響，又相輔相成，共同確保細(xì)胞的正常功能。

三、表觀遺傳學(xué)研究的應(yīng)用前景

表觀遺傳學(xué)補(bǔ)充了“中心法則”忽略的兩個(gè)問題，即哪些因素決定了基因的正常轉(zhuǎn)錄和翻譯以及核酸并不是存儲(chǔ)遺傳信息的唯一載體;在分子水平上，表觀遺傳學(xué)解釋了DNA序列所不能解釋的諸多奇怪的現(xiàn)象。例如，同一等位基因可因親源性別不同而產(chǎn)生不同的基因印記疾病，疾病嚴(yán)重程度也可因親源性別而異。表觀遺傳學(xué)信息還可直接與藥物、飲食、生活習(xí)慣和環(huán)境因素等聯(lián)系起來，營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)能夠通過改變表觀遺傳以導(dǎo)致癌癥發(fā)生，尤其是維生素和必需氨基酸。

第2篇：表觀遺傳學(xué)主要研究范文

表觀遺傳學(xué)（epigenetics)是與遺傳學(xué)（genetic)相對(duì)應(yīng)的概念，是對(duì)經(jīng)典遺傳學(xué)的有益補(bǔ)充；其認(rèn)為在不改變基因序列的條件下，生物體從基因到基因表型之間存在一種調(diào)控，這種機(jī)制即“表觀遺傳學(xué)”的含義。盡管已被提出70余年,但直到近10余年，隨著科學(xué)家們對(duì)這種“獲得性遺傳”的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，才成為生命科學(xué)界最熱門的研究之一。因此,研究者們轉(zhuǎn)換思維，從表觀遺傳學(xué)角度對(duì)AD發(fā)病及治療進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了一系列表觀修飾的關(guān)鍵酶類，以及對(duì)這些酶類發(fā)揮影響的藥物，從而為AD藥物研發(fā)提供了新的思路和研究方向。本文擬就AD的表觀遺傳學(xué)治療研究綜述如下。

1阿爾茨海默?。ˋD)概況

阿爾茨海默病（AD)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶力損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。它是最常見的癡呆類型，西方國(guó)家[中50%?70%的癡呆屬于AD。其病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涵蓋了遺傳和環(huán)境的危險(xiǎn)因素，涉及成千上萬個(gè)基因表達(dá)的改變，以及多種信號(hào)途徑的上調(diào)，如P淀粉樣肽W-amyloidpeptide,Ap)的沉積、Tau蛋白過度磷酸化、炎癥、氧化應(yīng)激、能量代謝、血管因素及細(xì)胞凋亡周期異常等。ad的典型病理改變包括突觸喪失、某些神經(jīng)遞質(zhì)水平下降、神經(jīng)元內(nèi)異常物質(zhì)沉積以及選擇性腦神經(jīng)細(xì)胞死亡，使大腦受累區(qū)域廣泛萎縮，導(dǎo)致記憶力喪失伴行為改變和人格異常，嚴(yán)重者可影響工作及社會(huì)生活。受累區(qū)域常會(huì)出現(xiàn)A沉積、老年斑（senileplaques,SP)、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillarytangles,NFT)及Tau蛋白過度磷酸化等。疾病逐漸進(jìn)展惡化，甚至累及生命。遺憾的是目前尚缺乏延緩或阻礙疾病進(jìn)展的治療手段。

在AD中，涉及神經(jīng)元退行性改變的基因達(dá)200余個(gè),越來越多的研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)在沒有基因序列改變的情況下，某些機(jī)制也可以決定致病基因何時(shí)或怎樣表達(dá)，最終導(dǎo)致AD發(fā)病。因此，AD基因組并不能完全解釋發(fā)病機(jī)制[14]。已知編碼APP、PSEN1和PSEN2的基因僅可導(dǎo)致家族性早發(fā)型AD(early-onsetAD,EOAD);而大多數(shù)（約95%)AD均為晚發(fā)型AD(late-onsetAD,LOAD)或散發(fā)型。因此可以推斷，表觀遺傳現(xiàn)象或環(huán)境因素參與了LOAD的致病。這就部分解釋了為什么同一家族中有的家庭成員發(fā)病而另一些不發(fā)病；而且，在年輕的同卵雙胞胎中基因組無實(shí)質(zhì)上的差異，而在同一老年雙胞胎中其基因表觀遺傳學(xué)上存在顯著差異。

大量研究數(shù)據(jù)證實(shí)，基因-環(huán)境相互作用在AD的病理生理過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、毒素、環(huán)境暴露及人的生活行為,都可以在不改變基因組序列的條件下使基因激活或沉默。目前已知的可調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的表觀遺傳學(xué)機(jī)制主要分兩大類：①基因選擇性轉(zhuǎn)錄的調(diào)控：包括基因組DNA甲基化，多種組蛋白甲基化及乙?；刃揎?；②基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控：包括微小RNA(microRNA,miRNA)和小干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA)等非編碼RNA的調(diào)節(jié)，以及沉默的核糖體RNA(ribosomalRNA,rRNA)基因。除此之外，染色體重塑、基因印記、X染色體失活也屬于表觀遺傳學(xué)范疇。

2表觀遺傳學(xué)

表觀遺傳學(xué)的涵義即在DNA序列不發(fā)生改變的情況下，基因的表達(dá)與功能發(fā)生改變，并產(chǎn)生可遺傳的表型。基本機(jī)制即：通過多種基因修飾，影響基因轉(zhuǎn)錄和（或）表達(dá)，從而參與調(diào)控機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老及病理過程。至此，表觀遺傳學(xué)的發(fā)現(xiàn)極大豐富了傳統(tǒng)遺傳學(xué)的內(nèi)容，使人們認(rèn)識(shí)到遺傳信息可以有兩種形式：即DNA序列編碼的“遺傳密碼”和表觀遺傳學(xué)信息。它和DNA序列改變不同的是,許多表觀遺傳的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)是可逆的，這就為許多疾病的治療開創(chuàng)了樂觀的前景。

2.1組蛋白修飾

組蛋白在DNA組裝中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，利用核心組蛋白的共價(jià)修飾傳遞表觀遺傳學(xué)信息。這些修飾主要包括組蛋白甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化及特定氨基酸殘基N-末端的SUMO化;其中組蛋白氨基末端上的賴氨酸、精氨酸殘基是修飾的主要靶點(diǎn),這些組蛋白翻譯后修飾(post-translationalmodifications,PTMs)對(duì)基因特異性表達(dá)的調(diào)控，是其表觀遺傳學(xué)的重要標(biāo)志。正常機(jī)體內(nèi)，組蛋白修飾保持著可逆的動(dòng)態(tài)平衡。一般而言,組蛋白乙?；窃诮M蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histoneacetyl-transferase,HATs)的催化下，從乙酰輔酶A上轉(zhuǎn)移乙?；浇M蛋白N-末端的賴氨酸殘基上；由于乙?；泻土私M蛋白的正電荷，使組蛋白末端和相關(guān)DNA帶負(fù)電荷磷酸基團(tuán)之間的作用減弱，降低了組蛋白和DNA之間的親和力，這種染色質(zhì)構(gòu)象的放寬有助于轉(zhuǎn)錄因子向靶基因片段聚集并利于轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行。而去乙?；瘎t是組蛋白去乙?；福╤istonedeacetylases,HDACs)將乙?；鶑囊阴；M蛋白轉(zhuǎn)移到乙酰輔酶A上，形成了致密的染色質(zhì)狀態(tài)，從而使基因轉(zhuǎn)錄下降或沉默。

2.2DNA甲基化

DNA甲基化較組蛋白修飾更進(jìn)一步，是表觀遺傳學(xué)的又一重要機(jī)制。DNA甲基化主要是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNAmethyltransferase,DNMTs,包括DNMT1、2、3a/b和4)催化下，將同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)-甲硫氨酸循環(huán)中S-腺苷甲硫氨酸（SAM)中的甲基，由四氫葉酸轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的第5位上形成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine,5-mC)。其中，相鄰的胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸（CpGs)是最主要的甲基化位點(diǎn)。在人類基因組中，CpG以兩種形式存在：一種分散存在于DNA中，其CpG70%?90%的位點(diǎn)是甲基化的；另一種CpG呈密集分布于一定區(qū)域，稱之為“CpG島”（CpGislands),通常位于或接近基因啟動(dòng)子區(qū)（promoterregions),在正常人體基因組中處于非甲基化狀態(tài)。CpG島中的胞嘧啶甲基化可以阻礙轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，從而可致基因沉默。一般而言，高度甲基化的基因可致表達(dá)抑制,而低甲基化的基因可增強(qiáng)基因表達(dá)或過表達(dá)。

2.3非編碼RNA

表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制涉及RNA的主要包括:miRNA、siRNA以及維持細(xì)胞周期的沉默rRNA基因的一部分。

miRNA是較短的雙鏈RNA分子，約有22個(gè)核苷酸，來源于機(jī)體自身基因即細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中較大的RNA前體，有自己的啟動(dòng)子和調(diào)控元件。人類基因組中有約700?800個(gè)miRNA。這些小分子RNA在轉(zhuǎn)錄后通過綁定靶mRNA,從而抑制轉(zhuǎn)錄或誘導(dǎo)mRNA分裂降解。大多數(shù)miRNA具有高度保守性和組織特異性，可以調(diào)控機(jī)體中30%?50%的蛋白質(zhì)編碼基因。siRNA長(zhǎng)短與miRNA相似，作用方式也有很多相同之處，區(qū)別在于siRNA可以體外合成,多由外源性導(dǎo)入或感染誘導(dǎo)產(chǎn)生。

重復(fù)rRNA基因的復(fù)制為真核生物核糖體提供了初始活性位點(diǎn)，在基因表達(dá)中是蛋白質(zhì)合成的熱點(diǎn)區(qū)。不同細(xì)胞類型可表現(xiàn)不同的活性rRNA比率,提示隨著細(xì)胞發(fā)育分化，rRNA基因拷貝數(shù)比例會(huì)發(fā)生改變。沉默rRNA的表觀遺傳學(xué)方式在這個(gè)過程中發(fā)揮了重要作用,使活性和非活性rRNAs保持了動(dòng)態(tài)平衡。

2.4染色質(zhì)重塑、基因印記和X染色體失活

染色質(zhì)重塑（chromatinremodeling)指基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和重組等過程中，核小置和結(jié)構(gòu)及其中的組蛋白發(fā)生變化，引起染色質(zhì)改變的過程；主要機(jī)制即致密的染色質(zhì)發(fā)生解壓縮，暴露基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)中的特定結(jié)合位點(diǎn)，使轉(zhuǎn)錄因子（transcriptionfactor,TF)更易與之結(jié)合?；蛴∮?geneticimprinting)指來自親本的等位基因在發(fā)育過程中產(chǎn)生特異性的加工修飾，導(dǎo)致子代體細(xì)胞中兩個(gè)親本來源的等位基因有不同的表達(dá)方式，即一個(gè)等位基因有表達(dá)活性，另一等位基因沉默。X染色體失活指雌性哺乳動(dòng)物細(xì)胞中兩條X染色體的其中之一失去活性的現(xiàn)象,即X染色體被包裝成異染色質(zhì)，進(jìn)而因功能受抑制而沉默化，使雌性不會(huì)因?yàn)閾碛袃蓚€(gè)X染色體而產(chǎn)生兩倍的基因產(chǎn)物。

3AD的表觀遺傳學(xué)3.1組蛋白修飾

研究顯示，在AD中存在組蛋白的PTMs。組蛋白3(histone3,H3)磷酸化作為激活有絲分裂的關(guān)鍵步驟，可使AD海馬神經(jīng)元呈過磷酸化狀態(tài)。對(duì)APP/PS1突變小鼠和野生型小鼠進(jìn)行條件恐懼訓(xùn)練,結(jié)果顯示前者乙?；疕4較野生小鼠組降低50%;之后對(duì)突變組進(jìn)行HDAC抑制劑（histonedeacetylasesinhibitors,HDACIs)曲古抑菌素A的治療，顯示前者乙?；疕4水平出現(xiàn)了上升。在一項(xiàng)皮層神經(jīng)元培養(yǎng)模型研究中，APP過度表達(dá)則可導(dǎo)致H3和H4乙酰化降低，以及c-AMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-responseelementbindingprotein,CREB)水平下降;而CREB則是腦神經(jīng)元中激活記憶相關(guān)基因，形成長(zhǎng)期記憶的關(guān)鍵蛋白。總之，盡管在AD患者、AD動(dòng)物模型及AD培養(yǎng)模型中，都出現(xiàn)了組蛋白修飾,但這個(gè)過程是極其復(fù)雜的,特異性位點(diǎn)會(huì)因功能狀態(tài)不同而出現(xiàn)組蛋白乙酰化增加或減少。

3.2DNA甲基化

3.2.1相關(guān)基因的甲基化研究顯示，盡管很難判

斷AD中甲基化程度是升高還是下降，但12個(gè)甲基化的AD特異性基因表現(xiàn)出了顯著的“表觀偏移”；同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，在DNMT1啟動(dòng)子內(nèi)一些CpG位點(diǎn)也表現(xiàn)出年齡相關(guān)的表觀偏移。研究還發(fā)現(xiàn)，葉酸、甲硫氨酸及Hcy代謝與DNA甲基化機(jī)制顯著關(guān)聯(lián)。例如，人類及動(dòng)物模型葉酸缺乏將導(dǎo)致基因組整體低甲基化，而補(bǔ)充葉酸則可部分逆轉(zhuǎn)甲基化程度。Smith等研究發(fā)現(xiàn)，衰老及AD人群中都出現(xiàn)了葉酸缺乏和甲硫氨酸-Hcy周期的改變。另一研究發(fā)現(xiàn)AD患者腦脊液（cerebro-spinalfluid,CSF)中葉酸顯著下降，同樣下降的還有CSF及腦組織中SAM。同時(shí)還觀察到AD患者腦組織中S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)及血漿中Hcy的升高，后者可抑制DNA甲基化。

目前已知的AD相關(guān)基因主要包括：p淀粉樣蛋白前體（APP)基因、早老素1(PS1)和早老素2(PS2)基因、載脂蛋白E(ApoE)基因、p-分泌酶（BACE)基因、sortilin相關(guān)受體基因(sortilin-relatedreceptor1gene,SORL1)以及白介素1a(IL-1a)和白介素6(IL-6)基因等。其中，APP基因、BACE基因或PS1基因均存在可調(diào)控的CpG甲基化位點(diǎn)。有研究顯示,一例AD尸檢的大腦皮層中APP基因發(fā)生了完全去甲基化，而正常樣本或匹克氏?。≒ick’sdisease)患者樣本則沒有這種變化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，葉酸缺乏所致的BACE和PS1基因表達(dá)增強(qiáng)，可通過補(bǔ)充SAM而恢復(fù)正常。同樣，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給予APP過度表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠缺乏葉酸、B12及B6的飲食，可以使SAH升高并上調(diào)PS1和BACE的表達(dá)，以及促進(jìn)A的沉積和出現(xiàn)認(rèn)知障礙。在LOAD尸檢標(biāo)本中，研究者發(fā)現(xiàn)了著名的“年齡依賴的表觀遺傳學(xué)漂移”(age-dependentepigeneticdrift);對(duì)CpG島異常的表觀遺傳學(xué)控制,可能促成了LOAD的病理變化,因此，“表觀遺傳學(xué)漂移”可能是LOAD個(gè)體易感的重要機(jī)制。

3.2.2Tau蛋白相關(guān)的甲基化Tau蛋白是一種微管結(jié)合蛋白（microtubulebindingprotein,MAP),它能與神經(jīng)軸突內(nèi)的微管結(jié)合，具有誘導(dǎo)與促進(jìn)微管形成，防止微管解聚、維持微管功能穩(wěn)定的功能。對(duì)記憶和正常大腦功能起重要作用。然而，在AD中,Tau蛋白不僅不再發(fā)揮正常功能，還會(huì)因異常磷酸化或糖基化等改變了Tau蛋白的構(gòu)象，使神經(jīng)元微管結(jié)構(gòu)廣泛破壞，形成以Tau蛋白為核心的NFT,最終導(dǎo)致神經(jīng)元功能受損或神經(jīng)元丟失。

人體在正常條件下，Tau蛋白啟動(dòng)子的AP2結(jié)合位點(diǎn)是非甲基化的，但SP1和GCF結(jié)合位點(diǎn)則被甲基化。而隨著年齡的增加，SP1作為一種轉(zhuǎn)錄激活位點(diǎn)甲基化程度升高,GCF作為啟動(dòng)子抑制位點(diǎn)則逐漸去甲基化，因此總體而言Tau蛋白的基因表達(dá)是下調(diào)的。尤其在額葉及海馬區(qū)域，正常Tau蛋白也出現(xiàn)了年齡相關(guān)的下降。蛋白磷酸酶2A(PP2A)是一種針對(duì)磷酸化Tau蛋白的去磷酸化酶，PP2A催化亞基的甲基化可以激活該酶。研究顯示，在APP及PS1基因突變的轉(zhuǎn)基因小鼠中，PP2A的甲基化程度顯著下降，結(jié)果顯示Tau蛋白磷酸化增高。對(duì)培養(yǎng)的神經(jīng)元添加葉酸拮抗劑甲氨蝶呤，也可導(dǎo)致PP2A去甲基化，從而增加Tau蛋白的磷酸化程度。另外，還有研究顯示，Hcy可以使PP2A的甲基化程度及活性下降,而添加葉酸和B12則可以逆轉(zhuǎn)這個(gè)過程?？傊琓au蛋白的磷酸化和脫磷酸化間平衡是維持微管穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素；而其中磷酸化相關(guān)酶類的甲基化程度,成為影響Tau蛋白磷酸化的重要因素。

3.2.3異常的細(xì)胞周期和神經(jīng)元凋亡研究證實(shí),細(xì)胞周期異常和神經(jīng)元凋亡是AD神經(jīng)退行性變的常見機(jī)制。AD神經(jīng)元中細(xì)胞周期及凋亡途徑關(guān)鍵因子受DNA甲基化影響并發(fā)生上調(diào)。包括細(xì)胞周期素B2基因、caspase-1基因、caspase-3基因等。這些相關(guān)基因的低甲基化使細(xì)胞進(jìn)入異常細(xì)胞周期。同樣,高Hcy可使培養(yǎng)神經(jīng)元凋亡，也間接證實(shí)了低甲基化導(dǎo)致異常細(xì)胞周期；而使用SAM還可起到拮抗細(xì)胞凋亡的效果。

3.3A與miRNA

研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可以調(diào)節(jié)APP的表達(dá)、APP處理、A聚積以及BACE1的表達(dá)，從而導(dǎo)致A毒性改變或影響神經(jīng)再生。因而,miRNA失調(diào)可使APP表達(dá)及處理過程發(fā)生改變，最終引起神經(jīng)元存活率和神經(jīng)再生程度的改變。針對(duì)全球AD人群和正常老年人群的對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，特異性miRNA水平存在顯著差異。研究顯示，在AD中APP相關(guān)miRNA顯著下降，而APPmRNA水平則保持平穩(wěn)，提示miRNA影響APP表達(dá)是通過抑制轉(zhuǎn)錄而不是促進(jìn)APPmRNA的裂解；同時(shí)，在AD皮層中miRNA-106b出現(xiàn)顯著下降。具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

3.4AD與一碳代謝

葉酸代謝又稱為一碳代謝，需要SAM提供甲基。諸多研究表明,AD患者常存在血漿及CSF中Hcy升高（兩者濃度升高常呈正相關(guān))，血漿葉酸和B12水平下降，以及腦組織中SAM減少。早期暴露于缺乏葉酸及B族維生素飲食的動(dòng)物，其AD相關(guān)基因在腦組織中發(fā)生了表觀遺傳學(xué)修飾。SAM作為甲基化過程最重要的甲基來源，其產(chǎn)生及循環(huán)依賴于甲硫氨酸循環(huán)的正常進(jìn)行[11]。研究顯示,AD患者CSF中SAM出現(xiàn)顯著下降，口服SAM(1200mg,qd)4?8個(gè)月,可以使CSF中SAM濃度升高。同時(shí)，維生素B12缺乏可使SAM產(chǎn)生減少，從而影響甲基化。前瞻性隊(duì)列研究表明，高Hcy與AD高風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)，而較高的葉酸攝入量可以降低老年人的AD風(fēng)險(xiǎn)。葉酸缺乏導(dǎo)致的SAM缺乏以及Hcy升高，使甲基化水平下降；并且，Hcy影響SAM和SAH水平，后兩者可調(diào)節(jié)DNA甲基化活性以及蛋白翻譯后修飾。另外，研究還發(fā)現(xiàn)Hcy可通過抑制甲基化，降低PP2A甲基化程度，從而導(dǎo)致Tau蛋白過磷酸化、NFT及SP形成。因此，最關(guān)鍵機(jī)制即：葉酸/同型半胱氨酸代謝異常導(dǎo)致AD相關(guān)基因啟動(dòng)子的表觀遺傳修飾（CpG區(qū)域甲基化狀態(tài)的改變)，使基因沉默（高甲基化）或過度表達(dá)（低甲基化)，最終發(fā)生AD。

4表觀遺傳學(xué)在AD診療中的應(yīng)用研究

近年來，隨著表觀遺傳學(xué)在AD研究中的不斷進(jìn)步，研究者已逐漸將其應(yīng)用于AD的診斷及治療中，盡管多數(shù)還處于臨床前試驗(yàn)階段，但表觀遺傳學(xué)應(yīng)用于AD臨床的前景是樂觀并值得期待的。

4.1表觀遺傳學(xué)診斷手段

利用亞硫酸氫鈉進(jìn)行甲基化測(cè)序是檢測(cè)DNA甲基化的金標(biāo)準(zhǔn)。該方法利用鹽析法從血液中提取基因組DNA,經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理后，變性DNA中胞嘧啶轉(zhuǎn)換為尿嘧啶，而5-mC則不發(fā)生轉(zhuǎn)換，因此在經(jīng)過PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序后，胸腺嘧啶則代表非甲基化胞嘧啶，而5-mC(主要為CpG二核苷酸）仍為胞嘧啶。繼而由該方法延伸出多個(gè)DNA甲基化分析法，例如：甲基化特異性PCR(methylationspecificPCR,MSP)、結(jié)合亞硫酸氫鹽限制性分析（combinedbisulfiterestrictionanalysis,COBRA)以及甲基敏感性單核苷酸引物(methylation-sensitivesinglenucleotideprimerextension,MS-SNuPE)等。然而，由于目前對(duì)AD相關(guān)基因甲基化的研究還不完善，只能在臨床前研究中應(yīng)用甲基化測(cè)序，用于對(duì)比分析AD中基因甲基化的真實(shí)狀態(tài)。

實(shí)時(shí)基因成像（real-timegeneticimaging)技術(shù)是另一種判斷基因表觀遺傳修飾的手段；該技術(shù)避免了尸檢或動(dòng)物研究，是一種新型的非侵入性的可視化基因調(diào)控檢測(cè)。磁共振波譜（MRspectroscopy,MRS)即是這樣一種特殊的磁共振成像，該技術(shù)可掃描到特定的蛋白，將來可使我們能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)基因表達(dá)變化的可視化實(shí)時(shí)檢測(cè)，理論上而言可以追蹤到DNA甲基化或組蛋白修飾的責(zé)任蛋白；因此，在一定程度上，將為AD的表觀遺傳學(xué)診斷和治療提供新的手段[39]。

此外，另有研究發(fā)現(xiàn)，脂肪酸酰胺水解酶（fattyacidamidehydrolase,FAAH)參與了AD的發(fā)病，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)FAAH易于從外周血中檢出，并可作為一個(gè)新的潛在的AD生物標(biāo)志物（biomarker),繼而用于AD的預(yù)測(cè)或診斷。然而，由于一些AD相關(guān)蛋白或酶類在外周血中易降解，穩(wěn)定的miRNA檢測(cè)已成為反映疾病的重要手段。由于大多數(shù)AD患者外周血單核細(xì)胞中存在各種miRNA的表達(dá)上調(diào)（如miR-371、miR-517等),且與其在AD腦中高表達(dá)相對(duì)應(yīng)，提示通過測(cè)定血漿及血單核細(xì)胞的miRNA譜變化,可作為AD診斷和病情評(píng)估的重要方法。

4.2AD的表觀遺傳學(xué)治療

表觀遺傳學(xué)對(duì)研究AD的發(fā)病機(jī)制和病程轉(zhuǎn)歸,以及研發(fā)新的藥物等方面開拓了廣闊的空間。表觀遺傳學(xué)藥物進(jìn)入體內(nèi)后，可充當(dāng)基因轉(zhuǎn)錄或表達(dá)的“開關(guān)”，通過不同的基因修飾及調(diào)控基因表觀修飾相關(guān)酶類的活性，繼而達(dá)到在未改變DNA序列的情況下影響基因表型。因此，正是表觀遺傳學(xué)改變的“可逆性”，使與之相關(guān)藥物的研發(fā)成為AD治療研究的新方向和重點(diǎn)。

4.2.1HDACIs近年來，科學(xué)家們研發(fā)了多種新的HDACIs。根據(jù)化學(xué)形態(tài)主要分為4類：①短鏈脂肪酸類：如丁酸鈉、苯丁酸鹽和丙戊酸（valproicacid,VPA);②異輕肟酸（hydroxamicacid)類：如曲古抑菌素A(trichostatinA,TSA)、辛二酰苯胺異輕肟酸(suberoylanilidehydroxamicacid,SAHA);③環(huán)氧酮類：如trapoxinA和trapoxinB;④苯甲酰胺類：如MS-275。這些HDACIs與鋅依賴性HDAC蛋白（zinc-dependentHDACprotein,I、II及IV類組蛋白亞型）相互作用；煙酰胺作為NAD+前體，可以抑制III類HDAC蛋白。其中，研究最廣泛的是丁酸鈉、苯丁酸鹽、VPA、TSA和SAHA。

目前FDA批準(zhǔn)上市的是SAHA,-種治療T細(xì)胞淋巴瘤的新型化合物，不僅可增加組蛋白乙?；?，同時(shí)還可提高認(rèn)知。在神經(jīng)系統(tǒng)中，VPA具有抗驚厥和穩(wěn)定情緒的作用，因此這些作用可能與引起組蛋白乙?；淖冇嘘P(guān)；VPA還可以通過抑制GSK-3#介導(dǎo)的y-分泌酶裂解APP,從而抑制Ap的產(chǎn)生，減少A斑塊，最終緩解AD模型鼠的認(rèn)知功能障礙。Ricobaraza等研究顯示，4-苯基丁酸乙酯（PBA)可通過降低GSD-3#來降低AD大鼠腦內(nèi)Tau蛋白磷酸化，并可清除突觸間A沉積，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，從而恢復(fù)記憶并逆轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)障礙。而煙酰胺則可選擇性降低Tau蛋白磷酸化并增加乙?；腶微管蛋白。Fischer等也研究發(fā)現(xiàn)，非特異性HDACIs如VPA、TSA、4-苯基丁酸鈉及伏立諾他等，都可以通過不同的表觀遺傳機(jī)制影響Ap沉積和Tau蛋白過磷酸化，并可改善學(xué)習(xí)和記憶力。另外,HDACi丙戊酸可以降低APP的表達(dá)，減輕大腦中的A肽斑塊負(fù)擔(dān)；研究還證實(shí)，HDACI治療還可誘導(dǎo)樹突發(fā)芽，增加突觸數(shù)量，以及恢復(fù)學(xué)習(xí)行為和形成長(zhǎng)期記憶。Zhang等報(bào)道，口服HDACIMS-275可改善神經(jīng)炎癥和腦淀粉樣變，以及改善AD模型動(dòng)物的行為能力。這些研究提示,HDACIs可通過調(diào)節(jié)HDAC蛋白活性和Tau蛋白磷酸化水平，從而用于AD的治療.

HDACIs可選擇性抑制HDACs,導(dǎo)致組蛋白乙?；缴?，恢復(fù)AD模型動(dòng)物中組蛋白乙酰化水平及提高學(xué)習(xí)和記憶能力。例如：Guan等發(fā)現(xiàn)當(dāng)腦內(nèi)HDAC2過表達(dá)時(shí)，小鼠海馬神經(jīng)元樹突棘密度降低、突觸形成減少、CA1區(qū)LTP形成障礙、空間記憶和工作記憶損傷；而使用HDACIs則能夠促進(jìn)小鼠神經(jīng)元樹突棘和突觸的形成，改善AD模型小鼠的學(xué)習(xí)和記憶減退狀態(tài)。因此，HDAC2可能是HDACIs最適宜的治療靶點(diǎn)之一，可能使腦神經(jīng)元內(nèi)合成新的蛋白以改善或恢復(fù)AD患者記憶。除此之外,HDACIs對(duì)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)具有特異效應(yīng),可以在上調(diào)靶基因表達(dá)的同時(shí)下調(diào)其他基因;這種基因特異性常通過轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)控，后者可以識(shí)別特定啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列，并賦予靶基因特異性（gene-specificeffects),使之對(duì)HDACIs具有敏感性[44],繼而逆轉(zhuǎn)表觀遺傳改變。同時(shí)，應(yīng)用HDACIs治療AD還應(yīng)當(dāng)考慮其是否可穿透血腦屏障，因此，最近的一項(xiàng)研究研發(fā)了一種可進(jìn)入CNS(“CNS-penetrant”)的HDACIs(I類）EVP-0334,目前已進(jìn)入I期臨床試驗(yàn)用于AD治療。

眾所周知，AD大腦受累的主要區(qū)域?yàn)閮?nèi)側(cè)嗅皮質(zhì)、海馬及杏仁核等。研究發(fā)現(xiàn)，與正常腦組織相比,AD患者皮質(zhì)中HDAC6蛋白水平升高了52%,而海馬中則升高了92%。HDAC6與Tau蛋白共同存在于核周，并發(fā)生相互作用；其中HDAC6具有獨(dú)立的微管蛋白脫乙?；傅幕钚浴Ｊ褂肏DAC6抑制劑Tubacin治療或敲除HDAC6,并不能影響HDAC6與Tau蛋白的相互作用，但可以減少Tau蛋白磷酸化[55]。通過結(jié)合HDAC6,Tau蛋白可抑制脫乙酰酶活性,從而導(dǎo)致微管蛋白乙?；黾?；在Tau蛋白過表達(dá)的細(xì)胞中也可見這種增加；說明過量的Tau蛋白成為HDAC6的抑制劑，然而AD患者中正常Tau蛋白是減少的。文獻(xiàn)顯示，HDAC6的減少或丟失可改善聯(lián)想和空間記憶形成[56,57],以及阻斷A誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元線粒體運(yùn)輸障礙。最近有研究人員還發(fā)現(xiàn),HDAC6無效突變（nullmutation)可以挽救神經(jīng)元中Tau蛋白誘導(dǎo)的微管缺陷。他們采用遺傳和藥理學(xué)方法抑制HDAC6的tubulin特異性脫乙酰基酶活性，證實(shí)這種“挽救效應(yīng)”有可能是通過增進(jìn)微管乙?；閷?dǎo)的。這些研究結(jié)果表明,HDAC6有可能是AD和相關(guān)Tau病的一種獨(dú)特的有潛力的藥物靶點(diǎn),HDAC6抑制劑有望成為AD治療的新型藥物。

目前研究證實(shí)，HDACIs可用來治療神經(jīng)變性病、抑郁、焦慮情緒、認(rèn)知功能障礙及神經(jīng)發(fā)育障礙,因此為AD的治療提供廣闊的前景。但現(xiàn)有的HDACIs存在生物利用度低、代謝快、低選擇性等缺點(diǎn)。因此,研究開發(fā)結(jié)構(gòu)新穎、副作用小、特異性及選擇性高的HDACI具有重要的臨床意義。

4.2.2飲食因素除此之外，飲食因素，例如葉酸、維生素B2、B6、B12、蛋氨酸、膽堿等都可以影響甲基供體SAM的形成，并影響DNMTs活性；同時(shí)，一些天然化合物，如異黃酮、黃酮、兒茶素、姜黃素、白藜蘆醇等，可以改變表觀遺傳學(xué)機(jī)制,影響染色質(zhì)修飾酶的活性，因此備受關(guān)注。

研究證實(shí)，傳統(tǒng)用于抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗細(xì)胞凋亡及預(yù)防高脂血癥的姜黃素，也可用于治療AD：在體外實(shí)驗(yàn)中，姜黃素可抑制A聚集沉積、A#誘導(dǎo)的炎癥、戶分泌酶及乙酰膽堿酯酶的活性；而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)則證實(shí)，口服姜黃素可抑制AD動(dòng)物腦組織中Ap沉積、Ap寡聚化及Tau蛋白磷酸化，并改善行為及認(rèn)知。另有研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素還可加速淀粉樣斑塊的分解，繼而改善AD的空間記憶障礙。據(jù)Bora-Tatar等[65]報(bào)道，在33種羧酸衍生物中，姜黃素是最有效的HDAC抑制劑，甚至比丙戊酸和丁酸鈉更強(qiáng)效；另有研究也發(fā)現(xiàn)，姜黃素可顯著降低HDAC1、3和8蛋白水平，并可提高乙?；疕4水平。同時(shí)，姜黃素還是潛在的HAT抑制劑，2004年Balasubramanyam等[66]發(fā)現(xiàn)，姜黃素是p300/CREB結(jié)合蛋白HAT活性特異性抑制劑，對(duì)維持一定的CREB水平起到關(guān)鍵作用。因此，姜黃素對(duì)HDAC和HAT均有調(diào)節(jié)作用；作為已知的抗氧化劑，姜黃素可能是通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激，從而對(duì)乙酰化和去乙?；哂须p重調(diào)節(jié)作用。

AD表觀遺傳學(xué)改變受環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)因素等諸多因素共同作用，因此自孕前保健開始,直至子代的一生，都保持機(jī)體內(nèi)外生存環(huán)境的良好，保證表觀遺傳學(xué)正常修飾及表達(dá),在一定程度上可能會(huì)預(yù)防AD的發(fā)生。同時(shí)，由于目前糖尿病、肥胖、心血管疾病、高血壓等都是公認(rèn)的AD高危因素，通過表觀遺傳學(xué)機(jī)制防治這些疾病，也是降低AD的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的重要手段。另外，提倡低熱量、低膽固醇和富含葉酸、B族維生素及姜黃素等的飲食，以及降低血漿Hcy值，可能對(duì)保護(hù)大腦神經(jīng)元，改善老年期認(rèn)知，以及預(yù)防AD發(fā)生或逆轉(zhuǎn)AD的表觀遺傳改變，起到一定的積極作用。

4.2.3其他因素由于DNA甲基化是可逆的，該過程的相關(guān)酶類也可作為AD治療的研究靶點(diǎn),例如DNMT抑制劑。然而，目前對(duì)DNMT抑制劑的研究多局限于腫瘤的治療，因此對(duì)于AD的治療作用還有待進(jìn)一步研究。另外，研究發(fā)現(xiàn)AD中與APP裂解機(jī)制相關(guān)的多個(gè)miRNA也發(fā)生了改變,因此針對(duì)miRNA的AD表觀遺傳治療成為重要研究方向。2006年，中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所裴鋼院士研究組研究發(fā)現(xiàn)，腎上腺素受體被激活后，可以增強(qiáng)y-分泌酶的活性，進(jìn)而能夠增加AD中Ap的產(chǎn)生。這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)揭示了AD致病的新機(jī)制，提示腎上腺素受體有可能成為研發(fā)AD治療藥物的新靶點(diǎn)。

5展望

綜上所述，在AD中，表觀遺傳學(xué)機(jī)制對(duì)疾病發(fā)生發(fā)展起到了關(guān)鍵作用，尤其是散發(fā)性AD。表觀遺[8]傳學(xué)調(diào)節(jié)障礙導(dǎo)致相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄異常，引起關(guān)鍵蛋白或酶類異常，繼而發(fā)生一系列病理生理改變，是AD發(fā)病的主要原因。表觀遺傳學(xué)改變可以通過表觀遺傳藥物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)，因而這不僅為AD的治療開創(chuàng)了一片新天地，更引導(dǎo)醫(yī)藥行業(yè)進(jìn)入了一個(gè)嶄新的領(lǐng)域。

然而,使用表觀遺傳學(xué)藥物治療疾病也面臨著一系列難題。對(duì)于目前可用的表觀遺傳學(xué)化合物如HDACIs及辣椒素等而言，主要的困難即缺乏針對(duì)不同腦區(qū)、不同神經(jīng)元亞型或特異基因的“選擇性”。

第3篇：表觀遺傳學(xué)主要研究范文

【關(guān)鍵詞】 急性髓細(xì)胞白血?。?表觀遺傳學(xué)； 靶向治療

急性髓細(xì)胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一組異質(zhì)性疾病，以造血干細(xì)胞克隆紊亂為特征，是成年人急性白血病中最常見的類型。近20年來，人們對(duì)AML的發(fā)病機(jī)制和預(yù)后的研究有了長(zhǎng)足的進(jìn)展，患者的完全緩解率也有了明顯的提高，但仍有2/3成年AML患者未能達(dá)到治愈，復(fù)發(fā)、難治及老年AML仍是目前臨床治療的難題。為此，臨床工作者和科研人員不斷探索新途徑，積極尋求AML治療新方法。

近年來，表觀遺傳學(xué)的研究逐漸成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。隨著研究的深入，人們對(duì)AML的發(fā)病機(jī)制有了新的認(rèn)識(shí)，隨之而來的靶向治療也給患者重新帶來希望。該研究主要包括三個(gè)方面的內(nèi)容：DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼microRNA。研究表明，表觀遺傳學(xué)的調(diào)控機(jī)制參與調(diào)節(jié)許多重要的生理過程。在血液腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)化中，表觀遺傳學(xué)異常與遺傳學(xué)異常具有同樣重要的作用。表觀遺傳基因的修飾對(duì)于基因的差e表達(dá)有著至關(guān)重要的作用，它決定著細(xì)胞的類型及細(xì)胞從良性到惡性的轉(zhuǎn)變。尤為重要的一點(diǎn)，這種修飾是可遺傳的、動(dòng)態(tài)的、可逆的，并且不影響下游的DNA序列。表觀遺傳的修飾基因，如DNMT3A，TET2，IDH1和IDH2，ASXL1和MLL1上的頻發(fā)突變，影響了造血細(xì)胞的自我更新和/或分化能力，促進(jìn)髓系細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)白血病的形成[1]。表觀基因組在AML的發(fā)生中有重要的靶標(biāo)性作用，它具有內(nèi)在可塑性，通過特異性的酶、轉(zhuǎn)錄因子、與表觀遺傳機(jī)制相關(guān)的其他蛋白重新編碼對(duì)表觀遺傳基因的修飾，為治療提供了新的可能。

本文將描述表觀遺傳基因的失調(diào)是如何在AML中發(fā)揮作用的，同時(shí)強(qiáng)調(diào)目前和未來的治療手段在發(fā)現(xiàn)新靶標(biāo)上的多種嘗試。此外，還將涉及AML中個(gè)體化的靶向治療，包括術(shù)語的定義，適應(yīng)證的相關(guān)描述以及臨床實(shí)施的具體措施。

1 表觀遺傳學(xué)的針對(duì)性治療

1.1 DNMT3A突變及DNMT抑制劑 DNA甲基化是表觀遺傳調(diào)控的重要組成部分，通常與轉(zhuǎn)錄沉默有關(guān)。在急性白血病中，已被確定多種腫瘤抑制基因的過甲基化與轉(zhuǎn)錄抑制通過增殖、分化和生存過程的失調(diào)導(dǎo)致白血病的發(fā)生[2]。來自MDS的DNA甲基化譜研究數(shù)據(jù)顯示，抑癌基因的異常甲基化可能是驅(qū)動(dòng)MDS進(jìn)展為AML的主要機(jī)制[3]。胞嘧啶甲基化是指C5位的胞嘧啶殘基被DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）催化，并生成C5甲基胞嘧啶（5-MC）的過程?；蚪MDNA甲基化是由DNMT3通過半甲基化的模板（從頭甲基化）建立的，并由DNMT1全甲基化模式（維持甲基化）予以保持。這些過程使得不同的可遺傳的DNA甲基化模式可以用來區(qū)分AML亞型、預(yù)測(cè)預(yù)后，并有潛力作為生物標(biāo)志物來預(yù)測(cè)患者對(duì)治療的反應(yīng)[4]。AML要么普遍低甲基化，要么過甲基化，這提示表觀遺傳途徑的過度和不足可能對(duì)白血病的發(fā)生都很重要[5]。數(shù)據(jù)表明，在白血病干細(xì)胞中，DNMT1可維持其DNA甲基化模式，并參與其自我更新的過程[6]。研究表明，DNMT3A在造血干細(xì)胞自我更新和分化過程中起著關(guān)鍵的作用。重要的是，DNMT3A的功能缺失性突變發(fā)生在30%的細(xì)胞遺傳學(xué)正常的AML中，可能與臨床預(yù)后較差有關(guān)，但AML的這些突變對(duì)于DNA胞嘧啶甲基化和轉(zhuǎn)錄的影響尚不清楚，且DNMT3A的單獨(dú)缺失并不足以導(dǎo)致白血病形成[7]。大多數(shù)的突變涉及882位的精氨酸，在體外導(dǎo)致甲基轉(zhuǎn)移酶活性的降低[8]。到目前為止，尚無特異性針對(duì)DNMT3A的靶向治療。本節(jié)討論的“表觀遺傳修飾的靶向治療”指的是針對(duì)DNMT抑制劑的去甲基化治療。

美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的2種DNMT抑制劑為：阿扎胞苷及其脫氧衍生物地西他濱。這兩種藥物均用于MDS的治療，現(xiàn)在依據(jù)一些臨床試驗(yàn)的結(jié)果，也普遍應(yīng)用于AML的治療。

在一項(xiàng)多中心Ⅱ期研究中，有227位初治AML患者接受了地西他濱治療。每個(gè)療程中靜脈滴注地西他濱持續(xù)72 h，用量為135 mg/m2，間隔6周重復(fù)用藥，共4個(gè)療程[9]。該研究表明，總體有效率為26%，中位生存期為5.5個(gè)月，1年存活率為28%。在另一項(xiàng)多中心Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，給予55位60歲以上的AML患者靜滴地西他濱治療，每日用量為20 mg/m2，連續(xù)5 d給藥，每4周為一療程。結(jié)果，該試驗(yàn)中AML的完全緩解率為24%，中位生存時(shí)期為7.7個(gè)月。

在一項(xiàng)針對(duì)高危MDS（包括骨髓中原始細(xì)胞比例為20%～30%、根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)列為AML）的臨床試驗(yàn)中，給予患者阿扎胞苷治療：每日用量為75 mg/m2，連續(xù)7 d皮下注射用藥，28 d為一個(gè)療程。與對(duì)照組（接受傳統(tǒng)治療方案）相比，阿扎胞苷組有明顯的生存獲益。而對(duì)于一些次要的評(píng)價(jià)指標(biāo)而言，比如輸血需求、靜脈抗生素的使用和住院天數(shù)等，阿扎胞苷組有明顯優(yōu)勢(shì)。與之類似的是，在法國(guó)的一項(xiàng)臨床研究中，149名初治老年AML患者接受了相同劑量和療程的氮雜胞苷治療，總體有效率為33%，完全緩解率為23%，總體生存期為9.4個(gè)月[10]。對(duì)于接受了大劑量誘導(dǎo)化療和異基因造血干細(xì)胞移植的AML患者，使用阿扎胞苷維持治療可能會(huì)減少或延遲白血病的復(fù)發(fā)。

1.2 IDH1/2突變及IDH1/2抑制劑 DNA甲基化與同型二聚體酶IDH1/2催化的檸檬酸代謝有關(guān)，二聚體酶可催化異檸檬酸氧化脫羧成α-酮戊二酸（α-KG）。研究發(fā)現(xiàn)，有10%～30%正常核型的AML患者發(fā)生了IDH1/2功能突變，引起酶功能異常，導(dǎo)致2-羥基戊二酸（2-HG）的產(chǎn)生和積累。由于TET2和包含jumonji-c結(jié)構(gòu)域家族的組蛋白賴氨酸去甲基化酶均依賴于α-KG，當(dāng)機(jī)體發(fā)生IDH1/2突變，并積累2-HG，可導(dǎo)致DNA和組蛋白甲基化的增加[11]。IDH1/2突變對(duì)預(yù)后的影響研究得到了自相矛盾的結(jié)果，可能是因?yàn)橥蛔兾恢玫牟町惡停ɑ颍┌殡S其他基因的突變。例如，一項(xiàng)關(guān)于AML的隨機(jī)臨床試驗(yàn)表明，IDH2的第140位的精氨酸殘基發(fā)生突變與良好的預(yù)后相關(guān)。不但如此，同時(shí)伴有NPM1和IDH1或IDH2突變的細(xì)胞遺傳學(xué)正常的AML患者也有良好的受益，3年總生存率（OS）可高達(dá)89%。然而，IDH1/2和TET2突變是相互排斥的，但具有這兩種不同的突變的AML患者具有相似的甲基化過程。

目前，一項(xiàng)早期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行，旨在研究IDH1/2抑制劑對(duì)發(fā)生了IDH1/2突變的AML患者的影響。這是一種針對(duì)IDH1/2突變酶的小分子靶向抑制劑，可減少2-HG的生成，誘導(dǎo)H3K9me3的脫甲基作用，并能增強(qiáng)相關(guān)分化基因的表達(dá)[12]。

1.3 MLL基因突變及DOT1L蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑 MLL基因位于染色體11q23，編碼H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶（HMT），該酶參與組蛋白的重構(gòu)，影響HOX基因和Wnt信號(hào)通路[13]。有5%～7%的初發(fā)AML病例發(fā)生MLL重排，與不良預(yù)后相關(guān)[14]。MLL區(qū)域是染色體易位和重排的高發(fā)區(qū)，能產(chǎn)生多種融合蛋白，其中一些有致癌性。研究顯示，MLL融合蛋白和DOT1L之g的作用導(dǎo)致了白血病的發(fā)生[15]。

已有研究表明，DOT1L HMT的酶活性誘導(dǎo)了存在MLL基因重排的AML的形成。DOT1L抑制劑可減少H3K79的甲基化和MLL融合基因的表達(dá)。目前，具有高度選擇性的DOT1L抑制劑的研究已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，而選擇性抑制HMT EZH2的強(qiáng)效抑制劑也正在研究中。

1.4 組蛋白去乙?；福℉DAC）抑制劑 單獨(dú)使用HDAC抑制劑治療AML，其臨床作用并不令人滿意。因而，能否與DNMT抑制劑聯(lián)合使用增強(qiáng)療效，則備受期待。目前，諸多相關(guān)的臨床試驗(yàn)正在開展當(dāng)中，而且對(duì)多種HDAC抑制劑，包括丙戊酸、mocetinostat、帕比司他、伏立諾他等，與阿扎胞苷或地西他濱聯(lián)合使用的療效進(jìn)行了評(píng)價(jià)，但結(jié)果并不如人意。在一項(xiàng)二期臨床試驗(yàn)中，恩替諾特聯(lián)合阿扎胞苷治療AML并未提高療效[16]。需要注意的是，與早期的體外試驗(yàn)采用序貫用藥不同，此項(xiàng)試驗(yàn)中這兩種藥物是同時(shí)應(yīng)用的。恩替諾特是一種強(qiáng)效的細(xì)胞周期抑制劑，可能會(huì)抑制阿扎胞苷的整合，導(dǎo)致脫甲基作用減弱。

1.5 賴氨酸乙?；种苿?具有布羅莫結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可識(shí)別組蛋白末端的賴氨酸殘基，這種相互作用可被小分子抑制劑所抑制。當(dāng)前，已開始對(duì)數(shù)種BET抑制劑進(jìn)行臨床試驗(yàn)。研究表明，BET抑制劑可抑制白血病干細(xì)胞和祖細(xì)胞增殖，并且可阻斷MLL介導(dǎo)的白血病轉(zhuǎn)化[17]。

1.6 賴氨酸去甲基化酶抑制劑 研究結(jié)果顯示，KDM1A/LSD1在體外可有效抑制AML細(xì)胞系和原代白血病細(xì)胞。在聯(lián)合使用HDAC抑制劑和全反式維甲酸時(shí)，這種抑制作用更顯著。研究表明，MLL白血病受其影響最大，AML的其他亞型和其他髓系腫瘤也對(duì)之敏感[18]。

2 表觀遺傳學(xué)發(fā)展在AML靶向治療方面的挑戰(zhàn)

2.1 靶向治療的治療靶點(diǎn) AML在發(fā)生、發(fā)展過程中有一系列的異常表現(xiàn)，就疾病本身而言，有許多方面的異?？梢赃M(jìn)行針對(duì)性的治療，包括表觀遺傳途徑的調(diào)節(jié)、基因突變、細(xì)胞表型、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、白血病干細(xì)胞和骨髓微環(huán)境等。最近有關(guān)AML克隆構(gòu)型的研究表明，AML克隆異質(zhì)性始終伴隨著疾病的進(jìn)展及復(fù)發(fā)[19]。因而，AML的治療靶點(diǎn)是不斷變化著的，在疾病的不同時(shí)期需用不同的藥物進(jìn)行治療。有關(guān)初發(fā)AML克隆構(gòu)型的研究顯示，在基因?qū)用娼缍ǖ陌籽喛寺『桶籽「杉?xì)胞之間具有明顯的功能異質(zhì)性[20]。目前的挑戰(zhàn)是明確和清除所有的克隆，而非以往那樣狹隘地認(rèn)為，靶向治療的關(guān)鍵就是應(yīng)用某種方法，通過單向靶點(diǎn)來消除優(yōu)勢(shì)克隆。

2.2 靶向治療的對(duì)象 如何選擇靶向治療的對(duì)象是一個(gè)比較重要的問題。根據(jù)不同的分類方法，AML患者可劃分為不同的亞群，但這樣的分類方法均有各自的優(yōu)點(diǎn)和不足之處。

AML患者也可以根據(jù)預(yù)后進(jìn)行分類。在過去，對(duì)新藥的早期試驗(yàn)通常在復(fù)發(fā)和難治病例中進(jìn)行，顯而易見，這是一種很令人困惑的試驗(yàn)?zāi)Ｊ健Ｓ捎趶?fù)發(fā)或難治AML病例與初發(fā)病例在生物學(xué)上和臨床上是不同的，因而對(duì)初發(fā)病例作新藥研究十分重要?？梢愿鶕?jù)細(xì)胞遺傳學(xué)、分子遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，對(duì)初診患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估并預(yù)先判斷其治療效果的優(yōu)劣。例如，一項(xiàng)研究表明，在不同的甲基化區(qū)域，有高水平甲基化的7個(gè)基因其低表達(dá)具有更好的臨床結(jié)果[21]。目前認(rèn)為，在臨床研究中，靶向治療的對(duì)象應(yīng)該是那些預(yù)后可能不良的初發(fā)AML病例。

2.3 靶向治療的時(shí)機(jī) 臨床上通常將AML治療分為誘導(dǎo)、鞏固和緩解后治療。臨床研究表明，把針對(duì)表觀遺傳學(xué)調(diào)控的靶向藥物與其他藥物聯(lián)合使用，結(jié)果比單一用藥效果更好。因此，已考慮將試驗(yàn)新藥添加到主流的誘導(dǎo)方案當(dāng)中來。多年來有關(guān)AML治療的臨床實(shí)踐表明，尚無哪一種化療方案更優(yōu)于阿糖胞苷聯(lián)合蒽環(huán)類藥物的“7+3”經(jīng)典方案的，所以應(yīng)把該方案作為主要的誘導(dǎo)方案，新藥可以添加于此或者作為單藥評(píng)估其療效。這樣，納入臨床試驗(yàn)的初治患者將會(huì)接受其一進(jìn)行治療。

各種證據(jù)表明，誘導(dǎo)后殘留的白血病細(xì)胞與治療前的腫瘤細(xì)胞在生物學(xué)上是有區(qū)別的。因此，臨床上重復(fù)應(yīng)用同一治療方案并不合理。研究表明，表觀遺傳學(xué)靶向治療在AML完全緩解后或移植后，或可控制白血病克隆的演變。目前，多數(shù)靶向治療藥物是非細(xì)胞毒性的，對(duì)低負(fù)荷白血病而言，治療成功的可能性更大。當(dāng)然，還需要更多的AML患者參與到臨床試驗(yàn)中來，進(jìn)行新型藥物的有效性驗(yàn)證。

2.4 靶向治療的有效性評(píng)價(jià) 表觀遺傳學(xué)靶向治療一般需要長(zhǎng)達(dá)幾周甚至幾月的時(shí)間方顯成效。此外，基于形態(tài)學(xué)和免疫表型的分析方法并不能有效評(píng)價(jià)靶向治療的療效。因而，可以憑借DNA甲基化特征、基因表達(dá)譜、高光譜測(cè)定法以及其他技術(shù)手段來做生物學(xué)標(biāo)志的鑒定，通過生物學(xué)標(biāo)志能充分預(yù)測(cè)療效，并提高疾病監(jiān)控能力。然而，在當(dāng)前臨床實(shí)踐中，尚未能常規(guī)使用此類表觀遺傳學(xué)的生物學(xué)標(biāo)志。

3 展望

隨著對(duì)AML表觀遺傳修飾基因突變的認(rèn)識(shí)的深入，人們發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)在AML生物學(xué)發(fā)生中起著復(fù)雜而重要的作用。AML的表觀遺傳學(xué)靶向治療策略已經(jīng)改變了臨床應(yīng)用，AML患者的個(gè)體化靶向治療將成為現(xiàn)實(shí)。然而，現(xiàn)實(shí)中還面臨著諸多挑戰(zhàn)，其中最大的挑戰(zhàn)就是AML生物學(xué)和患者本身的高度異質(zhì)性。只有通過創(chuàng)新性的臨床試驗(yàn)、可靠的科學(xué)研究和醫(yī)患的共同參與等努力，才可能真正實(shí)現(xiàn)AML患者的個(gè)體化治療。

⒖嘉南

[1] Challen G A，Sun D，Jeong M，et al.Dnmt3a in essential for hematopoietic stem cell differentiation[J].Nat Genet，2011，44（1）：23-31.

[2] Baylin S B，Jones P A.A decade of exploring the cancer epigeomebiological and translational implications[J].Nat Rer Cancer，2011，11（10）：726-734.

[3] Jiang Y，Dunbar A，Gondek L P，et al.Aberrant DNA methylation is a dominant mechanism in MDS progression to AML[J].Blood，2009，113（6）：1315-1325.

[4] Figueroa M E，Lugthart S，Li yushan，et al.DNA methylation signatures identify biologically distinct subtypes in acute myeloid leukemia[J].Cancer Cell，2010，17（1）：13-27.

[5] Akalin A，Garrett-Bakelman F E，Kormaksson M，et al.Base-pair resolution DNA methylation sequencing reveals profoundly divergent epigenetic landscapes in acute myeloid leukemia[J].PLoS Genet，2012，8（6）：e1 002 781.

[6] Trowbridge J J，Sinha A U，Zhu N，et al.Haploinsuffiiency of Dnmt1 impairs leuemia stem cell function through derepression of bivalent chromatin domains[J].Genes Dev，2012，26（4）：344-349.

[7] Abdelwahab O，Levine R L.Mutations in epigenetic modifiers in the pathogenesis and therapy of acute myeloid leukemia[J].Blood，2013，121（18）：3563-3572.

[8] Yan X J，Xu J，Gu Z H，et al.Exome sequencing identifies somatic mutations of DNA methyltransferase gene DNMT3A in acute myeloid leukemia[J].Nat Genet，2011，43（4）：309-315.

[9] Lubbert M，Ruter B H，Claus R，et al.A multicenter phase Ⅱ trial of decitabine as first-line treatment for older patients with acute myeloid leukemia judged unfit for induction chemotherapy[J].Haematologica，2012，97（3）：393-401.

[10] Maukillo L，Venditti A，Spagnoli A，et al.Azacitidine for the treatment of patients with acute myeloid leukemia：report of 82 patients enrolled in an Italian Compassionate Program[J].Cancer，2012，118（4）：1014-1022.

[11] Xu W，Yang H，Liu Y，et al.Oncometabolite 2-hydroxyglutarate is a competitive inhibitor of a-ketoglutarate-dependent dioxygenases[J].Cancer Cell，2011，19（1）：17-30.

[12] Wang F，Travins J，Dela Barre B，et al.Targeted inhibition of mutant IDH2 in leukemia cells induces cellular differentiation[J].Science，2013，340（6132）：622-626.

[13] Milne T A，Briggs S D，Brock H W，et al.MLL target SET domain methyltransferase activity to Hox gene promoters[J].Mol Cell，2002，10（5）：1107-1117.

[14] Groschel S，Schlenk R F，Engelmann J，et al.Deregulated expression of EVI1 defines a poor prognostic subset of MLL-rearranged acute myeloid leukemia：a story of the German-Austrian AML Study Group and the Dutch-Belgian-Swiss HOVON/SAKK Cooperative Group[J].J Clin Oncol，2013，31（1）：95-103.

[15] Bernt K M，Zhu N，Sinha A U，et al.MLL-rearranged leukemia is dependent on aberrant H3K79 methylation by DOT11[J].Cancer Cell，2011，20（1）：66-78.

[16] Prebet T，Sun Z，F(xiàn)igueroa M E，et al.Prolonged administration of azacitidine with or without entinostat for myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia with myelodysplasia-related changes：results of the US leukemia Imtergroup trial E1905[J].J Clin Oncol，2014，32（12）：1242-1248.

[17] Zuber J，Shi J，Wang E，et al.RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukemia[J].Nature，2011，478（7370）：524-528.

[18] Harris W J，Huang X，Lynch J T，et al.The histone demethylase KDM1A sustains the oncogenic potential of MLL-AF9 leukemia stem cells[J].Cancer Cell，2012，21（4）：473-487.

[19] Ding L，Ley T J，Larson D E，et al.Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukemia revealed by whole-genome sequencing[J].Nature，2012，481（7382）：506-510.

[20] Klco J M，Spencer D H，Miller C A，et al.Functional heterogeneity of genetically defined subclones in acute myeloid leukemia[J].Cancer Cell，2014，25（3）：379-392.

第4篇：表觀遺傳學(xué)主要研究范文

【關(guān)鍵詞】惡性腫瘤；表觀遺傳；甲基化；基因印記；微小RNA；組蛋白

【中圖分類號(hào)】R730.5 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1004-7484（2013）04-0017-02

隨著近年來分子生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到惡性腫瘤的遺傳和表觀遺傳的因素綜合作用導(dǎo)致了惡性腫瘤的發(fā)生。在分子水平上對(duì)于惡性腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)幾乎所有腫瘤都能找到表觀遺傳水平的異常。惡性腫瘤的發(fā)生機(jī)制的研究對(duì)于早期診斷、治療以及提高生存率有極其重大的意義。

1.惡性腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)性狀及特點(diǎn)

腫瘤是一種多基因，經(jīng)歷多步驟突變所引起的細(xì)胞克隆性疾病，具有以下生物學(xué)特性：①分化不好，異型性大。②核分裂象多，可見病理性核分裂象。③生長(zhǎng)速度較快。④浸潤(rùn)性或外生性生長(zhǎng)。⑤常見出血、壞死、、潰瘍形成等繼發(fā)改變。⑥對(duì)機(jī)體的影響較大，破壞原發(fā)部位和轉(zhuǎn)移部位的組織；壞死、出血，合并感染和惡病質(zhì)也常發(fā)。

2.腫瘤的發(fā)生與表觀遺傳

傳統(tǒng)遺傳學(xué)認(rèn)為腫瘤是多基因參與的疾病，通常是2個(gè)/2個(gè)以上癌/抑癌基因參與按一定方式組合的多基因、經(jīng)歷多步驟突變所引起的細(xì)胞克隆性退化性疾病。主要基因：缺失、重排、斷裂、突變等。基因改變的結(jié)果就是原癌基因激活，抑癌基因失活，如結(jié)腸癌相關(guān)基因：APC，RAS，P53，DCC.腦膠質(zhì)瘤相關(guān)基因：P53，Interferons，MTS1，MTS2，EGFR，肺癌相關(guān)基因：RAS，c-myc，Rb，P53等。

近期的研究表明，在相當(dāng)一部分腫瘤患者的癌細(xì)胞中，其主要的基因是完整的，并沒有發(fā)現(xiàn)任何的變異，突變和缺失等，這些事實(shí)就提示我們重新思考惡性腫瘤的發(fā)生機(jī)制，是不是有什么比基因改變更為重要的因素導(dǎo)致了正常細(xì)胞的惡變。隨著后基因時(shí)代的到來和日益發(fā)展，人們?cè)絹碓缴羁痰恼J(rèn)識(shí)到，生物體除了具有編碼遺傳信息外，還存在大量隱藏在DNA序列之中或之外的遺傳信息，這些非編碼RNA、DNA甲基化和組蛋白共價(jià)修飾系統(tǒng)共同構(gòu)成的組蛋白密碼等，統(tǒng)稱為表觀遺傳學(xué)信息 [1]。 此種遺傳方式稱為表觀遺傳方式，而研究表觀遺傳方式的學(xué)科稱之為表觀遺傳學(xué)[2]。表觀遺傳有三個(gè)特點(diǎn)①可遺傳性；②可逆的基因表達(dá)調(diào)節(jié)；③沒有DNA序列的變化或者不能用DNA序列變化來解釋。表觀遺傳的研究的具體內(nèi)容主要包括：DNA甲基化、基因印記、DNA甲基化與轉(zhuǎn)座子的穩(wěn)定性、組蛋白共價(jià)修飾、染色質(zhì)重塑、假基因、基因組中的非編碼RNA、微小RNA、反義RNA、內(nèi)含子、核糖開關(guān)。

2.1 DNA甲基化

對(duì)于不同腫瘤細(xì)胞的DNA分析表明，惡性腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)基因突變的概率要大大低于預(yù)期[3]而在轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)檢測(cè)結(jié)腸直腸癌中由啟動(dòng)子高甲基化引起的基因表達(dá)的抑制，發(fā)現(xiàn)高達(dá)5%的已知基因在腫瘤細(xì)胞中發(fā)生了異常的啟動(dòng)子高甲基化[4]。因此我們可以推測(cè)，與基因突變相比，DNA甲基化改變?cè)诩?xì)胞惡變過程中可能發(fā)揮了更大的作用。

眾所周知，p53基因是一個(gè)重要的抑癌基因，對(duì)于畸變、損傷的細(xì)胞可引發(fā)其凋亡程序，使細(xì)胞發(fā)生凋亡，50%的惡性腫瘤中存在p53基因的沉默失活[5]。p53基因編碼區(qū)的甲基化狀態(tài)很容易發(fā)生脫氨基作用而發(fā)生5mCT的轉(zhuǎn)換。同時(shí)，INK4a/ARF基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化可以使p14ARF 表達(dá)下降，導(dǎo)致原來受p14ARF 抑制的MDM2表達(dá)上升，從而結(jié)合p53并使其發(fā)生蛋白質(zhì)水平的講解，進(jìn)而幫助細(xì)胞逃避p53引起的細(xì)胞凋亡[6]。近年來研究結(jié)果表明，肝癌細(xì)胞中端粒酶陽性率高達(dá)84%，明顯高于癌旁組織、肝硬變組織及慢性肝炎組織，而正常肝臟組織沒有端粒酶活性。端粒酶的重要成分人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）的活性與端粒酶活性高度相關(guān)。次研究中的肝細(xì)胞系L02中hTERT啟動(dòng)子有甲基化修飾，其mRNA低水平表達(dá)，經(jīng)5’-aza-dC去甲基化處理，hTERT mRNA可被上調(diào)，端粒酶活性也隨之上升，其mRNA高表達(dá)亦不受5’-aza-dC影響[7]。由此我們可以認(rèn)為hTERT mRNA的低表達(dá)與啟動(dòng)子甲基化修飾相關(guān)，從而導(dǎo)致惡性腫瘤的無限復(fù)制。鈣結(jié)合蛋白（S100A4）是S100A家族中的一個(gè)成員，在結(jié)腸，胃，胰腺，乳腺等惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，并與腫瘤細(xì)胞的侵襲，轉(zhuǎn)移以及不良的預(yù)后有關(guān)，它能調(diào)控產(chǎn)生降解細(xì)胞外基質(zhì)的酶，有利于細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)侵襲擴(kuò)散，是單個(gè)的惡變細(xì)胞穿過細(xì)胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)移到毛細(xì)血管和淋巴道。Xie R等研究表明，在子宮內(nèi)膜中，S100A4過表達(dá)時(shí)由于啟動(dòng)子區(qū)低甲基化造成的[8]。位于線粒體的BCL-2相關(guān)蛋白BNIP3，也是一個(gè)凋亡因子，可誘使缺氧損傷的細(xì)胞凋亡，但是BNIP3的啟動(dòng)子區(qū)域也包含有CpG島，發(fā)生惡性變的細(xì)胞BNIP3啟動(dòng)子區(qū)高甲基化會(huì)引起該基因的沉默，那么細(xì)胞液就可以逃避缺氧時(shí)的凋亡[9]。

2.2 組蛋白

組蛋白甲基化的失平衡與人類許多腫瘤相關(guān)，比如常見的乳腺癌、前列腺癌、肝癌等。失平衡的出現(xiàn)導(dǎo)致與這些惡性腫瘤相關(guān)的抑癌基因或者癌基因平衡的改變。眾所周知，EB病毒感染與鼻咽癌及Burkitt淋巴瘤的發(fā)生息息相關(guān)，其中EBNA2是EB病毒的核心抗原之一，LMP1（潛伏期膜蛋白1）是已確認(rèn)的EB病毒編碼蛋白，有促癌的作用，二者在EB病毒相關(guān)的鼻咽癌及Burkitt淋巴瘤的發(fā)生中，主要在原始B淋巴細(xì)胞的分化和增殖過程中起作用。而最近的研究表明，組蛋白的甲基化的改變可導(dǎo)致EBNA2和LMP1基因轉(zhuǎn)錄能力的異常，從而影響EB病毒感染潛伏期細(xì)胞的致癌潛能。Chau等研究發(fā)現(xiàn)，EB病毒Ⅰ期潛伏期細(xì)胞中的H3K9高甲基化導(dǎo)致EBNA2和LMP1基因轉(zhuǎn)錄的抑制，致使其致癌能力下降。而H3K4的甲基化導(dǎo)致EBNA2和LMP1基因轉(zhuǎn)錄的激活，使得EB病毒Ⅲ期潛伏細(xì)胞致癌潛能提高。組蛋白去乙酰化酶能取出賴氨酸殘基上的乙?；?，是基因表達(dá)沉默，由此可見組蛋白的異常去乙?；赡茉从谝阴；柑禺愋韵陆?故組蛋白去乙?；傅母淖円鸾M蛋白活性的改變從而導(dǎo)致基因表達(dá)的沉默，如果這個(gè)沉默基因是抑癌基因，那么就會(huì)引起惡性腫瘤的發(fā)生.

2.3 基因印記

H19是位于人11p15.5染色體區(qū)域的印記型基因，可能是一種與腫瘤發(fā)生呈負(fù)相關(guān)的基因。11p15.5是人類最大的基因基因簇集區(qū)域之一，近年來的研究表明H19與腎母細(xì)胞瘤、胚胎性橫紋肌肉瘤呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)[10]。 并且H19基因在高分化侵襲力弱的腫瘤細(xì)胞中不表達(dá)，而在低分化高侵襲力的腫瘤細(xì)胞中大量表達(dá)。葡萄胎中當(dāng)H19基因丟失會(huì)增加惡性傾向的的發(fā)生機(jī)率[11]。Li[12] 報(bào)道了肝癌和肝胚胎瘤都有IGF2的啟動(dòng)子和LOI（Loss of Imprinting）的表達(dá)異常。IGF2在我們?nèi)祟愑兴膫€(gè)啟動(dòng)子，其中啟動(dòng)子Ⅰ是非印記基因，主要是啟動(dòng)非等位基因的表達(dá)，例如人肝臟IGF2的表達(dá)。而啟動(dòng)子Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ是印記化基因，可以啟動(dòng)單等位基因的表達(dá)，主要在胚胎期具有活性。如果成年肝臟出現(xiàn)P2、P3和P4的激活表達(dá)，并且伴隨LOI的出現(xiàn)，則與肝癌的發(fā)生密不可分。如果胚胎期的IGF2發(fā)生了LOI則大大提高了發(fā)生肝胚胎細(xì)胞瘤的可能性。由此可見基因印記的發(fā)生與其發(fā)育的不同階段對(duì)于腫瘤類型以及發(fā)生有不同的影響，也就是具有發(fā)育階段的特異性。

2.4 微小RNA

Yanaihara等[13]研究發(fā)現(xiàn)，肺癌腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞比較有43種微小RNA的差異，28種表達(dá)下降，15種表達(dá)上升，這些變化的微小RNA大部分處于基因的缺失、擴(kuò)增、轉(zhuǎn)位的高發(fā)區(qū)域。其中49%的微小RNA在復(fù)發(fā)的和沒有復(fù)發(fā)的非小細(xì)胞肺癌中出現(xiàn)表達(dá)差異。由此我們可知，特殊的微小RNA表達(dá)譜可以預(yù)測(cè)肺癌的預(yù)后情況。馬兆龍等[14] 利用實(shí)時(shí)定量PCR及微小RNA芯片技術(shù)檢測(cè)乙肝病毒相關(guān)性肝癌組織、乙肝肝硬化組織、人類正常肝臟細(xì)胞中的微小RNA表達(dá)譜的差異，發(fā)現(xiàn)乙肝相關(guān)性肝癌組織、乙肝肝硬化組織兩者與正常的肝細(xì)胞的微小RNA相比較，前兩者的表達(dá)超過正常2倍的微小RNA有6個(gè)，下調(diào)超過2倍的微小RNA有8個(gè)。與正常肝細(xì)胞相比有明顯差異的微小RNA，在乙肝肝硬化和乙肝病毒相關(guān)肝癌中在表達(dá)量上無明顯差別。故推測(cè)微小RNA表達(dá)的出現(xiàn)可能表明了這一病理進(jìn)程：乙肝病毒感染肝硬化肝癌的必然進(jìn)程，而微小RNA的表達(dá)的出現(xiàn)是此進(jìn)程的使動(dòng)因素。Kota等[15]研究表明，恢復(fù)在肝細(xì)胞肝癌中表達(dá)下調(diào)的微小RNA的表達(dá)水平可以抑制腫瘤的進(jìn)一步發(fā)展。由此進(jìn)一步證實(shí)了，微小RNA在惡性腫瘤發(fā)生中的重要作用

3.結(jié)語

綜上所述，DNA甲基化、組蛋白、基因印記、微小RNA等表觀遺傳修飾的異常在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中有著不可或缺的作用。由此我們可以據(jù)此對(duì)惡性腫瘤的早期診斷，治療以及預(yù)后的判斷。由于部分表觀遺傳修飾的可逆性，對(duì)于惡性腫瘤的治療，一些甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑和去乙酰化抑制劑在臨床中的良好的治療效果，要求我們對(duì)于各種表觀遺傳修飾與腫瘤病因之間關(guān)系仍需要進(jìn)行深入研究，從而明確腫瘤發(fā)生過程中的重要靶標(biāo).更好的做好早期篩查和診斷，以及治療，為此更好地為惡性腫瘤的診斷治療提供更好的理論基礎(chǔ)途徑。我們相信，隨著表觀遺傳學(xué)以及惡性腫瘤等相關(guān)學(xué)科的深入研究，表觀遺傳修飾將成為惡性腫瘤篩查，早期診斷以及靶向治療提供新的科研途徑。

參考文獻(xiàn)：

[1] 薛京倫.表觀遺傳學(xué)：原理、技術(shù)與實(shí)踐[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2006

[2] 吳超群.表觀遺傳學(xué)和人類疾病[J].2006，13（3）：112-119

[3] Thomas R K，Baker A C，DeBiasi R M，et al. High-throughput oncogene mutation profiling in human cancer[J]. Net Genet，2007，39（3）：347-351.

[4] Schuebel K E，Chen W，Cope L，et al. Comparing the DNA hypermethylome with gene mutations in human colorectal cancer [J]. PLoS Genet，2007，3（9）：e157.

[5] Levine A J.p53，the cellular gatekeeper for growth and

[6] Yin D，Xie D，Hofmann W K，et al. Methylation，expression，and mutation analysis of the cell cycle control genes in human brain tumors[J]. Oncogene，2002，21（54）：8372-8378.

[7] 李正友，張長(zhǎng)松，郭獻(xiàn)靈，等. DNA去甲基化對(duì)肝細(xì)胞人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄上調(diào)的研究[J]. 中國(guó)腫瘤臨床，2007，34（2）：61-64.

[8] Xie R，Loose DS，Shipley Gl，et al. Hypomethylation-induced expression of S100A4 in endometrial carcinoma[J]. Mod Pathol，2007，20（10）：1045-1054.

[9] Murai M ，Toyota M，Suzuki H，et al. Aberrant methylation and silencing of the BNIP3 gene in colorectal and gastric cancer[J]. Clin Cancer Res，2005，11（3）：1021-1027.

[10] Hao Y，Crenshaw T，Moulton T，et al.Tumor-suppressor activity of H19 RNA.Nature，1993，365：764-767

[11] Franklin GC，Adam GIR，Ohlsson R，Genomic imprinting and mammalian development.Placenta，1996，17：13-14

[12] Li X，Adam G，Cui H，et al.Expression，promoter usage and parental impeinting status of insulin-like growth factor Ⅱ（IGF2）in human hepatoblastoma： uncoupling of IGF2 and H19 imprinting[J].Oncogene，1995，11（2）：221

[13] Patnaik SK，Kannisto E，Knudsen S，et al.Evaluation of microRNA expression profiles that may predict recurrence of localized stageⅠnon-small cell lung cancer after surgical resection[J].Cancer Res，2010，70（1）：36-45

第5篇：表觀遺傳學(xué)主要研究范文

隨著對(duì)白血病發(fā)病機(jī)制的深入研究及其治療方案的改進(jìn),白血病的完全緩解率也有明顯的提高,但仍有一部分患者最終會(huì)復(fù)發(fā)。近年來的研究發(fā)現(xiàn), 白血病的復(fù)發(fā)與微小殘留病密切相關(guān)。微小殘留病(minimal residual disease, MRD )是指經(jīng)過誘導(dǎo)治療達(dá)臨床緩解時(shí)，白血病患者體內(nèi)殘留的少量白血病細(xì)胞。對(duì)患者進(jìn)行微小殘留病監(jiān)測(cè)對(duì)白血病的治療和預(yù)后判斷具有非常重要的意義。檢測(cè)MRD的關(guān)鍵是尋找分子基因標(biāo)志。細(xì)胞免疫表型及遺傳學(xué)的異常改變?cè)诩毙园籽RD 檢測(cè)中占有重要地位。令人遺憾的是，這些方法只適用于少數(shù)患者，大多數(shù)患者并不具備遺傳學(xué)的預(yù)后指標(biāo)。隨著對(duì)急性白血病分子生物學(xué)發(fā)病機(jī)制研究的進(jìn)步，人們把急性白血病的發(fā)生歸結(jié)為抑癌基因和原癌基因通過遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)機(jī)制的發(fā)生異常改變［1］。DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，其與腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及檢測(cè)相關(guān)機(jī)制的研究逐步成為研究的熱點(diǎn)。表觀遺傳學(xué)生物標(biāo)記（Epigenetic biomarkers），特別是DNA 甲基化相關(guān)標(biāo)記檢測(cè)擁有遺傳學(xué)標(biāo)記、抗體等標(biāo)志不具備的優(yōu)勢(shì)。本文就MRD細(xì)胞分子遺傳學(xué)的檢測(cè)方法及DNA甲基化檢測(cè)MRD的臨床應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 常用白血病MRD檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

1.1 分子生物學(xué)方法：遺傳學(xué)的改變，包括染色體易位/缺失、基因突變等是白血病發(fā)生的基礎(chǔ)，其所導(dǎo)致的正常基因表達(dá)調(diào)控紊亂和功能異常是白血病發(fā)生的主要原因。異常的遺傳學(xué)改變，已成為急性白血病臨床檢驗(yàn)資料的重要組成部分。

實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)( RQ-PCR ) 方法結(jié)合了PCR和熒光探針兩種技術(shù)，通過定量檢測(cè)白血病細(xì)胞中標(biāo)志性基因?qū)崟r(shí)觀測(cè)MRD，是目前檢測(cè)MRD最為敏感的方法，靈敏度可達(dá)10-4-10-5，已成為臨床實(shí)驗(yàn)室建立MRD檢測(cè)方法的首選。其檢測(cè)的基因標(biāo)志包括：（1）染色體異位形成的融合基因。如t(9:22), t(15;17),inv(16), and t(8;21)，T 細(xì)胞受體（T-cell receptor ，TCR）重排等，常見的融合基因包括: TEL /AML1、BCR /ABL、E2A /PBX1、MLL /AF4等。（2）在白血病中表達(dá)增高的腫瘤基因(如PRAME、 WTI 、PRAME、NPM1、STC- 1 等基因。（3）發(fā)生突變的基因(如FLT3 /ITD)。融合基因直接反映了白血病的病理特征,他在疾病發(fā)展過程中比較穩(wěn)定,以其作為PCR檢測(cè)MRD的分子標(biāo)志具有特異性強(qiáng)、敏感度高的優(yōu)點(diǎn)［2］。但是這些檢查不僅價(jià)格昂貴，其檢測(cè)的標(biāo)本為RNA，存在不易保存，結(jié)果不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。更令人遺憾的是,由于白血病是一組異質(zhì)性很大的惡性血液病，各亞型之間遺傳背景不同，這些遺傳學(xué)基因標(biāo)志只能覆蓋1/3的白血病類型，還有2/3類型的白血病不具備遺傳學(xué)基因標(biāo)志，無法在臨床上進(jìn)行MRD的檢測(cè)。即使聯(lián)合應(yīng)用多種基因仍有40%～50%的患者無法找到適當(dāng)?shù)幕驑?biāo)志檢測(cè)MRD，使其疾病狀態(tài)缺乏準(zhǔn)確的判斷依據(jù)。

1.2流式細(xì)胞術(shù)( FCM)：FCM是通過檢測(cè)在正常細(xì)胞上不表達(dá)或低表達(dá)而在白血病細(xì)胞上表達(dá)或高表達(dá)的白血病相關(guān)免疫表型來定量檢測(cè)MRD，能夠準(zhǔn)確定量殘留白血病細(xì)胞數(shù)，并且還能了解殘留白血病細(xì)胞的凋亡情況［3］。其優(yōu)勢(shì)是每秒可檢測(cè)5 000～10 000個(gè)細(xì)胞,并能用計(jì)算機(jī)記錄處理,快速地對(duì)各個(gè)細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)定量分析,靈敏度達(dá)到10- 4。但應(yīng)用此法必須要對(duì)患者初發(fā)時(shí)的免疫表型特征有詳盡了解,以便選擇適當(dāng)?shù)臉?biāo)志檢測(cè)MRD。因?yàn)榘籽〖?xì)胞與正常細(xì)胞相比, 通常低達(dá)10- 5～10- 6, 可能低于FCM檢測(cè)范圍而使這種方法缺乏特異性; 而且隨著病程發(fā)展, 細(xì)胞表面的抗原發(fā)生改變, 會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

2 異常DNA甲基化檢測(cè)白血病MRD的臨床研究進(jìn)展

DNA甲基化是指在DNA序列不變的情況下，通過影響基因轉(zhuǎn)錄活性以調(diào)控基因的表達(dá)。DNA甲基化作為一種表觀遺傳學(xué)改變與白血病的發(fā)生密切相關(guān)，在不改變遺傳信息的前提下導(dǎo)致細(xì)胞遺傳特性改變，作為腫瘤性疾病"二次打擊"經(jīng)典假說的重要補(bǔ)充，已成為白血病研究的新熱點(diǎn)。DNA異常高甲基化導(dǎo)致抑癌基因的失活在白血病發(fā)生發(fā)展、診斷、監(jiān)測(cè)微小殘留病、預(yù)測(cè)病情以及指導(dǎo)治療方面都有重要作用，這些表觀遺傳學(xué)標(biāo)志作為MRD監(jiān)測(cè)標(biāo)志物的臨床研究逐漸引起大家的關(guān)注。

P15基因甲基化與白血病的關(guān)系目前研究最為深入。73%～93%的急性髓系白血病(AML)和57%的急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患者發(fā)生p15基因高甲基化，且持續(xù)p15基因高甲基化預(yù)示疾病復(fù)發(fā)。與p15基因甲基化患者相比，p15基因非甲基化患者5年DFS明顯延長(zhǎng)（15% v 62.5%；p＝0.02）［4］。

Au等［5］檢測(cè)了l7例t-MDS/AMI 患者，l5例存在pl5甲基化。其中5例在發(fā)展為治療相關(guān)的t-MDS/AML前即已存在pl5甲基化，最早為兩年前。提示pl5甲基化發(fā)生在t-MDS/AMI 早期，檢測(cè)p15甲基化有助于判斷預(yù)后、指導(dǎo)治療。在一組65例急性早幼粒細(xì)胞白血病的研究中，31例存在p15甲基化的患者5年無病生存率僅為29．64％ ，顯著低于34例無甲基化的患者79%。p15基因甲基化與預(yù)后不良相關(guān)。

Id4和zo-1是我室新發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)血液系統(tǒng)相關(guān)候選基因，并對(duì)其在白血病發(fā)生、復(fù)發(fā)中的作用及應(yīng)用于MRD檢測(cè)進(jìn)行了系列基礎(chǔ)與臨床研究。

采用MS-PCR的方法對(duì)完全緩解期白血病患者骨髓標(biāo)本檢測(cè)id4基因甲基化狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）58例完全緩解的急性白血病人MRD的檢出率為41%，MRD陽性的患者12個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)率為62.5%，而非甲基化的患者12個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)率僅為10%。（2）16例異基因外周血干細(xì)胞移植后的白血病患者中，5例檢測(cè)到MRD的患者中有4例在1年的隨訪期出現(xiàn)復(fù)發(fā)，而11例移植后MRD持續(xù)陰性的患者無一例復(fù)發(fā)。

研究對(duì)26例完全緩解的急性白血病患者進(jìn)行zo-1基因甲基化檢測(cè)，MRD檢出率為34.6%，MRD陽性的患者12個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)率為57.1%，而非甲基化的患者12個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)率僅為15.4%，MRD陽性病人復(fù)發(fā)率明顯高于陰性者。Id4和zo-1基因甲基化檢測(cè)可能成為急性白血病新的生物標(biāo)記用于預(yù)測(cè)疾病的預(yù)后以及復(fù)發(fā)。

隨著PCR 技術(shù)的進(jìn)步，將實(shí)時(shí)定量PCR（real-time PCR）與MSP 結(jié)合提高了甲基化分析檢測(cè)的特異性和敏感性。高敏感性的甲基化定量PCR為MRD檢測(cè)開辟了另一種解決方法。甲基化定量水平的變化對(duì)于細(xì)胞修復(fù)、腫瘤預(yù)后、腫瘤化療后的耐藥等提供了新的研究指標(biāo)，可以從另一個(gè)層面上揭示其發(fā)生機(jī)制。因此，甲基化定量PCR技術(shù)被應(yīng)用與臨床各領(lǐng)域的研究。

Shuchi等［6］以啟動(dòng)子區(qū)高甲基化狀態(tài)的雌激素受體α（estrogen receptor α;ER-α）和 p15INT4B 基因做為MRD標(biāo)志，采用定量甲基化特異性PCR對(duì)180例急性白血病患者骨髓標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）臨床緩解期的AML患者中, ER-α和p15INT4B基因啟動(dòng)子區(qū)呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)的患者較低甲基化狀態(tài)的患者有更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，而且ER-α和p15INT4B基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平的增高與患者無病生存期（disease free survival,DFS）縮短有明顯相關(guān)性。（2）對(duì)5名兒童ALL患者ER-α基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度進(jìn)行了自誘導(dǎo)緩解后的追蹤檢測(cè)，結(jié)果提示疾病復(fù)發(fā)狀態(tài)較緩解狀態(tài)ER-α基因啟動(dòng)子甲基化水平增加。其結(jié)果與目前常用的MRD監(jiān)測(cè)標(biāo)志TCR/免疫球蛋白重排水平結(jié)果基本一致。

另一研究以啟動(dòng)子區(qū)高甲基化狀態(tài)的p73、p15、p57KIP2基因?yàn)镸RD標(biāo)志，通過對(duì)199例Ph染色體和MLL陰性的處于完全緩解狀態(tài)（complete remission,CR）的成人ALL標(biāo)本進(jìn)行定量甲基化特異性PCR檢測(cè)，研究結(jié)果提示p73基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與第一次CR持續(xù)時(shí)間及無病生存期（DFS）及總生存期（overall survival, OS）縮短間有顯著相關(guān)性［7］。因此，特定基因的定量甲基化PCR檢測(cè)有可能成為一種評(píng)估急性白血病復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)及MRD檢測(cè)的有效手段。

結(jié)語

白血病作為一種惡性腫瘤，復(fù)發(fā)是影響其患者生存的主要問題?；颊唧w內(nèi)白血病微量殘留病是復(fù)發(fā)的主要根源，對(duì)患者進(jìn)行微量殘留病監(jiān)測(cè)在白血病的治療和預(yù)后判斷中具有非常重要的意義。遺憾的是，由于絕大多數(shù)患者缺乏明確的遺傳標(biāo)記作為早期檢測(cè)和準(zhǔn)確評(píng)估MRD的標(biāo)志，在臨床上常因治療不足導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)或治療過度引起嚴(yán)重并發(fā)癥，絕大多數(shù)患者在發(fā)病后1~3年內(nèi)死亡。因此，要在白血病MRD早期檢測(cè)和指導(dǎo)治療上有所突破，就必須尋找能夠早期診斷白血病MRD的特異性強(qiáng)、通用性好的分子標(biāo)志物。DNA 甲基化作為腫瘤相關(guān)標(biāo)記，與遺傳學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞表面抗體等標(biāo)志具有更多的優(yōu)勢(shì)。首先，臨床常規(guī)的腫瘤標(biāo)記檢測(cè)以蛋白或者RNA為對(duì)象，必須采集新鮮樣本以確定檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。而甲基化檢測(cè)則以DNA 為樣本，很容易從各種體液中，甚至石蠟包埋組織中得到，極大地?cái)U(kuò)展了研究資源。其次，甲基化以DNA作為研究對(duì)象，較RNA 和蛋白更穩(wěn)定，更容易保存。進(jìn)而保證了檢測(cè)結(jié)果的可靠性。因此，DNA甲基化定量水平的變化對(duì)于腫瘤預(yù)后、腫瘤化療后的耐藥等提供了新的研究指標(biāo)，可以從另一個(gè)層面上揭示其發(fā)生機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

［1］ KrugU, GanserA, KoefflerHP. Tumor suppressor genes nnormal and m alignant hematopoiesis. Oncogene 2002; 21: 3475-95.

［2］ Mitelman F, Johansson B, Mertens F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nat Rev Cancer, 2007, 7:233-245.

［3］ Szczepaski T, van der Velden VH, van Dongen JJ. Flow-cytometric immunophenotyping of normal and m alignant lymphocytes. Clin Chem Lab Med, 2006, 44: 775-796.

［4］ Teofili L, Martini M, Luongo M, et al. Hypermethylation of CpG islands in the promoter region of p15(INK4b) in acute promyelocytic leukemia represses p15(INK4b) expression and correlates with poor prognosis. Leukemia 2003;17:919-24.

［5］ Christiansen DH, Andersen MK, Pedersen-Bjergaard J. Methylation ofp15INK4B is common, is associated with deletion of genes on chromosome arm 7q and predicts a poor prognosis in therapy-related myelodysplasiaandacute myeloid leukemia. Leukemia 2003;17: 1813-9.

［6］ Shuchi A, Matthias U, Steffen K, et al. DNA Methylation of TumorSuppressor Genes in Clinical Remission Predicts the Relapse Risk in Acute Myeloid Leukemia. Cancer Res 2007 ,Feb,671: 1370-1377.

第6篇：表觀遺傳學(xué)主要研究范文

齡成為可能。作為表觀遺傳學(xué)重要組成部分的dna甲基化，在機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老的過程中存在著動(dòng)態(tài)變化過程．通過

檢測(cè)dna甲基化改變，有望構(gòu)建與之相關(guān)的年齡變化模式，用以推斷個(gè)體年齡。本文著重介紹dna甲基化水平的改變與

個(gè)體年齡的相關(guān)性及其在判斷個(gè)體年齡方面的前景。

【關(guān)鍵詞】法醫(yī)物證；dna甲基化；年齡推斷；生物體衰老

【中圖分類號(hào)】d9l9．2

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】a

【文章編號(hào)】1007—9297(20__)04—0284—05

當(dāng)前在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，對(duì)個(gè)體年齡的推斷主要是

依據(jù)人類學(xué)方法測(cè)量骨骼、牙齒等一些具有年齡相關(guān)

性的檢材．并根據(jù)相關(guān)模型進(jìn)行計(jì)算。分子生物學(xué)的

飛速發(fā)展，開拓了人們的視野。借助于分子生物學(xué)理

論和方法．在細(xì)胞水平、分子水平發(fā)現(xiàn)一些可能與年

齡相關(guān)的遺傳學(xué)改變，如dna損傷修復(fù)能力、端粒的

長(zhǎng)度、線粒體片段的缺失、dna甲基化水平、b一半乳糖

苷酶活性以及基因表達(dá)譜等。lll dna甲基化是表觀遺

傳學(xué)(epigenetics)的重要組成部分，在維持正常細(xì)胞

功能、遺傳印記、胚胎發(fā)育以及人類腫瘤發(fā)生中起著重

要作用．在衰老的過程中某些細(xì)胞會(huì)發(fā)生年齡相關(guān)的

變化，121例如某個(gè)cpg島的從頭甲基化會(huì)關(guān)閉一個(gè)基

因，使這個(gè)基因相關(guān)的生理功能喪失：同樣。甲基化的

丟失也會(huì)激活正常情況下沉默的基因．造成不恰當(dāng)?shù)?/p>

異位表達(dá)(ectopic expression)。必須指出，表觀遺傳研

究絲毫沒有降低遺傳學(xué)或基因組學(xué)的重要性，恰恰相

反，表觀遺傳學(xué)是在以孟德爾式遺傳為理論基石的經(jīng)

典遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)母體中孕育的專門研究基因功

能實(shí)現(xiàn)的一種特殊機(jī)制的遺傳學(xué)分支學(xué)科。認(rèn)識(shí)到表

觀基因組在發(fā)育、生長(zhǎng)和衰老過程中存在著一個(gè)動(dòng)態(tài)

變化的過程，以及體細(xì)胞的表觀基因組有重新編程的

可能性，有助于我們以新的觀點(diǎn)來探索衰老的機(jī)制，構(gòu)

建年齡變化的模式。本文就dna甲基化與個(gè)體年齡的

相關(guān)性及其在判斷個(gè)體年齡方面的前景進(jìn)行探討。

一

、概述

(一)表觀遺傳學(xué)和dna甲基化

遺傳學(xué)是與表觀遺傳學(xué)(genetic)相對(duì)應(yīng)的概念。

遺傳學(xué)是指基于基因序列改變所致基因表達(dá)水平變

化，如基因突變、基因雜合丟失和微衛(wèi)星不穩(wěn)定等；而

表觀遺傳學(xué)則是指基于非基因序列改變所致基因表

達(dá)水平變化，如dna甲基化和染色質(zhì)構(gòu)象變化等：表

觀基因組學(xué)(epigenomics)~0是在基因組水平上對(duì)表觀

遺傳學(xué)改變的研究。甲基化是最重要的表觀遺傳修飾

形式。dna甲基化是生物體在dna甲基化轉(zhuǎn)移酶

(dnmts)的作用下，以s一腺苷酰一l一甲硫氨酸(sam)

為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到特定堿基上去的過程，

dna甲基化多發(fā)生在胞嘧啶，大多在一cpg一序列上。

胞嘧啶由此被修飾為5甲基胞嘧啶(5-methylcytosine．

5-mc)。這種dna修飾方式并沒有改變基因序列。但

它調(diào)控了基因的表達(dá)。

哺乳動(dòng)物中．cpg序列在基因組中出現(xiàn)的頻率僅

有l(wèi)％，遠(yuǎn)低于基因組中的其他核苷酸序列。但在基因

組的某些區(qū)域中，cpg序列密度很高，可以達(dá)均值的5

倍以上，成為鳥嘌呤和胞嘧啶的富集區(qū)．形成所謂

cpg島。通常cpg島大約含有500多個(gè)堿基。在哺乳

動(dòng)物基因組中約有4萬個(gè)cpg島，而且只有cpg島

的胞嘧啶能夠被甲基化，cpg島通常位于基因的啟動(dòng)

子區(qū)或是第一個(gè)外顯子區(qū) 。人類基因組中大小為

100～l 000 bp左右且富含cpg二核苷酸的cpg島總

是處于未甲基化狀態(tài)．并且與56％的人類基因組編碼

基因相關(guān)。人類基因組序列草圖分析結(jié)果表明，人類

基因組cpg島約為45 000個(gè)．大部分染色體每1 mb

就有5—15個(gè)cpg島。平均值為每mb含lo．5個(gè)cpg

島，cpg島的數(shù)目與基因密度有良好的對(duì)應(yīng)關(guān)系。健

康人基因組中．cpg島中的cpg位點(diǎn)通常是處于非甲

基化狀態(tài)，而在cpg島外的cpg位點(diǎn)則通常足甲基化的。這種

甲基化的形式在細(xì)胞分裂的過程中能夠穩(wěn)定的保留。閣基因

調(diào)控元件(如啟動(dòng)子)所含cpg島中的5-mc會(huì)阻礙

[作者簡(jiǎn)介]李鑫(1974一)，男，山東淄博人，主檢法醫(yī)師，碩士研究生，主要從事法醫(yī)遺傳學(xué)研究。

法律與醫(yī)學(xué)雜志20__年第l3卷(第4期)

轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體與dna的結(jié)合，所以dna甲基化一

般與基因沉默(gene silence)相關(guān)聯(lián)；而去甲基化

(demethylation)往往與一個(gè)沉默基因的重新激活(re．

activation)相關(guān)聯(lián)。當(dāng)機(jī)體衰老或呈病理狀態(tài)，特別是

腫瘤發(fā)生時(shí)，抑癌基因cpg島以外的cpg序列非甲

基化程度增加，而cpg島中的cpg則呈高度甲基化，

以至于染色體螺旋程度增加及抑癌基因表達(dá)的丟失。

一般說來，dna的甲基化對(duì)維持染色體的結(jié)構(gòu)、x染

色體的失活、基因印記和腫瘤的發(fā)生發(fā)展都起重要的

作用。【6】

(二)dna甲基化的生物作用及特點(diǎn)

1．dna甲基化與基因表達(dá)

dna甲基化在維持正常細(xì)胞功能、遺傳印記、胚

胎發(fā)育過程以及衰老過程中起著極其重要的作用。研

究表明胚胎的正常發(fā)育得益于基因組dna適當(dāng)?shù)募?/p>

基化。例如：缺少任何一種甲基轉(zhuǎn)移酶對(duì)小鼠胚胎的

發(fā)育都是致死性的。[31此外，等位基因的抑制被印記控

制區(qū)(icrs)所調(diào)控，該區(qū)域在雙親中的一個(gè)等位基因

是甲基化的。17]印記基因的異常表達(dá)可以引發(fā)伴有突

變和表型缺陷的多種人類疾病。甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄

主要通過以下機(jī)制來實(shí)現(xiàn)。

(1)直接抑制。cpg島甲基化真接干擾tf與調(diào)控

區(qū)dna 的結(jié)合． 例如camp反應(yīng)元件結(jié)合蛋白

(creb)，ap一2，e2f，nfkb等tf不能與相應(yīng)的dna

位點(diǎn)相結(jié)合。但有些tf如sp1，ctf與甲基化和非甲

基化位點(diǎn)都能結(jié)合，這表明甲基化單獨(dú)不足以阻止體

內(nèi)tf與dna相結(jié)合。

(2)間接機(jī)制。近年來發(fā)現(xiàn)一些甲基化dna結(jié)合

蛋白如mdbp1，mdb2以及甲基化cpg結(jié)合蛋白如

mecp1，mecp2與甲基化dna特異結(jié)合，抑制基因轉(zhuǎn)

錄。其介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制的程度取決于甲基化密度和啟動(dòng)

子的強(qiáng)度。如低密度甲基化可完全抑制一些弱的啟動(dòng)

子，但對(duì)強(qiáng)的啟動(dòng)子則收效甚微。

(3)dna甲基化還可通過影響染色體結(jié)構(gòu)來抑制

轉(zhuǎn)錄。不僅甲基化啟動(dòng)子區(qū)形成的核小體抑制體外起

始轉(zhuǎn)錄，而且mecp1與甲基化啟動(dòng)子cpg位點(diǎn)結(jié)合

后，可引起染色質(zhì)聚縮成非活性高級(jí)結(jié)構(gòu)，以至于轉(zhuǎn)

錄因子不能與其相結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)錄。

dna甲基化狀態(tài)并非固定不變．在許多哺乳動(dòng)物

組織內(nèi)，基因組甲基脫氧胞嘧啶水平隨老化而下降，

在鮭魚、小鼠、大鼠、牛與人類的腦、肝臟、大腸粘膜、

心臟和脾臟內(nèi)發(fā)現(xiàn)dna脫甲基化作用。相反，大鼠肺

則不發(fā)生脫甲基化，大鼠。腎內(nèi)甲基脫氧胞苷總含量增

加。這說明甲基化狀態(tài)隨老化而變化，即發(fā)生甲基化

· 285 ·

和脫甲基化，但總的說來，最常見的變化似乎是進(jìn)行

性的脫甲基化。這些變化均可導(dǎo)致隨老化而發(fā)生的基

因表達(dá)變化。

2．dna甲基化與腫瘤的關(guān)系

研究表明，dna甲基化在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起

重要作用。甲基化狀態(tài)的改變是引起腫瘤的一個(gè)重要

因素，這種變化包括dna甲基化總體水平降低和啟

動(dòng)子等基因表達(dá)調(diào)控元件附近的cpg島局部甲基化

水平的異常升高，從而導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定(如染色

體的不穩(wěn)定、可移動(dòng)遺傳因子的激活、原癌基因的表

達(dá))和抑癌基因的不表達(dá)。如果抑癌基因中有活性的

等位基因失活，則發(fā)生癌癥的幾率提高，例如：胰島素

樣生長(zhǎng)因子一2(igf一2)基因印記丟失導(dǎo)致多種腫瘤，

如wilm‘s瘤?！?j

3．dna甲基化與基因印記

基因組印記是性細(xì)胞系的一種表觀遺傳修飾，這

種修飾有一整套分布于染色體不同部位的印記中心

來協(xié)調(diào)。印記中心直接介導(dǎo)了印記標(biāo)記的建立及其在

發(fā)育全過程中的維持和傳遞，并導(dǎo)致以親本來源特異

性方式優(yōu)先表達(dá)兩個(gè)親本等位基因中的一個(gè)．而使另

一個(gè)沉默?；蚪M印記是可遺傳的，dna的甲基化在

基因組印記的分子機(jī)理中充當(dāng)重要角色。dna高甲基

化是一個(gè)基因印記抑制信號(hào)，dna甲基化對(duì)控制印記

基因中父子和母子等位基因的不同表達(dá)具有重要作

用。[91

4．人類基因組dna甲基化的特點(diǎn)

dna甲基化的基本特征有：1)數(shù)量多、信息容量

大；2)可遺傳性：有絲分裂時(shí)分化細(xì)胞可以穩(wěn)定地將

甲基化模式傳遞給子代細(xì)胞：3)相對(duì)穩(wěn)定性，即在體

內(nèi)．內(nèi)外環(huán)境短時(shí)間變化不會(huì)引起細(xì)胞基因組甲基化

譜的改變；4)與snp標(biāo)記毗鄰，提供不同層次信息，相

互補(bǔ)充。人類基因組dna甲基化還有自身特點(diǎn)。

(1)時(shí)空特異性。dna甲基化是記錄細(xì)胞分化歷

史、維持組織特異性基因表達(dá)的主要機(jī)制之一。有學(xué)

者認(rèn)為，dna甲基化可能使分化細(xì)胞基因組重新編

程，通過dna 甲基化來控制基因的時(shí)空表達(dá)，調(diào)節(jié)發(fā)

育過程和各種生理反應(yīng)。在不同組織或同一類型細(xì)胞

的不同發(fā)育階段，基因組dna上各cpg位點(diǎn)甲基化

狀態(tài)的差異構(gòu)成基因組dna甲基化譜。組織特異的

dna甲基化譜是哺乳動(dòng)物基因組的一個(gè)顯著特征。

細(xì)胞之間dna甲基化模式的差異是在個(gè)體發(fā)育

的過程中逐步形成的，并在以后的有絲分裂中保持不

變。在胚胎發(fā)育過程中，細(xì)胞的甲基化模式按一定方向

發(fā)生有規(guī)律地變化。成年個(gè)體，組織特異性基因形成組

· 286 ·

織特異性的甲基化模式。隨著年齡增長(zhǎng)，基因組dna甲

基化總體水平不斷下降．特定dna片斷的甲基化程度

可以增高或降低。取決于組織細(xì)胞和基因種類。

(2)親緣特異性。在某些基因座，所有組織體細(xì)胞

都選擇性地將親代一方的等位基因甲基化．呈現(xiàn)親緣

依賴的等位基因甲基化模式。

(3)病理特異性。在病理狀態(tài)下，組織細(xì)胞的dna

甲基化譜發(fā)生特異性的改變。dna甲基化改變?cè)谠S多

腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。目前證實(shí)，啟

動(dòng)子高甲基化是腫瘤抑制基因第三種常見的失活途徑。

二、dna甲基化與年齡相關(guān)性

分化細(xì)胞的穩(wěn)定性是高等生物的基本特征之一。

然而，在衰老過程中某些細(xì)胞會(huì)發(fā)生年齡相關(guān)的變

化。例如，某種cpg島的從頭甲基化會(huì)關(guān)閉一個(gè)基因，

喪失與這個(gè)基因相關(guān)的生理功能；同樣．甲基化的喪

失也會(huì)激活正常情況下沉默的基因，造成不恰當(dāng)?shù)漠?/p>

位表達(dá)。2o世紀(jì)8o年代初，wilson等測(cè)定了體外培養(yǎng)

的人、田鼠及小鼠成纖維細(xì)胞dna的5 甲基胞嘧啶

含量，發(fā)現(xiàn)均隨細(xì)胞分裂次數(shù)的增加而降低．且下降

速度以人、田鼠、小鼠的次序遞減．而永生化細(xì)胞系的

5 甲基胞嘧啶含量則保持相對(duì)穩(wěn)定。以dna甲基化

酶抑制劑5 氮雜胞苷或5 氮脫氧胞苷處理人二倍

體成纖維細(xì)胞或某些腫瘤細(xì)胞，可使其增殖能力下

降，體外培養(yǎng)壽限縮短。因此，dna甲基化水平也可以

作為細(xì)胞分裂的“計(jì)時(shí)器”。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)基因組

整體甲基化水平有隨齡降低的趨勢(shì)。

在基因組整體甲基化水平降低的同時(shí)，衰老過程

中也伴有個(gè)別基因甲基化水平增高的現(xiàn)象。最早證明

與年齡相關(guān)啟動(dòng)子cpg島的甲基化是人結(jié)腸組織雌

激素受體(estrogen receptor，er)基因，年輕個(gè)體中，幾

乎檢測(cè)不到er基因的甲基化，以后，隨齡逐漸升高。

另外。胰島索樣生長(zhǎng)因子2(insulinlike growth facror，

igf2)、肌原調(diào)節(jié)蛋白myod1、體覺誘發(fā)電位組分

n33基因啟動(dòng)子cpg島的甲基化水平在正常的結(jié)腸

組織中同樣隨齡升高。tra等用限制性界標(biāo)基因組掃

描技術(shù)對(duì)t淋巴細(xì)胞20__個(gè)基因座的甲基化年齡變

化情況進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)29個(gè)基因座有變化，其中23

個(gè)增加，6個(gè)降低。也許．這些特定基因的甲基化是更

好的衰老生物學(xué)標(biāo)志。

陳培利等_10]利用人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞(hu

man fetal lung diploid fibroblasts。2bs)進(jìn)行體外培養(yǎng)。

發(fā)現(xiàn)其p16基因啟動(dòng)子區(qū)及外顯子i處的dna甲基

化水平隨個(gè)體細(xì)胞代齡的增加而降低。他們首先將

2bs細(xì)胞在體外作常規(guī)傳代培養(yǎng)(規(guī)定3o代齡以內(nèi)為

法律與醫(yī)學(xué)雜志20__年第l3卷(第4期)

年輕細(xì)胞，55代齡以上為衰老細(xì)胞，在31至54代齡

之問位中年細(xì)胞)。然后用有機(jī)法提取細(xì)胞dna，取各

組dna各llxg加入sinai約40u，25~c酶切過夜(smai

不具備甲基化修飾作用)。然后對(duì)p16基因外顯子i

及13-actin進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

ll 二| ’。_ lll

l | _ __?一_l＼

‘l ＼_ _l’ _li ＼

_l＼ il 、

l i、

4 _ li 0_ _l

年輕細(xì)胞中年j田胞老年細(xì)胞

圍1不同代齡2bs細(xì)胞p16外顯于pcr擴(kuò)增條帶的吸光度掃描值【’。

寰1 不同代齡2bs細(xì)胞pl6外丑于l殛i~-actinpcr擴(kuò)增條帶的吸

光度掃描值

組別 n

灃：#以b—actin的值校正后結(jié)果；t檢驗(yàn)，與年輕細(xì)胞相比， p<o．05

實(shí)驗(yàn)結(jié)果(參見表1)表明，不同代齡2bs細(xì)胞

p16基因外顯子i上的擴(kuò)增產(chǎn)物均低于相對(duì)的未酶切

的b—actin對(duì)照組，且其dna甲基化水平隨代齡的增

加而趨于降低，在年輕細(xì)胞中甲基化水平約為64％．

而在衰老細(xì)胞中僅為24％，降低約40％。在之后的研

究中，陳培利等在以2bs為模型的衰老研究中發(fā)現(xiàn)，

細(xì)胞分裂一次端區(qū)(即端粒)縮短50bp，抑制dna甲

基化則可導(dǎo)致細(xì)胞早衰。?】他們測(cè)定了去甲基化處理

后的2bs細(xì)胞的端區(qū)長(zhǎng)度．研究表明老年2bs細(xì)胞衰

老表型更加明顯，端區(qū)長(zhǎng)度較對(duì)照細(xì)胞縮短，而年輕

細(xì)胞則變化不顯著。從而推斷甲基化的改變可以影響

染色質(zhì)的構(gòu)象，從而可能改變端區(qū)結(jié)合蛋白與dna

的作用l1 1，后者可以進(jìn)一步引起端區(qū)長(zhǎng)度改變。

三、dna 甲基化檢測(cè)方法

隨著對(duì)甲基化研究的不斷深入，各種各樣甲基化

檢測(cè)方法被開發(fā)出來以滿足不同類型研究的要求。

dna甲基化可以從甲基化含量、甲基化水平、甲基化

模式和甲基化圖譜分析等多種途徑進(jìn)行分析。甲基化

含量分析5mc在基因組中所占的總體比例：甲基化水

2 1 8 6 4 2 0

l n n

瓔輟 越

法律與醫(yī)學(xué)雜志20__年第13卷(第4期)

平分析單個(gè)cpg胞嘧啶甲基化的發(fā)生率，若同時(shí)分析

多個(gè)cpg位點(diǎn)，則可以制作甲基化水平圖譜；甲基化模

式分析一段單鏈dna上一組cpg的甲基化狀態(tài)組合。

根據(jù)研究目的，甲基化檢測(cè)方法分為：基因組整體水平

的甲基化檢測(cè)，特異位點(diǎn)甲基化的檢測(cè)和尋找新甲基化

位點(diǎn)。從研究所用的處理方法不同分為：基于pcr的甲

基化分析方法；基于限制性內(nèi)切酶的甲基化分析方法；

基于重亞硫酸鹽的分析方法和層析法等。[31以下歸納

總結(jié)了主要的甲基化分析方法以及相關(guān)特性。

(一)基因組整體水平甲基化分析

高效液相色譜柱(hplc)及相關(guān)方法。hplc是一

種比較傳統(tǒng)的方法，能夠定量測(cè)定基因組整體水平

dna甲基化水平。它由kuo等1980年[131首次報(bào)道。

過程是將dna樣品先經(jīng)鹽酸或氫氟酸水解成堿基，

水解產(chǎn)物通過色譜柱，結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品比較，用紫外光

測(cè)定吸收峰值及其量，計(jì)算5mc／(5mc+5c)的積分面

積就得到基因組整體的甲基化水平。oefner等1992

年提出變性高效液相色譜法(dhplc)用于分析單核

苷酸和dna分子。鄧大君等20__年i141將其改進(jìn)與

pcr聯(lián)用建：立了一種檢測(cè)甲基化程度的dhplc分析

方法。將重亞硫酸鹽處理后的產(chǎn)物進(jìn)行差異性擴(kuò)增。

由于原甲基化的在重亞硫酸鹽處理時(shí)仍被保留為胞

嘧啶，因此原甲基化的在pcr擴(kuò)增時(shí)，其變性溫度也

相應(yīng)上升。使pcr產(chǎn)物在色譜柱中保留的時(shí)間明顯延

長(zhǎng)．這樣就可以測(cè)定出pcr產(chǎn)物中甲基化的情況。

這種方法的最明顯優(yōu)點(diǎn)是：可用于高通量混合樣

本檢測(cè)．能夠明確顯示目的片段中所有cpg位點(diǎn)甲基

化的情況．但不能對(duì)甲基化的cpg位點(diǎn)進(jìn)行定位。

其他基因組水平甲基化分析還有sssi甲基轉(zhuǎn)移

酶法，免疫化學(xué)法，氯乙醛法等。各具優(yōu)缺點(diǎn)。

(二)特異性位點(diǎn)的dna 甲基化的檢測(cè)

1．甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶(ms—re—pcr／

southern)法

這種方法利用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶對(duì)甲

基化區(qū)的不切割的特性．將dna消化為不同大小的

片段后再進(jìn)行分析。 這是一種經(jīng)典的甲基化研究方

法，其優(yōu)點(diǎn)是：相對(duì)簡(jiǎn)單，成本低廉，甲基化位點(diǎn)明確，

實(shí)驗(yàn)結(jié)果易解釋；

2．甲基化特異性的pcr(ms—pcr)

herman等[161 1996年在使用重亞硫酸鹽處理的基

礎(chǔ)上新建的一種方法。它將dna先用重亞硫酸鹽處

理。這樣未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，而甲基?/p>

的不變。隨后行引物特異性的pcr。檢測(cè)msp擴(kuò)增產(chǎn)

物．如果用針對(duì)處理后甲基化dna鏈的引物能擴(kuò)增

· 287 ·

出片段，則說明該被檢測(cè)的位點(diǎn)存在甲基化；若用針對(duì)

處理后的非甲基化dna鏈的引物擴(kuò)增出片段．則說明

被檢測(cè)的位點(diǎn)不存在甲基化(見圖2)。[15·17]

． ／

5’衄_{2盈__ 平 盈3． 5-啪__曩墨|_唧h _霉疊__甲3·

— __． —

p1．m ri 一 一

圖2甲基特異性的pcr擴(kuò)增(ms—pcr)示意i莩i。dna經(jīng)重亞硫酸鹽處

理后。以處理后的產(chǎn)物作為模板．加入甲基化特異性的引物(primer 1)

或非甲基化的引物(primer¨)．進(jìn)行特異性的擴(kuò)增(如圖所示)，只有結(jié)

合完全的甲基化或非甲基化特異性引物的片段才能擴(kuò)增出產(chǎn)物。[1s,1

(三)尋找新甲基化位點(diǎn)

1．限制性標(biāo)記基因組掃描(rlgs)

costello等20__年報(bào)道的rlgs[ 81能對(duì)整個(gè)基因

組的甲基化狀態(tài)進(jìn)行分析．發(fā)現(xiàn)新甲基化基因的方

法。這種方法聯(lián)合使用了限制性內(nèi)切酶及二維電泳。

其過程是：先用甲基化敏感的稀頻限制性內(nèi)切酶not

i消化基因組dna，甲基化位點(diǎn)保留，標(biāo)記末端、切

割、行一維電泳，隨后再用更高頻的甲基化不敏感的

內(nèi)切酶切割。行二維電泳，這樣甲基化的部分被切割

開并在電泳時(shí)顯帶，得到rlgs圖譜與正常對(duì)照得出

缺失條帶即為甲基化的可能部位。

2．聯(lián)合甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶的mb(com．

pare—ms)

srinivasan yegnasubramaniant 91 20__年報(bào)道了一

種新方法compare—ms．該法將mbd柱層析法與

ms—re聯(lián)用?；パa(bǔ)了各自單用的弊處，能夠快速、敏感

的檢測(cè)dna甲基化情況(見圖3)。[19j

四、甲基化型分析的優(yōu)勢(shì)以及存在的問題

(一)甲基化作為檢測(cè)對(duì)象的優(yōu)勢(shì)

1．甲基化型既能反映有關(guān)基因功能狀態(tài)及與此相

連的多種疾病相關(guān)的豐富信息。叉具有簡(jiǎn)單的“二元

化”性質(zhì)，即令甲基化為“0”，非甲基化為“1”，就可以進(jìn)

行數(shù)字化處理，便于開展大規(guī)模和自動(dòng)化監(jiān)測(cè)分析。

2．dna分子十分穩(wěn)定。有可能將它和dna的snp

分析等置于同一個(gè)技術(shù)平臺(tái)。同時(shí)它又比rna和蛋白

質(zhì)更便于保存和運(yùn)輸。并可對(duì)已經(jīng)石蠟、甲醛或乙醇預(yù)

· 288 ·

_f 簟

圖3 聯(lián)臺(tái)甲基化敏豫性限制性內(nèi)切酶的mbd (compare-ms)示

意圍。用甲基化以外的位點(diǎn)的內(nèi)切酶ia酶)與甲基化敏雅的內(nèi)切酶(b

酶)聯(lián)用．則甲基化的dna鏈不被切開。非甲基化的切開．再行mbd

捕獲存在甲基化位點(diǎn)的dna片段。最后行實(shí)時(shí)pcr擴(kuò)增并分析。f刪

處理的樣本進(jìn)行分析，可以開發(fā)歷史上儲(chǔ)備的病理學(xué)資

料。

(二)存在的問題

目前還未找到dna甲基化改變與年齡之間的精

確的量化關(guān)系式。雖然人們對(duì)個(gè)體細(xì)胞的衰老及其基

因甲基化水平的改變有了初步的了解．但還在研究探

索二者之問的精確的量化關(guān)系。[201對(duì)使用dna甲基

化改變來推斷個(gè)體年齡的大小，仍需要進(jìn)行大量的研

究和調(diào)查。

(三)付諸于實(shí)踐之前還必須解決的問題

1．確定表觀遺傳修飾與特定生理指標(biāo)的相關(guān)性：

2證實(shí)將這些指標(biāo)作為鑒別診斷的潛在可能性和

技術(shù)可行性：

3．通過一定規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查來驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室內(nèi)

的表觀遺傳生理及病理發(fā)現(xiàn)在人群中的真實(shí)性。

五、dna甲基化在法醫(yī)學(xué)中判定個(gè)體年齡上的展

望

目前，研究dna甲基化水平改變與個(gè)體年齡的

相關(guān)性尚處于試驗(yàn)階段，但已引起許多學(xué)者的關(guān)注。

人類表觀基因組協(xié)會(huì)(human epigenome con—sortium，

hec)于20__年1o月正式宣布開始投資和實(shí)施人類

表觀基因組 計(jì)劃(human epigenome project，hep)。

dna甲基化已經(jīng)成為表觀遺傳學(xué)和表觀基因組學(xué)的

重要研究?jī)?nèi)容，hep的最終目標(biāo)是就要確認(rèn)這些dna

甲基化位點(diǎn)在人類基因組的分布與頻率，以指導(dǎo)和系

統(tǒng)研究dna甲基化在人類表觀遺傳、胚胎發(fā)育、基因

印記等發(fā)揮的作用。 借助于該計(jì)劃的實(shí)施和分子生

物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，在法醫(yī)實(shí)踐中可以通過調(diào)查各年齡

段人群基因組dna甲基化分布以及相關(guān)頻率，建立

相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)模型，將來有望成為法醫(yī)個(gè)體年齡判定的

一項(xiàng)重要的生物學(xué)指標(biāo)。(感謝西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附

法律與醫(yī)學(xué)雜志20__年第l3卷(第4期)

屬醫(yī)院婦產(chǎn)科、環(huán)境與疾病相關(guān)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鄭鵬生教授

和顧婷婷同學(xué)的支持和幫助。)

參考文獻(xiàn)

【1 j 馬宏，張宗玉，童坦君．衰老的生物學(xué)標(biāo)志[j】．生理科學(xué)進(jìn)展，20__，

33：65—69

[2】陳朝飛，房靜遠(yuǎn)．衰老的表觀遺傳修飾研究[j】．上海醫(yī)學(xué)，20__，29

(1)：58～60

【3】dahlc，guldbergp．dnamethylationanalysistechniques[j】．biogerontology，

20__，4(4)：233~250

【4 ] bird a p．cpg—rich islands and the function ofdna methylation[j]．

nature，1986，321：209~231

【5 j depamphilis ml，zorbas h．identifying 5一methyic 08ine and related

modifications in dna genomes[j】．nucleic acids res．1998，26(10)：

2255～2264

[6】 黃慶，郭穎，府偉靈．人類表觀基因組計(jì)劃[jj’生命的化學(xué)，20__，24

(2)：101~102

[7】董玉瑋，侯進(jìn)慧，朱必才，等．表觀遺傳學(xué)的相關(guān)概念和研究進(jìn)展叨．

生命的化學(xué)，20__，22(1)：1~3

[8】feinberg a p，tycko b．the history of cancer epigeneticⅲ．nat rev

cancer，20__，4(2)：l43-153

[9】李素婷．真核生物dna甲基化狀態(tài)ⅲ．河北醫(yī)學(xué)，1999，5：85-88

[1o】 陳培利，童坦君，張宗玉．dna甲基化塒基因表達(dá)的影響及其在衰

老過程中的表現(xiàn)ⅲ．同外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊(cè)，20__，22：155~168

[il】毛澤斌，張宗 ，童坦軍．dna去甲基化對(duì)細(xì)胞衰老的影響【j1l生物

化學(xué)雜志，l997，l3(3)：318 32l

[12】lustig aj，kurtz s，shore d．involvement of the silencer and usa

binding protein rap1 in regulation of telomere length[j】．science，

l 990．250：549~553

[13】kuo k c，mccune r a，gehrke c w，et a1．quantitative reversed—

phase high performanceliquid chromatographic determination of ma—

jor and modified deoxyribonucleosides in dna ⅲ．nucleic acids

res．1980．8：4763~4776

[1 4j 鄧大君，鄧國(guó)仁，呂有勇，等．變性高效液相色譜法檢測(cè)cpg島胞

嘧啶甲基化ⅲ．中華醫(yī)學(xué)雜志，20__，81(3)：158~161

[15】朱燕．dna的甲基化的分析與狀態(tài)檢測(cè)ⅲ．現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，20__，

32(9)：1070~1073

[16】herman j g，graft j r，myohanen s，et a1．methylation—specific

pcr：a novel pcr assay for methylation status of cpg islands [j】．

proe natl acad sci usa，1996，93(18)，9821~9826

[1_7】沈佳堯，侯鵬，祭美菊，等．dna甲基化方法研究現(xiàn)狀[j】_生命的化

學(xué)．20__，23(2)：149~l5l

[1 8】hatada i，hayashizaki y，himtsune s，et a1．a(chǎn) genomic scanning

method for higher organisms using restriction sites∞landmarks [j]．

pmc natl acad sci usa，1991，88：9523—9527

[19】yegnasubramanian s，lin x，haffner m c，et a1．combination of

methylated—-dna precipitation and methylation—-sensitive restriction

enzymes(compare-ms)for the rapid。sensitive and quantitative

deleelion of dna methylation[j】．nucleic acids res，20__，34(3)：

el9

【20】lssa jp．a(chǎn)ging，dna methylation and cancer[jl，cri rev oncool hematol，

第7篇：表觀遺傳學(xué)主要研究范文

[關(guān)鍵詞] Beckwith-Wiedemann綜合征；表觀遺傳學(xué)；DNA甲基化；印記基因；Wilms腫瘤

[中圖分類號(hào)] R726.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] C [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）26-0155-03

表觀遺傳學(xué)是近年來醫(yī)學(xué)研究的新熱點(diǎn)，而Beckwith-Wiedemann 綜合征（BWS）是研究表觀遺傳學(xué)的代表性疾病之一。本病是一種罕見的先天性印記基因表達(dá)異常綜合征，印記基因最具特征的標(biāo)志是DNA 獲得甲基化和去甲基化，其致病基因位于第11 號(hào)的染色體短臂15.5 區(qū)域，以臍膨出、巨大舌和身體的一側(cè)生長(zhǎng)過剩為主要表現(xiàn)，臨床上還可見短暫性低血糖、面部鮮紅斑痣、內(nèi)臟肥大、腫瘤等其他表現(xiàn)。本文通過介紹我院收治的1例Beckwith-Wiedemann 綜合征患兒情況，以提高臨床醫(yī)生對(duì)本病臨床表現(xiàn)、診斷、發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 病例資料

患兒，女，36+1周早產(chǎn)，于2014年9月25日9：35于我院產(chǎn)科出生，患兒系第1胎第1產(chǎn)，順產(chǎn)，其母胎膜早破5 h，產(chǎn)前無宮內(nèi)窘迫，生后Apgar評(píng)分1 min、5 min均為10分，出生體重3600 g，羊水、臍帶未見異常，胎盤大，生后發(fā)現(xiàn)患兒舌大伴吐舌，為進(jìn)一步治療轉(zhuǎn)入我科。

母孕史：其母孕期規(guī)律產(chǎn)檢，孕29周時(shí)宮內(nèi)B超提示胎兒雙腎增大，孕34周時(shí)宮內(nèi)B超提示胎兒巨舌癥？家族史：父母體健，非近親結(jié)婚，否認(rèn)家族遺傳病病史及中毒、外傷史。

入院查體：體重：3550 g，身長(zhǎng)：50 cm，頭圍：33 cm，神清，精神反應(yīng)可，眼裂稍小，鼻梁低平，舌大，吐舌，哭聲響亮，婉轉(zhuǎn)有調(diào)，顏面可見紅斑，前囟平軟約1.5 cm×1.5 cm，左頂部可觸及2 cm×2 cm×3 cm血腫，心音有力，律齊，心前區(qū)未聞及雜音，兩肺呼吸音清，腹軟，腹正中劍突下至臍部可見一條狀隆起，哭鬧時(shí)明顯，臍根部粗大，肝肋下2 cm，質(zhì)軟邊銳，脾肋下未及，雙側(cè)肢體對(duì)稱，無偏身肥大，四肢肌張力正常。

輔助檢查：血尿便常規(guī)無異常，血生化無異常，TORCH（-），血胰島素（空腹）3.35 μIU/L（3.3～19.5 μIU/L），超聲心動(dòng)圖：房間隔缺損3 mm，繼發(fā)孔型。腹部B超：肝臟增大，雙腎增大，雙側(cè)腎盂分離。

小兒外科：臍疝，腹白線疝。皮膚科：面部鮮紅斑痣?？谇豢疲荷囿w良性肥大。

診治經(jīng)過：入院第2天出現(xiàn)血糖偏低（2.5 mmol/L），經(jīng)喂養(yǎng)糖水及奶、靜脈輸入葡萄糖，血糖恢復(fù)正常。住院期間每天均在空腹喂奶前有1～2次血糖偏低，經(jīng)加強(qiáng)喂養(yǎng)后血糖正常。

出院后隨訪：出生后40 d，混合喂養(yǎng)，血糖監(jiān)測(cè)正常。右側(cè)肢體較左側(cè)偏大（右上肢、下肢較左側(cè)長(zhǎng)0.5 cm，右下肢較左側(cè)粗0.5 cm），活動(dòng)好，肌張力正常，用力時(shí)腹中線部位膨隆。血AFP 257.6 ng/mL（

MS-MLPA結(jié)果：母源KvDMR去甲基化，母源H19甲基化或父源的單親二倍體。

2 討論

2.1 發(fā)病率及病因

第8篇：表觀遺傳學(xué)主要研究范文

【關(guān)鍵詞】 輔助生殖技術(shù)；妊娠早期；染色體異常

DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2017.04.042

近年來， 助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology， ART）V泛用于治療不孕問題， 相關(guān)研究顯示[1]， 發(fā)達(dá)國(guó)家每年有≥3%的輔助生殖技術(shù)出生兒， 輔助生殖技術(shù)為不孕家庭帶來了福音。自然流產(chǎn)是一種人類優(yōu)勝劣汰的自然選擇結(jié)果， 發(fā)生自然流產(chǎn)的幾率為15%， 在全部流產(chǎn)中占75%的比例， 導(dǎo)致自然流產(chǎn)的主要原因是染色體異常（夫妻染色體異常與胚胎染色體異常）。近30年來， 輔助生殖技術(shù)得到了高速發(fā)展， 但有相關(guān)報(bào)道指出[2， 3]， 輔助生殖技術(shù)致早期妊娠流產(chǎn)率較高， 為此， 本院對(duì)400例流產(chǎn)患者進(jìn)行了絨毛細(xì)胞分離和染色體分析， 現(xiàn)做如下報(bào)告。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2015年1月～2016年1月本院收治的孕早期流產(chǎn)患者400例， 將其中320例自然妊娠孕早期自然流產(chǎn)患者作為對(duì)照組， 80例因輔助生殖技術(shù)致妊娠的孕早期自然流產(chǎn)患者作為觀察組。觀察組患者年齡22～43歲， 平均年齡（33.6±3.3）歲， 孕周7～12周；對(duì)照組患者年齡25～44歲， 平均年齡（31.2±5.2）歲， 孕周7～12周。兩組患者一般資料比較， 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）， 具有可比性。在告知兩組患者實(shí)驗(yàn)過程及目的后， 均表示愿意參加實(shí)驗(yàn)并簽署知情同意書， 實(shí)驗(yàn)獲得了醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1. 2 方法 先提取絨毛細(xì)胞， 對(duì)流產(chǎn)的患者進(jìn)行子宮清宮術(shù)， 備好負(fù)壓吸引管， 清宮時(shí)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程， 采用負(fù)壓吸引管利用負(fù)壓原理， 吸附絨毛組織5～20 mg。將這5～20 mg絨毛組織作為標(biāo)本， 放入生理鹽水中浸泡， 并立即送入中心實(shí)驗(yàn)室備檢。標(biāo)本送達(dá)后， 立對(duì)絨毛組織標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng)， 采用雙抗清洗法清洗標(biāo)本， 去污物（血塊、蛻膜組織）， 保留典型的絨毛組織約10 mg， 將清洗后的標(biāo)本放入離心管置入離心機(jī)進(jìn)行離心操作， 離心結(jié)束后觀察管內(nèi)分層， 去除上層的液體， 在下層滴入生物酶（膠原酶、胰酶）， 將標(biāo)本放入保溫箱， 仔細(xì)觀察并記錄， 待出現(xiàn)絨毛散開現(xiàn)象時(shí)， 立即滴入母牛血清， 采用電子顯微鏡觀察絨毛細(xì)胞形態(tài)。當(dāng)視野中出現(xiàn)成片狀細(xì)胞， 將標(biāo)本放入新鮮的培養(yǎng)液中并滴入生物堿（秋水仙素）， 再次放置在保溫箱內(nèi)， 放置時(shí)間為4 h， 然后去掉上層清夜， 將標(biāo)本置入水浴箱， 2 h后取出， 將標(biāo)本放入離心機(jī)再次離心， 將離心后的標(biāo)本去上清液制成懸液， 通過萊卡顯微鏡進(jìn)行觀察， 選擇兩名醫(yī)生同時(shí)讀標(biāo)本玻片， 每例計(jì)算20個(gè)分裂象， 分析2個(gè)核型（嵌合體加倍計(jì)數(shù)）。

1. 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn)。P

2 結(jié)果

觀察組患者中

3 討論

輔助生殖技術(shù)是治療不孕不育的一種手段， 有體外受精-胚胎移植（IVF-ET）、卵子體外成熟（IVM）、人工受精（AI） 等形式[4]。根據(jù)WTO的相關(guān)數(shù)據(jù)顯示[5-9]， 我國(guó)的不孕癥發(fā)病率高達(dá)15%， 傳統(tǒng)的治療遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足日益增長(zhǎng)的不孕不育患者的治療需要。

自然流產(chǎn)是妊娠過程中常見的并發(fā)癥， 而染色體異常則是自然流產(chǎn)的主要原因之一， 包括夫妻染色體異常和胚胎染色體異常[10-12]。夫婦染色體異常常見的有平衡易位和羅伯遜易位， 胚胎染色體異常常見的有三倍體、多倍體及染色體平衡易位、嵌合體等。與自然流產(chǎn)相比， 輔助生殖技術(shù)妊娠不增加妊娠早期流產(chǎn)率， 但是與流產(chǎn)孕婦的年齡存在著一定的關(guān)系。本研究通過對(duì)流產(chǎn)的患者進(jìn)行子宮清宮術(shù)， 清宮時(shí)采用負(fù)壓吸引管利用負(fù)壓原理， 取出絨毛組織5～20 mg作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本， 將其放入生理鹽水中浸泡， 然后對(duì)絨毛組織標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng)， 采用雙抗清洗法清洗標(biāo)本， 去除血塊及蛻膜組織， 保留典型的絨毛組織， 進(jìn)行離心操作， 觀察標(biāo)本現(xiàn)象。發(fā)現(xiàn)自然妊娠孕早期自然流產(chǎn)患者的絨毛細(xì)胞染色體異常率與輔助生殖技術(shù)致妊娠早期自然流產(chǎn)患者的絨毛細(xì)胞染色體異常率無明顯差異（P>0.05）， 但是不同年齡間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

相關(guān)研究顯示[2]， 輔助生殖技術(shù)能影響表觀遺傳（印記基因）的調(diào)控， 影響胚胎植入和胎兒生長(zhǎng)等， 表觀遺傳學(xué)方面的異常能使胚胎停育， 基因印記缺陷會(huì)導(dǎo)致早期妊娠的不穩(wěn)定易發(fā)生流產(chǎn)[1]?？刂菩哉写倥怕堰^程中， 大劑量促性腺激素的使用， 可能是引起配子及胚

胎印記異常， 輔助生殖技術(shù)實(shí)施時(shí)間正處于印跡重建的窗口期， 運(yùn)用于當(dāng)中的操作會(huì)對(duì)配子及胚胎的甲基化狀態(tài)發(fā)生一定的影響。

本文研究結(jié)果顯示， 觀察組患者中

綜上所述， 輔助生殖技術(shù)并不增加妊娠早期流產(chǎn)胚胎染色體異常的發(fā)生率， 但絨毛細(xì)胞染色體異常與育齡婦女的年齡有明顯的關(guān)系， 年紀(jì)≥40歲的患者采用輔助生殖技術(shù)妊娠更容易導(dǎo)致妊娠早期流產(chǎn)。

參考文獻(xiàn)

[1] 孔舒， 賴煒強(qiáng)， 衛(wèi)冠輝， 等. 輔助生殖技術(shù)致妊娠的早期流產(chǎn)絨毛染色體異常分析. 廣東醫(yī)學(xué)， 2015， 36（17）：2722-2724.

[2] 段程穎， 李紅， 劉敏娟， 等. 輔助生殖技術(shù)治療后自然流產(chǎn)胚胎的遺傳學(xué)分析及其臨床效應(yīng). 國(guó)際生殖健康/計(jì)劃生育雜志， 2014（3）：162-164.

[3] 李躍萍， 徐雯， 黎明紅， 等. 輔助生殖技術(shù)治療后孕早期自然流產(chǎn)的絨毛細(xì)胞染色體分析. 昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2011， 32（5）：50-53.

[4] 李躍萍， 金松， 胡春霞. 自然妊娠與ART妊娠孕早期自然流產(chǎn)的絨毛細(xì)胞染色體分析. 中國(guó)婦幼保健， 2013， 28（23）：3819-3822.

[5] 董毅飛， 張征， 彭海英， 等. 3505例不育癥患者細(xì)胞遺傳學(xué)分析及其與輔助生殖技術(shù)臨床結(jié)局的關(guān)系.武漢大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）， 2012， 33（5）：742-745.

[6] 孔舒， 賴煒強(qiáng)， 衛(wèi)冠輝， 等. 輔助生殖技術(shù)致妊娠早期流產(chǎn)的絨毛細(xì)胞遺傳學(xué)分析. 中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志， 2015（11）：48-50.

[7] 董自江， 盧守蓮， 孫麗洲， 等. 輔助生殖妊娠流產(chǎn)與自然妊娠流產(chǎn)絨毛核型分析比較. 山東醫(yī)藥， 2013， 53（41）：78-80.

[8] 邵小光， 熊曙康， 馮麗云， 等. 輔助生殖技術(shù)中的早期流產(chǎn)胚胎染色體分析. 現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展， 2002， 11（4）：274-276.

[9] 吳彤華， 尹彪， 朱元昌， 等. 輔助生殖和自然妊娠中早期自然流產(chǎn)胚胎染色體數(shù)目異常的研究. 生殖與避孕， 2013， 33（10）： 658-664.

[10] 郭楠， 劉雨生， 周桂香， 等. 129例自然妊娠與ART術(shù)后妊娠早期流產(chǎn)胎兒絨毛染色體核型分析. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2013， 48（2）：163-166.

[11] 張燕， 張鳳， 周亞東， 等. 自然妊娠和ART妊娠早期流產(chǎn)絨毛細(xì)胞遺傳學(xué)檢查的臨床應(yīng)用價(jià)值. 南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2012（7）：937-941.

[12] 王磊， 邵小光， 李曉霞， 等. ICSI妊娠后流產(chǎn)與自然妊娠流產(chǎn)的絨毛染色體分析. 中國(guó)婦幼保健， 2008， 23（30）：4275-4276.

[13] 高瑞花， 雷寧， 倪郝， 等. ART中自然流產(chǎn)后胚胎染色體異常的初步研究. 廣東醫(yī)學(xué)， 2010， 31（19）：2486-2488.

[14] 胡曉東， 尹彪， 朱元昌， 等. 女性年齡與早期自然流產(chǎn)胚胎染色體數(shù)目異常的關(guān)系. 生殖與避孕， 2014， 34（9）：735-741.

第9篇：表觀遺傳學(xué)主要研究范文

【摘 要】目的：研究小鼠早期胚胎各發(fā)育階段組蛋白H3K4單和雙甲基化的變化過程。方法：準(zhǔn)備受孕母鼠，獲取小鼠各階段正常早期胚胎，通過4%多聚甲醛固定，0.4%triton透膜，0.1%牛血清白蛋白封閉，抗H3K4單雙甲基化一抗染色處理，二抗避光孵育后，利用免疫熒光技術(shù)，對(duì)各個(gè)階段早期胚胎組蛋白H3K4單和雙甲基化表達(dá)水平鑒定。結(jié)果：成功得到所需要的各發(fā)育階段的正常早期胚胎。發(fā)現(xiàn)：從1細(xì)胞胚胎到8細(xì)胞胚胎組蛋白H3K4單和雙甲基化表達(dá)水平整體呈下降趨勢(shì)，在1細(xì)胞胚胎達(dá)到最高，8細(xì)胞胚胎表達(dá)水平最低，桑葚胚和囊胚較8細(xì)胞胚胎表達(dá)水平又有所回升。結(jié)論：在早期胚胎發(fā)育過程中，組蛋白H3K4單和雙甲基化程度成逐漸下降趨勢(shì)。

【關(guān)鍵詞】小鼠早期胚胎；組蛋白H3K4；甲基化；表觀遺傳修飾

表觀遺傳是指DNA序列不發(fā)生變化但基因表達(dá)卻發(fā)生了可遺傳的改變［1］。這種改變是細(xì)胞內(nèi)除了遺傳信息以外其他可遺傳物質(zhì)發(fā)生的改變,即基因型未發(fā)生變化而表型卻發(fā)生了改變,且這種改變?cè)诎l(fā)育和細(xì)胞增殖過程中能穩(wěn)定傳遞［2-3］。其修飾方式主要有DNA甲基化，去甲基化和組蛋白乙?；Ｋ鼈儗?duì)于早期胚胎和配子的形成和發(fā)育、組織特異性基因的表達(dá)、大部分基因沉默(gene silencing)起關(guān)鍵作用，在正常細(xì)胞過程，比如雌性哺乳動(dòng)物X染色體失活，以及酵母中配對(duì)型位點(diǎn)的沉默方面也有重要作用［4］。

組蛋白修飾是表觀遺傳學(xué)里主要修飾方式之一，到目前為止，在組蛋白上至少發(fā)現(xiàn)有八種不同的修飾方式，我們了解比較多的是乙酰化、甲基化和磷酸化這樣比較小的共價(jià)修飾。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，H3K9的甲基化與基因的沉默有關(guān)，而H3K4的甲基化卻可以使基因活化且H3K4的甲基化可招募HP1或其同源物與之結(jié)合，從而使基因所在部位異染色質(zhì)化，這表明，組蛋白的甲基化可能與異染色質(zhì)的形成有關(guān)［9-11］。H3K4位點(diǎn)發(fā)生的甲基化可以激活基因的轉(zhuǎn)錄，其必須在H2B的123位賴氨酸呈現(xiàn)泛素化的狀態(tài)下進(jìn)行，根據(jù)以往研究表明，H3K4甲基化可能是轉(zhuǎn)錄發(fā)生的早期事件，由于這種修飾在多細(xì)胞動(dòng)物中是異常復(fù)雜的，因此研究H3K4單和雙甲基化的具體功能更具有重要的意義。

本實(shí)驗(yàn)中，我們研究了組蛋白H3K4單和雙甲基化對(duì)小鼠早期胚胎各階段動(dòng)力學(xué)變化過程, 有助于揭示表觀遺傳學(xué)對(duì)哺乳動(dòng)物早期胚胎基因表達(dá)、調(diào)控、遺傳的重要作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑：孕馬血清（PMSG）,購自寧波激素制品廠；人絨毛膜促性腺激素（HCG，寧波激素制品廠）；胰酶消化液（Sigma）；4%多聚甲醛（Sigma）；0.4%triton（Sigma）；0.1%BSA(牛血清白蛋白)；一抗（兔抗鼠H3K4單和雙甲基化，Abcam）；二抗（羊抗兔，Santa cruz）；PBS磷酸緩沖液。

1.3 小鼠的超數(shù)排卵及：選擇6～8周齡健康昆白小鼠，并進(jìn)行光照控制：6：00～ 2O：O0光照，2O：O0～6：00黑暗。16：00-17：OO時(shí)雌鼠腹腔注射PMSG10IU(寧波激素制品廠)，48h后再注射hCG10IU(寧波激素制品廠)，然后將其與雄鼠2：l合籠。次日早上8點(diǎn)之前檢查陰道栓，有乳白色或者黃色凍膠物（陰道栓）即確定為懷孕，見栓當(dāng)天上午確定為懷孕0.5天。同樣方法取分別懷孕0.5天, 1天, 1.5天, 2天,2.5-3天及3.5天的母鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 小鼠早期胚胎的獲?。喝》謩e懷孕0.5天, 1天, 1.5天, 2天,2.5-3天及3.5天的母鼠，將母鼠置于超凈工作臺(tái)上，對(duì)其進(jìn)行斷頸處理，用手術(shù)剪剪開腹部，暴露子宮。用鑷子和細(xì)針將子宮連同卵巢同其余組織分離，然后置于盛有PBS的培養(yǎng)皿內(nèi)。用無鈣鎂PBS洗滌3次，棄除表面殘余血跡。將培養(yǎng)皿置于倒置顯微鏡下，用細(xì)針分離卵巢和子宮周圍的脂肪組織。1細(xì)胞的獲?。河描囎庸潭ㄗ訉m一端，取細(xì)針戳破輸卵管的壺腹部，暴露1細(xì)胞，用自制吸取胚胎工具吸出胚胎，并將其吹入盛有PBS液的四孔板中。2-8細(xì)胞的獲?。杭羧ヂ殉玻描囎庸潭ㄗ訉m一端，另一手持5 ml注射器抽取PBS液，插入子宮，沖洗輸卵管，待胚胎被PBS液沖出后，用工具吸出胚胎，并將其吹入盛有PBS液的四孔板中。桑葚胚，囊胚的獲?。杭羧ポ斅压芎吐殉?，用鑷子固定子宮一端，另一手持5 ml注射器抽取PBS液，插入子宮，沖洗子宮，待胚胎被PBS液沖出后，用工具吸出胚胎，并將其吹入盛有PBS液的四孔板中。

1.5 染色與細(xì)胞組蛋白H3K4甲基化的檢測(cè)：除1細(xì)胞需經(jīng)過胰蛋白酶消化去掉胚胎上的顆粒細(xì)胞外，其余都同下步驟。用4%多聚甲醛固定胚胎30分鐘，然后用 0.4%triton 透膜20分鐘, 再用0.1%牛血清白蛋白（BSA）封閉30分鐘，每個(gè)步驟結(jié)束后都需要用PBS液清洗三遍，每次二分鐘。之后加一抗（兔抗鼠抗H3K4單或雙甲基化）4℃放置過夜，第二天上午用PBS液清洗干凈后再加帶有熒光標(biāo)記的二抗（羊抗兔FITC）避光孵育1小時(shí)。熒光顯微鏡下觀察、拍照。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 組蛋白H3K4單和雙甲基化修飾免疫熒光染色：檢測(cè)早期胚胎（1細(xì)胞至囊胚）H3K4單甲基化表達(dá)水平（圖1）

根據(jù)染色強(qiáng)度繪制出相對(duì)熒光強(qiáng)度曲線（圖2）。

從圖1和圖2可以觀察出，組蛋白H3K4修飾在早期胚胎階段大致上呈下降趨勢(shì)，在1細(xì)胞-8細(xì)胞期間較為明顯，在1細(xì)胞維持較高水平，到8細(xì)胞階段，其表達(dá)水平降到最低，隨后到桑葚胚和囊胚，表達(dá)水平又稍有所提高。

2.3 組蛋白H3K4雙甲基化修飾免疫熒光染色

同時(shí)檢測(cè)早期胚胎（1細(xì)胞至囊胚）H3K4單甲基化表達(dá)水平（圖3）。根據(jù)染色強(qiáng)度繪制出相對(duì)熒光強(qiáng)度曲線（圖4）。

從圖3和圖4可以觀察出，在小鼠早期胚胎發(fā)育的整個(gè)早期過程中，組蛋白H3K4修飾在早期胚胎階段大致上呈下降趨勢(shì)，在1細(xì)胞維持較高水平，到8細(xì)胞階段，其表達(dá)水平降到最低，隨后到桑葚胚和囊胚，表達(dá)水平又稍有所提高。但是與單甲基化修飾相比，亦可以發(fā)現(xiàn)，雙甲基化修飾的熒光信號(hào)強(qiáng)度要高于單甲基化，也就是說，對(duì)于組蛋白H3K4而言，雙甲基化比單甲基化更容易發(fā)生在早期胚胎中。

3 討論

組蛋白H3第4賴氨酸的甲基化作為共價(jià)修飾的方式之一, 可以發(fā)現(xiàn)H3K4甲基化是組蛋白修飾中的一個(gè)非常重要的方式,與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān),與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,現(xiàn)已成為表觀遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)。雖然體細(xì)胞克隆技術(shù)已經(jīng)在多種動(dòng)物中得以實(shí)現(xiàn),但克隆胚胎懷孕率低、出生后異常等問題,嚴(yán)重制約了體細(xì)胞克隆技術(shù)的開發(fā)應(yīng)用。有研究證實(shí),供體細(xì)胞核在受體卵母細(xì)胞中不完全或異常的表觀遺傳重編程是導(dǎo)致克隆胚胎發(fā)育異常的重要原因。組蛋白的共價(jià)修飾是重要的表觀遺傳修飾,具有復(fù)雜而廣泛的生物學(xué)功能。在正常生殖細(xì)胞發(fā)生和胚胎發(fā)育過程中,染色體要經(jīng)歷廣泛的DNA甲基化、去甲基化,核小體核心組蛋白也要通過各種共價(jià)修飾調(diào)節(jié)染色體功能,從而完成遺傳信息的傳遞和調(diào)控胚胎的發(fā)育［15］。目前,我們對(duì)早期胚胎組蛋白H3K4表達(dá)水平的動(dòng)力學(xué)變化過程還不是很清楚。本實(shí)驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)早期胚胎階段組蛋白H3K4單和雙甲基化表達(dá)大致呈下降趨勢(shì)，（圖2，圖4所示）在1細(xì)胞-8細(xì)胞期間較為明顯，但在8細(xì)胞階段，其表達(dá)水平降到最低，隨后到桑葚胚和囊胚，表達(dá)水平又稍有所提高。結(jié)果推斷，組蛋白甲基化信號(hào)在在1細(xì)胞時(shí)期維持了較高的水平，隨著胚胎的發(fā)育和分裂分化，由于配子本身基因的表達(dá)，使組蛋白甲基化的程度越來越低。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果可加深早期胚胎組蛋白修飾的重編程,為改善克隆效率提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

［1］Wolffe AP, MatzkeM A. Epigenetics: regulation through rep repession ［J］. Science, 1999, 286 (5439): 81～486.

［2］Lewin B．Gene Ⅷ．Perarson Prenc Hall press ［M］. 2004.

［3］Jaenisch R, Bird A. Epigenetic regulation of gene expression：how the genome integrates intrinsic and environmental signals ［J］. Nat Genet, 2003, 33(sup): 245～254.

［4］Li E. Chromatin histone modification and epigenetic reprogramming in mammalian development ［J］．Nat Rev Genet, 2002 , 3(9): 662～673.

［5］Lachner M, O Carroll D, Rea S, Mechtler K, Jenuwein T．Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins ［J］Nature, 2001, 410(6824): 116～120.

［6］Bannister A J, Zegerman P, Pattridge J F, Miska E A, Thomas J O, Allshire R C, Kouzarides T. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromodomain［J］. Nature, 2001, 410(6824): 120～124.

［7］Rong W, David M, Gilber W S. Heterochromatin，HP1 and methylation at lysine 9 of histone H3 in animal ［J］. Chromosoma, 2002, 111(1): 22～36.