基因重組精選(九篇)

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第1篇：基因重組范文

9月24日晚間，一則來(lái)自平安銀行的公告引爆資本市場(chǎng)。這則公告稱，董事會(huì)于9月21日收到董事長(zhǎng)肖遂寧、行長(zhǎng)理查德·杰克遜的辭呈，兩人的職位擬分別由平安集團(tuán)副董事長(zhǎng)孫建一及剛剛離職的民生銀行副行長(zhǎng)邵平接任。

一夜之間將相齊換，平安集團(tuán)二號(hào)人物孫建一進(jìn)駐銀行順理成章，而“空降”的新任行長(zhǎng)邵平則是民生銀行的“宿將”。令人意外的是，直至平安公告之后，民生銀行才發(fā)出公告，確認(rèn)邵平已從該行副行長(zhǎng)任上離職，在此之前無(wú)論是民生方面還是平安方面都沒(méi)有透出風(fēng)聲。本刊記者第一時(shí)間聯(lián)系肖遂寧和理查德·杰克遜，但兩人都對(duì)去職一事三緘其口。

該來(lái)的一天還是來(lái)了。

只不過(guò)，很多深發(fā)展老員工和資本市場(chǎng)都沒(méi)有預(yù)料到，如此重要的兩項(xiàng)人動(dòng)會(huì)在同一時(shí)間。這樣的組合，對(duì)于剛剛穩(wěn)定的平安銀行如何引入“平安”基因和“民生”兇悍作風(fēng)，帶來(lái)種種遐想。

平安嫡系

對(duì)于肖遂寧及理查德的去職，市場(chǎng)早有預(yù)期。平安銀行整合深發(fā)展進(jìn)程數(shù)年以來(lái)，深發(fā)展原副職至最近已經(jīng)換血完畢，原平安銀行相關(guān)高管陸續(xù)入掌深發(fā)展相關(guān)業(yè)務(wù)部門，行長(zhǎng)及董事長(zhǎng)一職的撤換也在情理之中。至此，在現(xiàn)任平安銀行的高管中，只有主管公司業(yè)務(wù)的副行長(zhǎng)胡躍飛是深發(fā)展的“老人”。

不過(guò)，新平安銀行董事長(zhǎng)和行長(zhǎng)兩大核心職位同時(shí)撤換，還是展現(xiàn)出平安一貫強(qiáng)勢(shì)的行事風(fēng)格，同時(shí)也標(biāo)志著平安全面主導(dǎo)時(shí)代正式到來(lái)。

此次變動(dòng)中，孫建一出任平安銀行董事長(zhǎng)一職并不意外。自從80年代被馬明哲從人保挖到平安之后，孫建一一直是馬的左膀右臂，過(guò)去平安通過(guò)幾步戰(zhàn)略逐漸組建起合并前的平安銀行的過(guò)程，孫建一也長(zhǎng)期扮演一線的操盤者，也曾擔(dān)任過(guò)合并前的平安銀行的董事長(zhǎng)。

孫建一在平安集團(tuán)內(nèi)部一直是“忠厚老者”的形象，為人柔和，處事平衡，擅于拿捏關(guān)系。在平安集團(tuán)當(dāng)年的多次關(guān)鍵性談判中，均是由他帶隊(duì)出席，并取得了不錯(cuò)的效果。

在此之前，由于馬明哲負(fù)責(zé)替集團(tuán)制定目標(biāo)和戰(zhàn)略，作為平安集團(tuán)副董事長(zhǎng)的孫則較多地把時(shí)間花在對(duì)外和具體業(yè)務(wù)的溝通協(xié)調(diào)上，在內(nèi)在外都是平安集團(tuán)的二把手。

在平安銀行整合深發(fā)展的過(guò)渡階段，孫建一在兩者的企業(yè)文化融合上所下功夫頗多。2011年，他就和深發(fā)展黨委書(shū)記王驥以黨建工作為名，一起跑遍了深發(fā)展的各個(gè)省級(jí)分行，意即安撫各位地方大員及“推銷”平安文化，減少進(jìn)一步整合可能引起的文化摩擦。

在他的努力下，平安深發(fā)展換標(biāo)一事最終朝著預(yù)想的方向前進(jìn)，并于今年8月順利走完了流程。

以孫建一作為新平安銀行的董事長(zhǎng)，不但是平安加強(qiáng)對(duì)銀行掌控的常規(guī)步驟，也顯示平安集團(tuán)對(duì)這塊目前受托資產(chǎn)管理規(guī)模萬(wàn)億以上的領(lǐng)域異?？粗亍?/p>

作為平安金控架構(gòu)最后完成整合的板塊，平安的一些其它部門諸如信托和產(chǎn)險(xiǎn)，都期待與平安銀行的深度合作，而孫建一正是充分釋放板塊協(xié)同效應(yīng)、提升平安銀行盈利能力的合適人選，其在集團(tuán)內(nèi)長(zhǎng)期積累的權(quán)威和擅于協(xié)調(diào)的個(gè)性也有助于銀行在平安的金融綜合協(xié)作大版圖中話語(yǔ)權(quán)的提升。

民生血統(tǒng)

與孫建一的順理成章相比，邵平的“空降”有些讓人驚訝。根據(jù)民生銀行8月底剛剛公布的半年報(bào)，作為民生排名第二的副行長(zhǎng)，邵平的任期原本至2015年。他亦擔(dān)任總行風(fēng)險(xiǎn)管理委員會(huì)主席一職，主要負(fù)責(zé)銀行的風(fēng)控工作。

從履歷上看，邵平可謂民生銀行名副其實(shí)的創(chuàng)業(yè)元老，1995年即參與民生銀行籌建，歷任信貸部總經(jīng)理、上海分行行長(zhǎng)、總行行長(zhǎng)助理，直至總行副行長(zhǎng)，并親身參與了股份制商業(yè)銀行的創(chuàng)建、改革、轉(zhuǎn)型、發(fā)展、壯大的全過(guò)程，資歷深厚。

根據(jù)一位民生員工的講述，可能與主管的是風(fēng)險(xiǎn)管理相關(guān)業(yè)務(wù)，邵平平日里為人比較低調(diào)，講話較少，“但還是比較有威信的?！?/p>

據(jù)知情人士透露，此前浦發(fā)銀行總行曾經(jīng)開(kāi)展過(guò)一輪行長(zhǎng)競(jìng)聘，邵平就是行長(zhǎng)候選人之一，但是因?yàn)榉N種原因未能成行，不過(guò)此番進(jìn)駐平安擔(dān)任行長(zhǎng)，也可以說(shuō)是“失之東隅，收之桑榆”。

事實(shí)上，現(xiàn)在回頭看來(lái)，民生銀行對(duì)于高管層的變動(dòng)似乎有所準(zhǔn)備，管理層原有四位副行長(zhǎng)，除邵平以外，還有邢本秀、趙品璋和毛曉峰，但是幾個(gè)月前民生中高層已經(jīng)進(jìn)行了一輪人事調(diào)整，聘任授信評(píng)審部總經(jīng)理石杰、金融市場(chǎng)部總裁李彬和公司銀行部總經(jīng)理林云山擔(dān)任行長(zhǎng)助理，對(duì)未來(lái)管理層的新老更替做好準(zhǔn)備。

一位股份制銀行人士稱，銀行業(yè)金融機(jī)構(gòu)中，平安和民生在風(fēng)格上有相近的地方，比如都比較崇尚“狼性”文化，也不是特別按照常理出牌。而兩位當(dāng)家人馬明哲和董文標(biāo)的個(gè)人特點(diǎn)非常鮮明，并極大地投射到企業(yè)特色中，“這對(duì)邵平入主平安銀行有一定的幫助作用，在對(duì)平安企業(yè)文化的理解和磨合方面，也許會(huì)比旁人更加得心應(yīng)手。”

不過(guò)，長(zhǎng)期掌管風(fēng)控的邵平能否適應(yīng)平安銀行加速發(fā)展的戰(zhàn)略需求，同樣有待于時(shí)間和市場(chǎng)的檢驗(yàn)。

第2篇：基因重組范文

生長(zhǎng)激素的作用

生長(zhǎng)激素是由大腦垂體分泌的，rhGH與人自身合成的生長(zhǎng)激素相同，其主要功能一是刺激軟骨細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)骨骼的生長(zhǎng)，從而加快身高增長(zhǎng)速度；二是通過(guò)它以及它作用于肝細(xì)胞合成的胰島素樣生長(zhǎng)因子，調(diào)節(jié)人體代謝，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成以及脂肪的分解。

哪些矮小者可以用rhGH

rhGH是治療各種原因引起的生長(zhǎng)激素缺乏癥(GHD)的首選藥物，包括特發(fā)性GHD或繼發(fā)于顱腦腫瘤、炎癥、外傷、發(fā)育不良等病變以及放射治療的GHD。對(duì)這一類矮小患者，rhGH的療效非常顯著，如一般第一年的連續(xù)治療可使患者長(zhǎng)高約10厘米，經(jīng)連續(xù)治療數(shù)年，可明顯改善患者的成年身高（終身高）。rhGH對(duì)于因特納綜合征（一種性染色體疾?。⒙阅I功能不全所導(dǎo)致的矮小，也具有肯定的療效。另外，rhGH對(duì)宮內(nèi)發(fā)育遲緩所致的矮小，對(duì)遺傳性、家族性或其他病因不明的特發(fā)性矮小，在治療期間具有明確的加快生長(zhǎng)的功效，但關(guān)于增加成年身高的作用，雖已有肯定的報(bào)道，至今國(guó)際上仍然沒(méi)有定論。

什么時(shí)間開(kāi)始治療好

總的原則是確診后越早越好。從療效來(lái)講，骨齡越小，骨骼生長(zhǎng)的潛能越大，因而身高追趕的空間也大。從費(fèi)用考慮，由于rhGH的治療劑量是根據(jù)體重來(lái)計(jì)算的，同樣增高1厘米，體重輕者所花的錢自然就少。必須指出的是，慢性腎功能不全的矮小患者的治療只能在腎移植之前進(jìn)行，而腫瘤患者必須在原發(fā)疾病得到控制的前提下，才可以開(kāi)始治療。

療程要多長(zhǎng)

生長(zhǎng)激素的促長(zhǎng)作用只表現(xiàn)在用藥期間，換一句話說(shuō)，你用藥時(shí)就長(zhǎng)得快，不用藥時(shí)，又回到原來(lái)的速度（剛停用后的短時(shí)間內(nèi)生長(zhǎng)還可能較治療前快）。因此，影響療程長(zhǎng)短的因素有多個(gè)。首先，從醫(yī)療的角度，一般療程越長(zhǎng)療效越好，以GHD為例，連續(xù)治療3年以上，才能取得比較滿意的結(jié)果。其次，迄今為止，rhGH的治療費(fèi)用還是十分昂貴的，對(duì)藥費(fèi)的承受力也決定了療程的長(zhǎng)短。再次，患者對(duì)治療的依從性、患者自身及其家人對(duì)最終身高的期望值、患者開(kāi)始治療的年齡等都與療程有關(guān)。但是，當(dāng)患者治療期間的生長(zhǎng)速度低于每年2.5厘米，或骨骺已閉合則應(yīng)停止使用。

治療中需注意的問(wèn)題

一是診斷。因?yàn)樯L(zhǎng)激素并不能治療所有的矮小癥，所以明確的診斷對(duì)于制定治療方案、調(diào)整治療劑量、預(yù)測(cè)療效、權(quán)衡治療結(jié)果與治療費(fèi)用都是很重要的。如垂體功能減退患者除生長(zhǎng)激素外，還需補(bǔ)充其他的垂體激素。又如，治療不同原因引起的矮小時(shí)，使用的劑量是不同的，因特納綜合征患者所需的劑量較GHD大。

第3篇：基因重組范文

00：41

相比前代車系，全新思域的外觀設(shè)計(jì)顯得更加大膽、年輕化，激進(jìn)的前臉配以流暢的車身線條，極大地提升了整車運(yùn)動(dòng)感。值得注意的是，新一代車型較上一代車型增寬了約50mm、車身高度降低了25mm，軸距則拉長(zhǎng)約30mm。在突顯運(yùn)動(dòng)性的同時(shí)，進(jìn)一步擴(kuò)充了后排空間。車體重量經(jīng)過(guò)輕量化改進(jìn)后減重30.76kg。

01：45

內(nèi)飾方面，全新思域更加體現(xiàn)了以駕駛員為中心的座艙設(shè)計(jì)理念，方向盤、儀表盤造型不僅更加動(dòng)感，車內(nèi)質(zhì)感也得到了提升。另外，多媒體配置水平與雅閣保持一致，這其中就包括了中控臺(tái)上的7英寸觸控屏幕，其可以在智能手機(jī)的對(duì)應(yīng)功能上全面支持Apple CarPlay與Android Auto系統(tǒng)。

02：25

全新思域的安全性也得到進(jìn)一步加強(qiáng)。本田Sensing主被動(dòng)安全科技被引入，包括降低碰撞損傷的CMB預(yù)警式煞車系統(tǒng)、RDM車道偏移警示以及支持可低速跟車行駛的新一代ACC主動(dòng)式巡航系統(tǒng)等，均保證了駕馭安全性。乘坐空間方面，新一代思域后排腿部空間增加了約51mm，同時(shí)行李廂容積也得到了提升。

03：28

全新思域擁有最大功率116kw的2.0L自然吸氣發(fā)動(dòng)機(jī)與最大功率127kw的1.5T直噴渦輪增壓發(fā)動(dòng)機(jī)可選。前者可匹配6速手動(dòng)或CVT變速器，后者則匹配的是一款專門針對(duì)渦輪增壓發(fā)動(dòng)機(jī)研發(fā)的CVT無(wú)級(jí)變速器。

03：47

這款2.0L自吸發(fā)動(dòng)機(jī)并非之前1.8L發(fā)動(dòng)機(jī)的后裔，而是跟本田那臺(tái)在前幾年一舉創(chuàng)下量產(chǎn)汽油發(fā)動(dòng)機(jī)的最高熱效率記錄的LFA型發(fā)動(dòng)機(jī)沾親帶故。在國(guó)內(nèi)渦輪發(fā)動(dòng)機(jī)愈發(fā)火熱，并且2.0L和1.5T最大功率相近的情況下，預(yù)計(jì)2.0L發(fā)動(dòng)機(jī)并不會(huì)在未來(lái)的國(guó)產(chǎn)版車型上出現(xiàn)，而1.5T地球夢(mèng)直噴渦輪增壓發(fā)動(dòng)機(jī)將會(huì)引入國(guó)內(nèi)。

第4篇：基因重組范文

（貴州師范大學(xué)蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心／生命科學(xué)學(xué)院植物遺傳育種研究所，貴陽(yáng) 550001）

摘要：以貴州師范大學(xué)蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心建立的兩個(gè)甜蕎（Fagopyrum esculentum）重組自交系群體（Homo×甜自100和Lorena－3×甜自21－1）的親本為研究對(duì)象，選取了5個(gè)多態(tài)性好、帶型清楚的隨機(jī)引物進(jìn)行RAPD分析，計(jì)算了每對(duì)親本之間的相似度系數(shù)，并構(gòu)建了各親本的RAPD指紋圖譜。結(jié)果表明，在Homo×甜自100和Lorena－3×甜自21－1的親本中，平均相似度系數(shù)分別為39．13％和42．69％；在構(gòu)建的RAPD指紋圖譜中，有29條譜帶為Homo（P1）所獨(dú)有，27條譜帶為甜自100（P2）所特有；有26條譜帶為L(zhǎng)orena－3（P1）所獨(dú)有，25條譜帶為甜自21－1（P2）所特有。蕎麥特異譜帶可以作為品種鑒定的分子標(biāo)記。

關(guān)鍵詞 ：甜蕎（Fagopyrum esculentum）；RAPD；多樣性；DNA指紋圖譜

中圖分類號(hào)：S517 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439－8114（2015）02－0284-05

DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.008

甜蕎（Fagopyrum esculentum）為蕎麥大粒組類群7個(gè)生物學(xué)物種之一［1］。Chen［2，3］的試驗(yàn)研究表明，普通蕎麥中存在著大量的形態(tài)變異，而對(duì)這些變異進(jìn)行深入研究將在很大程度上有利于遺傳育種?；蚩刂浦矬w的性狀表達(dá)和變異，研究DNA分子的多態(tài)性也會(huì)促進(jìn)對(duì)形態(tài)變異的進(jìn)一步探索，并在遺傳育種中為選擇強(qiáng)優(yōu)勢(shì)組合的親本進(jìn)行雜交和蕎麥資源的鑒定提供科學(xué)依據(jù)［4］。

RAPD技術(shù)是以PCR為基礎(chǔ)的一項(xiàng)檢測(cè)物種DNA多態(tài)性的分子技術(shù)［5］。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是DNA樣品需求量??；無(wú)種屬和基因組結(jié)構(gòu)特異性，一套引物可用于不同生物基因組分析；試驗(yàn)成本低；試驗(yàn)技術(shù)簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度較快。RAPD在蕎麥中應(yīng)用主要集中在蕎麥的遺傳多樣性和種間系統(tǒng)關(guān)系研究方面［6］。通過(guò)建立RAPD指紋圖譜，尋找每個(gè)種類的恒定譜帶和獨(dú)特譜帶，可以迅速準(zhǔn)確地對(duì)蕎麥種類進(jìn)行鑒別。近年來(lái)，RAPD技術(shù)已應(yīng)用于多種植物雜交組合后代鑒定［7，8］和種子純度的檢測(cè)等。Ohinshi等［9］、Tsuji等［10］利用AFLP和RAPD技術(shù)研究苦蕎栽培品系和天然種群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。Sharma［11］應(yīng)用RAPD技術(shù)研究了蕎麥屬14個(gè)種之間的遺傳多樣性。Kump等［12，13］采用RAPD技術(shù)進(jìn)行了苦蕎33個(gè)栽培種之間遺傳關(guān)系的分析。許瑾等［4］利用RAPD技術(shù)對(duì)蕎麥屬的9個(gè)品種進(jìn)行基因組指紋圖譜分析。譚萍等［14］采用RAPD方法對(duì)國(guó)內(nèi)10個(gè)蕎麥栽培種進(jìn)行基因型分析，并建立了指紋圖譜。Pan等［15］以F． esculentum Moench， F． esculentum var． homotropicum 及其雜交所建立的 225 株 F2代分離群體為材料，進(jìn)行了 RAPD 與 STS 標(biāo)記分析和重要形態(tài)性狀遺傳分析，并由此構(gòu)建遺傳標(biāo)記連鎖圖譜，共涉及87個(gè)RAPD標(biāo)記，12個(gè)STS標(biāo)記。覆蓋基因組長(zhǎng)度655．2 cM?？偟恼f(shuō)來(lái)，由于普通蕎麥自交不親和，相關(guān)研究主要以蕎麥品種或品系為材料，主要運(yùn)用RAPD等標(biāo)記。

在重組自交系中，利用親本DNA樣品進(jìn)行RAPD 標(biāo)記引物篩選，并將重復(fù)性好的引物進(jìn)行其可育F2代分離群體樣本的PCR擴(kuò)增，用以分析甜蕎RAPD標(biāo)記多態(tài)性和構(gòu)建起分子遺傳連鎖圖譜。本研究對(duì)普通蕎麥重組自交系群體親本組合（Homo×甜自100，Lorena－3×甜自21－1）的親本用5種隨機(jī)引物的RAPD譜帶進(jìn)行多態(tài)性分析和指紋圖譜建立，以期為其F2代自交系群體的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

本研究選用了甜蕎重組自交系的4個(gè)親本甜蕎種，分別為L(zhǎng)orena－3、甜自21－1、甜自100和Homo。重組自交系的親本組合為：Homo×甜自100，Lorena－3×甜自21－1。甜蕎品種由貴州師范大學(xué)蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心提供。

1．2 DNA提取

取2～3周苗齡的新鮮健康葉片約300 mg置于研缽中，倒入液氮，研成粉末。將該粉末直接轉(zhuǎn)入裝有預(yù)熱的含有15 μL β－巰基乙醇的1 000 μL 2％ CTAB提取緩沖液（質(zhì)量濃度2％ CTAB，100 mmol／L pH 8．0 Tris－HCl，50 mmol／L EDTA－Na2，1．4 mol／L NaCl，質(zhì)量濃度2％ PVP）的5 mL離心管中，輕輕搖動(dòng)使其充分混勻，置于65 ℃水浴中保溫60 min（每隔20 min輕輕顛倒混勻1次），加入酚／氯仿／異戊醇混合液（25∶24∶1，V／V／V），充分混勻，常溫下靜置10 min，10 000 r／min 離心10 min。將上清液加入氯仿／異戊醇混合液（24∶1，V／V），輕輕混勻，室溫下10 000 r／min離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中，加入2倍體積－20 ℃冰凍的無(wú)水乙醇，輕輕顛倒離心管直至出現(xiàn)白色絮狀沉淀，將離心管放在 －20 ℃中沉淀10 min。離心沉淀DNA并將沉淀用 －20 ℃冰凍的體積分?jǐn)?shù)為70％的乙醇洗滌兩次，在室溫下使DNA沉淀干燥。加入600 μL TE緩沖液，完全溶解后，置于－20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3 引物

共使用了5個(gè)隨機(jī)引物，各引物序列見(jiàn)表1。該引物從貴州師范大學(xué)蕎麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究中心設(shè)計(jì)的25個(gè)引物中選取，以親本間多態(tài)性好、電泳帶型清晰、重復(fù)性好為主要篩選原則。

1．4 PCR反應(yīng)體系

試驗(yàn)中，RAPD檢測(cè)使用的PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表2。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性1 min，Tm（引物不同溫度不同）退火1 min，72 ℃延伸2 min，38個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1．5 統(tǒng)計(jì)分析方法

擴(kuò)增產(chǎn)物于0．8％的瓊脂糖凝膠中電泳，在BioSenSC805型全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)的Analysis工具欄中，點(diǎn)擊消除背景圖標(biāo)以消除圖像本底的干擾；點(diǎn)擊自動(dòng)檢測(cè)所有泳道的條帶圖標(biāo)以進(jìn)行各泳道內(nèi)條帶檢測(cè)；點(diǎn)擊相對(duì)分子質(zhì)量計(jì)算圖標(biāo)，以Marker泳道內(nèi)的Marker條帶的相對(duì)分子質(zhì)量為標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定相對(duì)分子量曲線圖，關(guān)閉Marker窗口，則會(huì)顯示各個(gè)條帶的相對(duì)分子質(zhì)量，統(tǒng)計(jì)各泳道內(nèi)的條帶數(shù)。

參考文獻(xiàn)［16］，采用條帶相似度系數(shù)分析條帶的多樣性。相似度系數(shù)SD＝（2nAB）／（nA＋nB），nA為A泳道內(nèi)的DNA條帶數(shù)，nB為B泳道內(nèi)的DNA條帶數(shù)，nAB是A、B泳道內(nèi)共有的條帶數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2．1 親本甜蕎的RAPD電泳圖譜

不同引物擴(kuò)增的親本甜蕎的RAPD電泳圖譜如圖1和圖2所示。

2．2 親本甜蕎RAPD標(biāo)記的多樣性分析

根據(jù)篩選出的5個(gè)隨機(jī)引物的RAPD擴(kuò)增結(jié)果，可以對(duì)每對(duì)雜交組合中的兩個(gè)親本進(jìn)行擴(kuò)增條帶的多樣性分析，兩對(duì)雜交組合親本中各引物的擴(kuò)增情況與相似度系數(shù)見(jiàn)表3和表4。

由表3可知，對(duì)親本Homo（P1）×甜自100（P2）的組合進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，5個(gè)引物共擴(kuò)增出92條譜帶，平均每個(gè)隨機(jī)引物產(chǎn)生了18．4條譜帶。這些引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為17～20條譜帶，其中擴(kuò)增條帶數(shù)目最多的是引物R1182，共有20條譜帶；其次為引物R52和R428，均為19條譜帶；最少的為引物R41和R353，擴(kuò)增出17條譜帶。

對(duì)親本Homo（P1）×甜自100（P2）組合的所有隨機(jī)引物的RAPD標(biāo)記多樣性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（表3）表明，在5個(gè)隨機(jī)引物獲得的92條譜帶中，有18條譜帶在兩親本間表現(xiàn)為相同譜帶，RAPD標(biāo)記的相似度系數(shù)為39．13％（36／92）。對(duì)于每一條引物的相似度系數(shù)來(lái)說(shuō)，其變化范圍為31．58％（6／19）～50．00％（10／20）。其中RAPD標(biāo)記的相似度系數(shù)最高的引物是R1182，達(dá)到了50．00％，引物R428的標(biāo)記相似度系數(shù)最低，為31．58％（6／19）。因此，本研究所采用的雜交組合親本Homo（P1）×甜自100（P2）在基因組DNA水平上存在較低的RAPD標(biāo)記相似度系數(shù)，即DNA水平上條帶的多樣性較為豐富。有利于其子代群體獲得更為廣泛的性狀變異。

由表4可知，對(duì)親本Lorena－3（P1）×甜自21－1（P2）的組合進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，5個(gè)引物共擴(kuò)增出89條譜帶，平均每個(gè)隨機(jī)引物產(chǎn)生了17．8條譜帶。這些引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為15～20條譜帶，其中擴(kuò)增條帶數(shù)目最多的是引物R1182，共有20條譜帶；而后依次為R52、R353、R41、R428，擴(kuò)增出的譜帶數(shù)分別為19、18、17、15。

對(duì)Lorena－3（P1）×甜自21－1（P2）的親本組合所有隨機(jī)引物的RAPD標(biāo)記多樣性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（表4）表明，在5個(gè)隨機(jī)引物獲得的89條譜帶中，有51條譜帶在兩親本間的表現(xiàn)存在差異性，RAPD標(biāo)記的相似度系數(shù)為42．69％（38／89）。對(duì)每條引物的標(biāo)記相似度系數(shù)來(lái)說(shuō)，其變化范圍為40．0％（6／15）～47．06％（8／17）。其中RAPD標(biāo)記的相似度系數(shù)最低的引物為R428和R1182，相似度系數(shù)為40．00％，R41的標(biāo)記相似度系數(shù)最高，達(dá)47．06％（8／17）。因此，本研究所采用的雜交組合親本Lorena－3（P1）×甜自21－1（P2）基因組DNA水平上同樣存在較低的RAPD標(biāo)記相似度，也存在較高的多樣性，將有利于其子代群體獲得更為廣泛的性狀變異。

2．3 親本甜蕎的RAPD指紋圖譜

根據(jù)全部隨機(jī)引物擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，將能在親本組合中穩(wěn)定擴(kuò)增出現(xiàn)的、且具有差異的特異性譜帶用來(lái)構(gòu)建親本組內(nèi)P1和P2的RAPD標(biāo)記指紋圖譜。在Homo（P1）×甜自100（P2）的親本中，共擴(kuò)增出56條差異性譜帶（表5）；在Lorena－3（P1）×甜自21－1（P2）的親本中，共擴(kuò)增出51條差異性譜帶（表6）。

由表5和表6可知，Homo（P1）×甜自100（P2）和Lorena－3（P1）×甜自21－1（P2）組合親本RAPD指紋圖譜存在較明顯的差異性。前者中有28條譜帶為Homo（P1）所獨(dú)有，27條譜帶為甜自100（P2）所特有；后者中有24條譜帶為L(zhǎng)orena－3（P1）所獨(dú)有，24條譜帶為甜自21－1（P2）所特有。因此，在每對(duì)雜交組合中，存在差異的譜帶可看作是兩親本的特征性譜帶，而由RAPD指紋圖譜所反應(yīng)的這些特征譜帶可以作為鑒別親本的依據(jù)，也可為進(jìn)一步對(duì)雜交組合中親本的DNA多態(tài)性及其他分子遺傳研究打下基礎(chǔ)。

3 討論

Deng等［17］利用7個(gè)隨機(jī)引物對(duì)19個(gè)蕎麥（包括甜蕎和苦蕎）品種進(jìn)行RAPD分析，結(jié)果表明其平均多態(tài)性達(dá)94．89％，而本研究結(jié)果表明，甜蕎重組自交系的兩對(duì)親本組合的平均相似度系數(shù)分別為39．13％（Homo×甜自100）和42．69％（Lorena－3×甜自21－1），再次在DNA水平上說(shuō)明蕎麥種間的多態(tài)性遠(yuǎn)高于種內(nèi)多態(tài)性。同時(shí)，對(duì)同屬甜蕎品種的兩個(gè)親本組合而言，其低于50％的相似度系數(shù)也從DNA的角度解釋了甜蕎異花授粉、自交不親和等生殖學(xué)特征所帶來(lái)的物種基因重組的多態(tài)性現(xiàn)象。在對(duì)蕎麥進(jìn)行種類劃分的研究中，部分種類難以從形態(tài)學(xué)上進(jìn)行識(shí)別，分類特征也常存在較大變異，難以把握。本研究在DNA水平上進(jìn)行的RAPD遺傳標(biāo)記分析可對(duì)蕎麥品種鑒別和遺傳歧化研究提供依據(jù)。

此外，本研究以重組自交系親本為研究對(duì)象進(jìn)行RAPD分析，發(fā)現(xiàn)自交系群體親本之間存在較多的特異RAPD譜帶，也可為以重組自交系為研究對(duì)象進(jìn)行的相關(guān)農(nóng)藝學(xué)特征遺傳及分子標(biāo)記研究奠定基礎(chǔ)。

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第5篇：基因重組范文

【摘要】 目的 構(gòu)建細(xì)粒棘球蚴鐵蛋白基因的重組表達(dá)質(zhì)粒ferritin/pET-28a，表達(dá)、純化出重組蛋白，并對(duì)重組蛋白的免疫學(xué)特性進(jìn)行初步研究。方法 將目的基因亞克隆至表達(dá)載體pET-28a，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)plysS，加入IPTG對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。通過(guò)Ni2+的His-bind樹(shù)脂柱純化出重組蛋白，用50μg/100μL免疫ICR小鼠，獲得抗血清，通過(guò)western-blot及ELISA對(duì)重組鐵蛋白的免疫學(xué)特性進(jìn)行初步研究。結(jié)果 表達(dá)并純化出分子量約19kD重組鐵蛋白，western-blot顯示重組蛋白免疫制備的抗血清可識(shí)別純化的重組蛋白及抗原囊液、原頭蚴，位置大致相同，約19kD。ELISA結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠與對(duì)照組小鼠血清中IgG的OD值有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論 細(xì)粒棘球蚴重組鐵蛋白Eg.ferritin具有較好的抗原性及免疫原性，具有成為包蟲(chóng)疫苗候選分子的潛能。

【關(guān)鍵詞】 細(xì)粒棘球蚴；重組鐵蛋白；純化；免疫特性

鐵蛋白(ferritin)是普遍存在于生物體內(nèi)的一種保守性較高的多功能多亞基蛋白，其作用是儲(chǔ)存鐵，對(duì)生物體內(nèi)鐵含量進(jìn)行調(diào)控，在生物體內(nèi)鐵含量過(guò)多時(shí)起到解毒作用［1-2］，它的存在保證了生命體的正?；顒?dòng)。本實(shí)驗(yàn)中心已構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒ferritin/pGEX-6p-1，但由于重組蛋白ferritin/GST以包涵體形式存在于細(xì)胞中，無(wú)法通過(guò)親和層析柱純化出單一的Eg.ferritin［3］。只能通過(guò)切膠純化的方法獲得融合蛋白Ferritin/GST，雖然試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明該融合蛋白具有較好的抗原性及免疫原性，但影響蛋白特性的因素較多，不能很好的反映蛋白的實(shí)際特性，因此本次試驗(yàn)將鐵蛋白基因重組到表達(dá)質(zhì)粒pET-28a中，pET-28a是個(gè)高效表達(dá)載體，能純化變性及非變性的蛋白，通過(guò)表達(dá)純化可獲得較純的Eg.ferritin，以便更好地研究蛋白的特性，為鐵蛋白能成為包蟲(chóng)病候選疫苗提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與菌種 Eg.ferritin/pGEM-T/JM109及E.coli BL21(DE3)plysS由本室保存；pET-28a表達(dá)載體購(gòu)自Novagen公司。

1.2 試劑 T4連接酶、限制性內(nèi)切酶BamH I、Not I、IPTG、N'N'N'N-四甲基乙二胺、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺購(gòu)自Promega公司；β-巰基乙醇、二甲基亞砜、弗氏完全(不完全)佐劑、過(guò)硫酸銨、Tween-20等試劑購(gòu)自于SIGMA公司；考馬斯亮藍(lán)購(gòu)自BIOMOL公司；酵母提取物、蛋白提取物購(gòu)自O(shè)XOID公司；蛋白預(yù)染Marker購(gòu)自北京賽百盛；卡那霉素、TMB、4-氯-1-奈酚購(gòu)自AMRESCO；羊抗鼠HRP-IgG、質(zhì)粒DNA提取試劑盒等購(gòu)自北京華美公司；DNA純化回收試劑盒購(gòu)自北京賽百盛生物有限公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量Marker 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所；含Ni2+的His-bind樹(shù)脂純化試劑盒購(gòu)自Novagen公司；其它常用試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ICR小鼠，6～8周，(18±2)g，雌性，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.4 Eg.ferritin/pET-28a重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 取Eg.ferritin/pGEM-T/JM109菌株劃板接菌［4］，并挑單個(gè)菌落進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)堿裂解法提取重組質(zhì)粒；同時(shí)取適量的表達(dá)載體pET-28a，將兩者分別用BamH I，Not I進(jìn)行雙酶切處理，用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離帶有雙黏性末端的目的片段和表達(dá)載體，切膠，經(jīng)DNA回收試劑盒純化目的片段及載體。目的片段與表達(dá)載體在T4連接酶的作用下，16℃連接過(guò)夜。繼而將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到已制備好的感受態(tài)菌BL21(DE3)plysS中［5］，經(jīng)含卡那霉素終濃度為50μg/mL的LB固體培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性菌株［6］。挑取陽(yáng)性菌株含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，經(jīng)質(zhì)粒提取試劑盒純化重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamH I，Not I進(jìn)行酶切鑒定。

1.5 重組鐵蛋白的表達(dá)、純化

1.5.1 重組蛋白的表達(dá) 將重組菌接種于含卡那霉素(終濃度為50μg/mL)的3mL 的LB培養(yǎng)基中，37℃ 200 r/min 振蕩培養(yǎng)數(shù)小時(shí)，按1∶50接種于50mL培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min，培養(yǎng)至OD600=0.5時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.05mmol/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6h，4℃ 4000r/min 離心15min，棄上清，收集細(xì)菌沉淀，SDS-PAGE觀察表達(dá)情況。

1.5.2 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定 將樣本與2×SDS-PAGE樣本緩沖液混合，經(jīng)12% SDS-PAGE，180V電壓，電泳至溴酚蘭指示劑到膠底為止，用0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染色2h，用含7%冰醋酸5%甲醇的脫色液脫色至本底無(wú)色。

1.5.3 重組抗原的純化及制備 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解，發(fā)現(xiàn)重組蛋白以包涵體的形式存在，按照Novagen公司His-bind樹(shù)脂純化試劑盒說(shuō)明書(shū)中的包涵體大量純化方法進(jìn)行純化，然后將純化好的包涵體蛋白放入透析袋中，用1×PBS透析去除尿素。

1.6 動(dòng)物免疫及特異性抗血清的制備

1.6.1 動(dòng)物免疫 ICR小鼠分兩組，即免疫組與對(duì)照組，每組10只。1)免疫組每只注射弗氏佐劑與重組抗原Eg.ferritin的乳化劑50μg/100μL。對(duì)照組注射弗氏佐劑和PBS的乳化劑100μL。根據(jù)Bio-Rad公司的Gel Doc1000凝膠分析系統(tǒng)對(duì)純化的抗原進(jìn)行定量。2)免疫方法 每組小鼠在0、2、4周各免疫1次，共3次，第1次基礎(chǔ)免疫用弗氏完全佐劑，以后2次為加強(qiáng)免疫均用弗氏不完全佐劑。采用背部皮下多點(diǎn)注射免疫，每次注射量為100μL/只。分別于0、2、4、6周斷尾采血，共4次，8周眼眶取血并處死小鼠。

1.6.2 特異性抗血清的制備 將血液4000r/min 離心 10min，提取血清，-20℃保存。

1.7 血清特異性識(shí)別 純化的重組抗原Eg.ferritin、天然可溶性抗原囊液、原頭蚴通過(guò)10%分離膠及5%的濃縮膠，180V電壓下進(jìn)行SDS-PAGE電泳 1h。在30mA下對(duì)硝酸纖維膜進(jìn)行印跡轉(zhuǎn)移1h。然后將硝酸纖維膜浸入5%的脫脂奶粉溶液中，37℃ 封閉1h，以PBS-T(PBS中含0.5‰ Tween-20)溶液洗3次，每次5min。再將硝酸纖維膜剪開(kāi)分別浸泡于1∶100稀釋的Eg.ferritin免疫的特異性小鼠抗血清及對(duì)照組鼠血清中，4℃ 過(guò)夜。次日將膜用PBS-T溶液洗3次，每次5min，然后與1∶1000稀釋的羊抗鼠IgG-辣根過(guò)氧化物酶(HRP)結(jié)合，37℃反應(yīng)1h。再以PBS-T溶液洗4次，每次10min。加入新配制的底物液(6mg 4-氯-1-奈酚，2mL冷甲醇，10mL的TBS，12μL的H2O2)37℃顯色5min，最后用蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。

1.8 抗血清中IgG的測(cè)定 采用ELISA法，用純化的Eg.ferritin 5μg/mL包被酶標(biāo)板100μL/孔，4℃過(guò)夜。次日，PBS-T洗3次，5％牛奶封閉100μL/孔，37℃ 1h，PBS-T洗3次，取0～8周的免疫組及對(duì)照組小鼠血清作為一抗，按1∶100稀釋，100μL/孔，37℃ 1h，PBS-T洗4次，羊抗鼠HRP-IgG為二抗，按1∶1000稀釋，100μL/孔，37℃ 1h，PBS-T洗4次，加入顯色劑100μL/孔，待對(duì)照孔顯色時(shí)，加入2M H2SO4 50μL/孔 終止反應(yīng)。以包被抗原及進(jìn)行牛奶封閉的孔為空白調(diào)零，置酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件，采用兩樣本t檢驗(yàn)的方法對(duì)測(cè)定的OD值進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)質(zhì)粒Eg.ferritin/pET-28a的酶切鑒定

將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒Eg.ferritin/pET-28a 用限制性內(nèi)切酶BamH I和Not I 雙酶切后，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)到插入片斷大小約560bp，與目的基因片段相符。M1.Lambda DNA/HindⅢMarker；1.pET-28a空質(zhì)粒；2.Eg·ferritin/

2.2 Eg.ferritin 的純化

含Ni2+的His-bind樹(shù)脂親合柱純化Eg.ferritin/pET-28a表達(dá)的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量可知，純化蛋白的分子量約19kD.

2.3 特異性抗血清識(shí)別純化蛋白和天然抗原

純化Eg.ferritin免疫小鼠制備的抗血清可特異性識(shí)別未純化的重組Eg.ferritin，純化的Eg.ferritin 及天然抗原(原頭蚴、囊液)，識(shí)別蛋白條帶的位置大致相同約19kD(見(jiàn)圖3)。

2.4 小鼠血清IgG水平變化

根據(jù)對(duì)小鼠血清IgG水平在0～8周變化趨勢(shì)的檢測(cè)及對(duì)免疫組和對(duì)照組小鼠血清IgG的比較發(fā)現(xiàn)，小鼠血清中IgG的水平隨著免疫次數(shù)及時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，免疫4周以后同一時(shí)期的免疫組小鼠血清中的IgG水平明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。表1 兩組小鼠免疫不同時(shí)間血清IgG水平變化

3 討論

本實(shí)驗(yàn)將細(xì)粒棘球蚴鐵蛋白基因重新克隆到表達(dá)載體pET-28a上，主要考慮：① pET-28a表達(dá)載體具有高效表達(dá)的能力［7］；② pET28a質(zhì)粒在插入目的DNA后表達(dá)的蛋白N 末端含6個(gè)組氨酸，它作為His標(biāo)簽蛋白，可與Ni2+鰲合，使得重組融合蛋白在變性或非變性狀態(tài)下均可被含Ni2+的His-band 樹(shù)脂親合柱純化，即使被純化的重組蛋白含量很低也能被有效地純化出來(lái)?？朔吮局行囊呀?jīng)構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒ferritin/pGEX-6p-1表達(dá)的重組蛋白ferritin/GST不能通過(guò)GSTTrapTMFF親和層析柱純化的弊端［3］；③重組蛋白是標(biāo)簽蛋白His和目的蛋白共同組成的融合蛋白，為獲取目的蛋白，本應(yīng)通過(guò)相應(yīng)的剪切酶將標(biāo)簽蛋白剪切下來(lái)，但由于N-末端組氨酸所表達(dá)的蛋白分子量很小，它的存在不改變目的蛋白的活性，所以無(wú)須去除。這不僅能減少實(shí)驗(yàn)步驟，降低純化蛋白在酶切過(guò)程中的損失，同時(shí)還可節(jié)省用來(lái)購(gòu)買剪刀酶的費(fèi)用，為后續(xù)研究提供了較好的實(shí)驗(yàn)材料?；诖宋覀兊玫搅艘粋€(gè)高效表達(dá)且易于純化重組蛋白的基因工程菌株，并得到了較純的重組蛋白，進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明Eg.ferritin作為抗原可誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生較強(qiáng)的的體液免疫應(yīng)答，證明其有良好的抗原性；免疫血清與細(xì)粒棘球蚴天然抗原(囊液和原頭蚴)的Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，免疫血清能夠較好地識(shí)別天然抗原中位于19kD處的條帶，說(shuō)明Eg.ferritin具有較好免疫原性，由此推測(cè)中國(guó)大陸株細(xì)粒棘球蚴鐵蛋白基因具有作為包蟲(chóng)疫苗候選分子的潛能，為進(jìn)行重組鐵蛋白對(duì)宿主的免疫保護(hù)性及保護(hù)性機(jī)制等方面研究的可能性提供了依據(jù)。

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［5］ FM奧斯伯，RE金斯頓，JG塞德曼，等.精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南［M］.第4版.北京：科學(xué)出版社，2005：27.

第6篇：基因重組范文

【摘要】 目的 應(yīng)用細(xì)菌內(nèi)同源重組高效制備p53基因重組腺病毒。方法 設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增p53基因，在上下游引物分別引入Xhol和HindⅢ酶切位點(diǎn)，將p53基因亞克隆連接到經(jīng)相同酶切的p shuttle-cmv轉(zhuǎn)移質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化DH5α篩選卡那霉素抗性菌落構(gòu)建重組腺病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒p shuttle-cmv-p53用Pmel酶切線性化采用兩步法進(jìn)行同源重組：先將腺病毒骨架質(zhì)料pAdEasy-1轉(zhuǎn)化氯化鈣法制備的BJ5183感受態(tài)細(xì)菌，篩選得到鏈霉素和氨芐青霉素抗性的AdBJ5183轉(zhuǎn)化菌；再將線性化的p shuttle-cmv-p53轉(zhuǎn)化氯化鈣法制備的AdBJ5183感受態(tài)細(xì)菌，在細(xì)菌內(nèi)進(jìn)行同源重組，挑選卡那霉素抗性菌落培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，瓊脂糖電泳挑選大片斷的重組質(zhì)粒pAdBJ5183-P53分別用限制性內(nèi)切酶PacI和BstXI及PCR法鑒定。結(jié)果 成功構(gòu)建了p53基因重組腺病毒表達(dá)載體。結(jié)論 采用簡(jiǎn)化的兩步氯化鈣化學(xué)轉(zhuǎn)化法可以取代電穿孔法高效構(gòu)建重組腺病毒表達(dá)載體。

【關(guān)鍵詞】 腺病毒載體；同源重組；p53基因

【Abstract】 Objective To construct recombinant replication-defective human adenovirus serotype 5 vector carrying wt-p53 gene by simplified two-step homologous recombination protocol in bacteria.Methods wt-p53 gene was firstly subcloned into a transfer vector p shuttle-cmv and the positive recombinant p shuttle-p53 was linearized by PmeI.Then the simplified two-step homologous recombination protocol was employed for the construction of recombinant adenoviral vector.In step one，adenoviral skeletal plasmid pAdeasy-1 was transformed into BJ5183 competent cells by calcium chloride chemical methed to obtain pAdBJ5183;and in step two，linearized psh-p53 plasmid was transformed into pAdBJ5183.The possible positive adenoviral plasmids were selected by agarose gel electrophoresis and indentified by PacI as well as BxtXI cleaved pattern.Results Replication-defective recombinatant adenovirus containing human p53 gene was successfully constructed.Conclusion The results indicated that the calcium chloride chemically simplified two-step homologous recombination protocol can replace the co-transformation by electroperforation and may have broaed utility in system that involve homologous recombination in bacteria.

復(fù)制缺陷型腺病毒可以高效介導(dǎo)基因的體內(nèi)外轉(zhuǎn)移；感染細(xì)胞范圍廣，不但可以感染分裂期細(xì)胞，也可感染靜止期細(xì)胞；感染細(xì)胞時(shí)其DNA不整合到宿主細(xì)胞染色體中，安全可靠。因此成為基因治療中常用的載體。重組腺病毒載體的構(gòu)建方法有真核細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒重組法、酵母人工染色體克隆系統(tǒng)、Cre/loxp定點(diǎn)重組系統(tǒng)、末端蛋白-DNA復(fù)合物共轉(zhuǎn)染法等［1～3］。以上方法牽涉到的步驟和環(huán)節(jié)較多、工作量大、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)。1998年He等［4］建立了細(xì)菌內(nèi)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化同源重組方法，該法簡(jiǎn)便快速、實(shí)驗(yàn)周期短，但是共轉(zhuǎn)化需要電穿孔儀，且同源重組成功率不到20%。筆者在實(shí)際工作中對(duì)該法進(jìn)行了改進(jìn)，采用簡(jiǎn)化的兩步氯化鈣化學(xué)轉(zhuǎn)化法代替電穿孔共轉(zhuǎn)化法構(gòu)建了p53重組腺病毒表達(dá)載體。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 pAdEasy-1、pshuttle-cmv質(zhì)粒，BJ5183、

DH5α大腸桿菌，PmeI酶購(gòu)自Qbiogene公司；攜帶p53基因的質(zhì)粒由馬延高教授惠贈(zèng)；PacI酶購(gòu)自New England公司；PCR Premix、DL2000Marker購(gòu)自TaKaPa公司；λDNA·HindⅢMarker購(gòu)自Promega公司；其他分子生物學(xué)工具酶購(gòu)自MBI公司。

1.2 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建 設(shè)計(jì)擴(kuò)增p53基因的上下游引物分別為：

p53-up:5 atg tct cga gat gga gga gcc gca gtc aga 3 （30bp），

p53-down:5 aag taa gct ttc agt ctg agt cag gcc ctt 3 （30bp），在上下游引物分別引入XhoI和HindⅢ酶切位點(diǎn)，由上海生工合成。采用上述引物以攜帶p53基因的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增p53基因片斷。PCR參數(shù)為：94℃變性5min;94℃30s、56℃30s、72℃50s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。用XhoI和HindⅢ酶切PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳回收，連接到同樣經(jīng)XhoI和HindⅢ酶切回收的pshuttle-cmv轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中；轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌，卡那霉素抗性平板篩選。

1.3 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的鑒定 挑選卡那霉素抗性平板篩選菌落培養(yǎng)，堿裂解法提取質(zhì)粒，用XhoI和HindⅢ酶切鑒定，并以能酶切出與目的基因片段大小相符的質(zhì)粒為模板，用上述引物進(jìn)行PCR鑒定。得到的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒命名為psh-p53。再用上述引物由上海生工公司測(cè)定psh-p53中目的基因片段序列。

1.4 兩步法細(xì)菌內(nèi)同源重組產(chǎn)生重組腺病毒質(zhì)粒

1.4.1 step1:用氯化鈣法制備BJ5183感受態(tài)細(xì)菌 將腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)細(xì)菌，接種在鏈霉素和氨芐青霉素抗性平板篩選，挑取菌落培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒，以pAdEasy-1為對(duì)照，用BstXI酶切鑒定，得到的陽(yáng)性菌命名為AdBJ5183菌。

1.4.2 step2:同源重組 用氯化鈣制備AdBJ5183感受態(tài)細(xì)菌；將序列正確的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒psh-p53用PmeI酶切線性化，不需滅活PmeI酶，也不需回收，直接取大約30ng酶切線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化AdBJ5183感受態(tài)細(xì)菌，卡那霉素抗性平板篩選，挑取菌落培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒，0.8%瓊脂糖電泳初篩分子量大于30kbp的質(zhì)粒，以pAdEasy-1為對(duì)照，分別用PacI、BstXI酶切鑒定，對(duì)酶切圖譜符合的質(zhì)粒采用前述擴(kuò)增目的的基因片段的引物進(jìn)行PCR鑒定。得到的陽(yáng)性菌命名為AdBJ5183-p53菌。相應(yīng)的陽(yáng)性重組腺病毒質(zhì)粒為pAdBJ5183-p53。再將AdBJ5183P53轉(zhuǎn)化DH5α得到pAdp53。

2 結(jié)果

2.1 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒psh-P53的構(gòu)建及鑒定

（1）重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒psh-P53經(jīng)XhoI和HindⅢ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，出現(xiàn)一條約7.4kg的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒帶和一條約1.2kb的p53目的基因帶，見(jiàn)圖1。

（2）以能酶切出與目的基因片段大小相符的質(zhì)粒為模板，用擴(kuò)增目的基因的引物進(jìn)行PCR鑒定。可以得到約1.2kb大小的片斷，見(jiàn)圖2。

（3）測(cè)序結(jié)果經(jīng)Vector NTI軟件分析正確。

2.2 重組腺病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

（1）將腺病毒骨架質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)菌，抽提鏈霉素和氨芐青霉素雙抗性的質(zhì)粒，對(duì)照骨架質(zhì)粒pAdEasy-1，用BstXI酶切鑒定。pAdEasy-1質(zhì)粒有6個(gè)BstXI酶切位點(diǎn)，可以產(chǎn)生6個(gè)片斷。電泳結(jié)果顯示，AdBJ5183質(zhì)粒與pAdEasy-1圖譜一致，見(jiàn)圖3。

（2）線性化的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒psh-p53轉(zhuǎn)化AdBJ5183感受態(tài)細(xì)菌進(jìn)行同源重組后，抽提卡那霉素抗性的質(zhì)粒，0.8%脂糖電泳發(fā)現(xiàn)有2種質(zhì)粒：其一分子量約34kb，為可能的重組腺病毒質(zhì)粒；另一分子量約9kb，為重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒psh-p53?？梢院苤庇^方便地初篩出可能的大片斷重組腺病毒質(zhì)粒（圖略）。

PacI酶切分子量約34kb的質(zhì)?？沙霈F(xiàn)一條約30～35kb的大片斷和一條4.5kb的特征性片斷見(jiàn)圖4。與預(yù)期結(jié)果相符。

BstXI酶切鑒定重組腺病毒質(zhì)粒 PAdEasy-1質(zhì)粒有6個(gè)BstXI酶切位點(diǎn)，可以產(chǎn)生6個(gè)片斷，依次為11921bp、8237bp、5251bp、4254bp、2379bp、1399bp。其與線性化的psh-p53在BJ5183中發(fā)生同源重組的位置只引起片斷2的改變。本實(shí)驗(yàn)采用Pshuttle-cmv為轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，同源重組后片斷2將漂移至11～12kb左右，與片斷1重疊，只可以觀察到5條帶。與預(yù)期結(jié)果相符。結(jié)果見(jiàn)圖5。

以酶切鑒定正確的重組腺病毒質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，可擴(kuò)增出與目的基因大小相符合的片斷，見(jiàn)圖6。

3 討論

傳統(tǒng)的構(gòu)建重組腺病毒的方法是在293細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行質(zhì)粒間同源重組，這些方法存在細(xì)胞類同源重組效率低、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)，給研究工作帶來(lái)了諸多不便；利用生長(zhǎng)周期快、操作方便的大腸桿菌實(shí)現(xiàn)質(zhì)粒間同源重組產(chǎn)生腺病毒的方法具有重組效率高、病毒基因組高度一致、不需蝕斑純

化篩選純系病毒等優(yōu)點(diǎn)。在進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)同源重組時(shí)，最初的方法是將腺病毒骨架質(zhì)粒和線性化的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒電穿孔共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183，這種方法需要電穿孔儀，而且重組效率相對(duì)較低；Zeng等［5］采用兩步法進(jìn)行了改進(jìn)，先用電穿孔法將骨架質(zhì)粒PAdEasy-1轉(zhuǎn)化電穿孔感受態(tài)大腸桿菌BJ5183，得到BJ5183AdEasy，再將線性化的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒電穿孔法轉(zhuǎn)化電穿孔感受態(tài)大腸桿菌BJ5183AdEasy進(jìn)行同源重組，由于該法是將轉(zhuǎn)移質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到已攜帶有骨架質(zhì)粒的繁殖能力強(qiáng)的BJ5183菌中，避免了將轉(zhuǎn)移質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到有缺陷或復(fù)制能力弱的細(xì)菌中，因而成功率提高到94%（16/17），但該法仍然需要電穿孔儀，一般實(shí)驗(yàn)室難以推廣。筆者將該兩步法的電穿孔部分改為傳統(tǒng)的氯化鈣化學(xué)轉(zhuǎn)化法，而且線性化的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒不需經(jīng)過(guò)熱滅活PmeI酶及凝膠電泳回收，直接用于轉(zhuǎn)化，也得到了較高的重組率（6/8）。本研究正在進(jìn)行p53基因重組腺病毒生物學(xué)特性的研究及對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的研究。

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第7篇：基因重組范文

關(guān)鍵詞Nef基因；SW480細(xì)胞；G418；穩(wěn)定細(xì)胞系

艾滋病（AIDS）全稱為“獲得性免疫缺陷綜合征”，是一種由人免疫缺陷病毒（HIV）引起的，以全身免疫系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p害為特征的傳染性疾病.RNA干擾（RNAi）是細(xì)胞內(nèi)序列特異性抑制靶基因表達(dá)的機(jī)制，具有高效性、特異性和副作用小的特點(diǎn)，將其應(yīng)用于抗HIV1 治療研究是近來(lái)研究熱點(diǎn)[12].RNAi抑制HIV1的復(fù)制，最直接的方法就是利用RNAi方法直接干擾HIV1病毒的RNA，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道幾乎HIVl的所有基因都可作為干擾的靶點(diǎn)：如LTR[3]〖KG-*6〗，gag[45]〖KG-*6〗，pol[6]〖KG-*6〗，vpu[7]〖KG-*6〗，vif[5]〖KG-*6〗，tat[8]和env[9]等基因.RNAi還可以將干擾的位點(diǎn)靶定到細(xì)胞上與HIV病毒感染密切相關(guān)的受體蛋白、輔助受體蛋白或其他的一些細(xì)胞因子[10].

負(fù)調(diào)控因子（negative factor，Nef） 是人免疫缺陷病毒（ HIV） 附屬蛋白之一，相對(duì)分子質(zhì)量小，柔韌性大，核心結(jié)構(gòu)呈球形.Nef 不具酶活性，具有銜接蛋白的作用，可下調(diào) CD4，主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ（MHCⅠ），主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ（MHC Ⅱ）和 CD28 分子，在對(duì)抗宿主免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用.Nef 可增強(qiáng)病毒的復(fù)制和感染性，抑制 HIV 感染細(xì)胞的凋亡，在 HIV 致病機(jī)制方面也發(fā)揮關(guān)鍵作用.基于Nef在體內(nèi)的致病機(jī)制，多種抗HIV1病毒策略被提出，使Nef成為潛在的HIV1靶點(diǎn).本文試圖構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)HIV1型Nef蛋白的SW480細(xì)胞系，為研究RNAi在艾滋病治療方面的應(yīng)用提供細(xì)胞模型.

1材料和方法

1.1材料

大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)菌、pEBMultineomyc質(zhì)粒、pNL43質(zhì)粒、SW480細(xì)胞（人結(jié)腸癌細(xì)胞）均由本實(shí)驗(yàn)室保存；RNA提取試劑TRIzol和LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司； Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ與NotⅠ購(gòu)自ThermoFisher公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和去內(nèi)毒試劑購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司；G418購(gòu)自Sigma公司；小鼠源Antimyc抗體、內(nèi)參蛋白actin抗體和HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG均購(gòu)自Santa Cruz公司；細(xì)胞培養(yǎng)所用的DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；其他常規(guī)試劑與耗材均購(gòu)自于上海生工生物科技有限公司.

1.2引物設(shè)計(jì)合成

參照pNL43質(zhì)粒上HIV1型Nef基因序列，利用Primer Premier 5 以及Nebcutter 2.0軟件設(shè)計(jì)的引物如下：Nef正向引物，5′CGCGGATCCGGGTGGCAAGTGGGTC3′；Nef反向引物，5′ATTTGCGGCCGCTCAGCAGCTCTTGAAGTAC 3′.分別在上游引物和下游引物5′端加上了BamHⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)和相應(yīng)的保護(hù)堿基，引物由上海生工生物有限公司合成.

1.3HIV1型Nef片段的擴(kuò)增

以pNL43質(zhì)粒為模板，使用Ex Taq DNA聚合酶，采用PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)HIV1型Nef基因編碼區(qū)，全長(zhǎng)640 bp.PCR擴(kuò)增體系（20 μL）：10× Buffer 2 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，0.5 g/L pNL43質(zhì)粒 1 μL，正向引物和反向引物（10 nmol/L）各1 μL，Ex Taq DNA聚合酶 0.25 μL，ddH2O 14.5 μL.PCR 的擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)，72 ℃繼續(xù)延伸10 min.得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，根據(jù)片段大小用DNA純化試劑盒進(jìn)行切膠回收.

1.4HIV1型Nef真核表達(dá)載體構(gòu)建

將上述PCR產(chǎn)物和pEBMultineomyc質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和NotⅠ雙酶切后， 1%瓊脂糖凝膠電泳分離，膠回收純化，經(jīng)T4 DNA連接酶過(guò)夜連接后轉(zhuǎn)化E.coli TOP10感受態(tài)，卡那霉素LB固體培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆擴(kuò)增后，進(jìn)行菌液PCR鑒定，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和DNA測(cè)序鑒定.

1.5重組表達(dá)載體的瞬時(shí)表達(dá)及Western Blot檢測(cè)

SW480細(xì)胞培養(yǎng)于添加10%胎牛血清和100×青霉素鏈霉素雙抗混合液的DMEM培養(yǎng)液中，在轉(zhuǎn)染前，將細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿，接種量為2×106個(gè)細(xì)胞，過(guò)夜培養(yǎng)使其密度達(dá)80%～90%.參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，將8 μg pEBmycnef重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染空載體pEBMultineomyc質(zhì)粒的SW480細(xì)胞為對(duì)照，48 h后收集細(xì)胞.冰上收獲細(xì)胞，經(jīng)裂解后離心取上清，加入上樣緩沖液和DTT煮沸10 min.用10%SDSPAGE膠分離細(xì)胞蛋白，上樣20 μg.110 V恒壓80 min轉(zhuǎn)至PVDF膜上.將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜用含5%的脫脂奶粉過(guò)夜封閉.再孵育小鼠抗myc的抗體，充分洗膜，隨后孵育HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG，充分洗膜.然后各取1 mL ECL化學(xué)發(fā)光試劑A和B液混勻，5 min后平鋪于膜的蛋白面，〖HJ2.1mm〗通過(guò)顯影儀（Tonon公司）顯影拍照.

1.6SW480細(xì)胞G418最低致死濃度的測(cè)定

將SW480細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，在CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng).待細(xì)胞密度達(dá)到80%后，使用不同濃度G418（0，100， 200，300，400，500，600，700，800，900，1000 mg/L）的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，每天更換培養(yǎng)基，連續(xù)觀察12 d，確定全部細(xì)胞死亡的最低濃度，即為最佳的G418Y選濃度.

1.7穩(wěn)定表達(dá)Nef基因的SW480細(xì)胞株的篩選和鑒定

SW480細(xì)胞接種于24孔板，培養(yǎng)16 h，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至匯合度達(dá)80%時(shí)，將0.8 μg pEBmycnef質(zhì)粒在20μL脂質(zhì)體Lipofectamine 2000TM介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞.48 h后將細(xì)胞1∶10稀釋轉(zhuǎn)種24孔板，同時(shí)加入終濃度為900 mg/L的G418，同時(shí)設(shè)pEBMultineomyc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)照.2～3 d換液1次，待大部分細(xì)胞死亡之后，改用450 mg/L G418的培養(yǎng)液維持壓力篩選3周，挑出單個(gè)細(xì)胞集落，有限稀釋到96孔板進(jìn)行單克隆篩選，篩選出的單克隆細(xì)胞依次于48孔、12孔、6孔板及6 cm和10 cm培養(yǎng)皿擴(kuò)大培養(yǎng).擴(kuò)大培養(yǎng)到一定量后，進(jìn)行冷凍保存.剩余的一些細(xì)胞連續(xù)傳代60 d以上（約30代），取一部分細(xì)胞進(jìn)行Nef的RTPCR檢測(cè)和Western Blot檢測(cè)，確保細(xì)胞株的穩(wěn)定性.

2結(jié)果

2.1HIV1 Nef基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

使用PCR方法擴(kuò)增Nef基因產(chǎn)物，將20 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳后，可見(jiàn)1條約640 bp大小的片段（如圖1），片段大小符合預(yù)期，說(shuō)明已成功擴(kuò)增出HIV1 Nef基因.

2.2真核表達(dá)載體pEBmycNef的鑒定

2.2.1轉(zhuǎn)化菌中Nef基因的PCR鑒定將上述過(guò)夜連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli Top10感受態(tài)細(xì)胞，卡那霉素LB固體培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，挑取4個(gè)克隆擴(kuò)增后，進(jìn)行菌夜PCR鑒定，結(jié)果如圖2所示，瓊脂糖電泳可見(jiàn)一條約為640 bp大小的Nef目的基因條帶，與預(yù)期的條帶大小吻合.

2.2.2重組表達(dá)質(zhì)粒pEBmycNef的雙酶切鑒定

重組載體pEBmycNef經(jīng)BamH Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切后，瓊脂糖電泳可見(jiàn)一條約為640 bp大小的Nef目的基因條帶，一條為10 223 bp大小的pEBMultineomyc條帶（圖3），說(shuō)明載體構(gòu)建正確.

PCR擴(kuò)增的Nef全長(zhǎng)DNA序列插入pEBMultineomyc載體，測(cè)序結(jié)果與pNL43質(zhì)粒報(bào)道的Nef序列相符，表明Nef全長(zhǎng)編碼區(qū)DNA成功插入到pEBMultineomyc質(zhì)粒中，且插入方向和閱讀框架均正確.

2.3SW480細(xì)胞G418最低致死濃度的測(cè)定

使用G418終濃度分別為0～1 000 mg/L的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)SW480細(xì)胞，觀察細(xì)胞的死亡情況. 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加藥后1 d，細(xì)胞形態(tài)正常，未出現(xiàn)明顯的變化；持續(xù)篩選7 d，大量細(xì)胞開(kāi)始脫落死亡，貼于培養(yǎng)皿底部的細(xì)胞逐漸變圓；至12 d，細(xì)胞全部死亡（圖4）.確定SW480細(xì)胞全部死亡的最低濃度為900 mg/L.

2.4Nef基因在SW480細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)

將重組質(zhì)粒pEBmycNef和載體質(zhì)粒pEBMultineomyc分別轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞，收集細(xì)胞，裂解后上樣進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示.重組質(zhì)粒pEBmycNef轉(zhuǎn)染細(xì)胞中在約29 000處有特異性條帶，而載體質(zhì)粒pEBMultineomyc轉(zhuǎn)染細(xì)胞中沒(méi)有，表明HIVl Nef基因在SW480細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá).圖中actin蛋白為內(nèi)參蛋白.

2.5穩(wěn)定表達(dá)Nef基因的SW480細(xì)胞系的鑒定

pEBmycNef質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后，經(jīng)G418抗性篩選3周后，在顯微鏡下挑選出了4個(gè)細(xì)胞集落，經(jīng)傳代擴(kuò)增后，用Western Blot技術(shù)檢測(cè)到Nef的表達(dá)，而空載對(duì)照SW480細(xì)胞則未檢測(cè)到Nef基因的表達(dá)（圖6），并且在連續(xù)傳代60 d后，通過(guò)RTPCR技術(shù)和Western Blot技術(shù)，仍可以檢測(cè)到 Nef基因的轉(zhuǎn)錄（圖7）與表達(dá)（圖8）.以上結(jié)果表明，已篩選到穩(wěn)定表達(dá)HIV1型Nef基因的SW480細(xì)胞株.

3討論

RNAi通過(guò)降解mRNA或抑制蛋白質(zhì)來(lái)沉默基因這種技術(shù)在生物學(xué)研究領(lǐng)域具有極重要的意義，RNAi不僅可以作為基因功能研究與評(píng)價(jià)的方法工具，它還可以作為一種基因治療的手段.2001年Tusehl研究組開(kāi)創(chuàng)了RNAi技術(shù)治療人類疾病的新途徑.將RNAi用于病毒性疾病的治療和預(yù)防研究取得了一些顯著的效果，比如乙肝病毒（HBV）[13]、丙肝病毒（HCV）[14]、人瘤病毒（HPV）[15]、EB病毒[16].將RNAi應(yīng)用于艾滋病治療的文獻(xiàn)也不計(jì)其數(shù)[17]，這些研究都為HIV1的基因治療提供了很好的參考依據(jù).但是RNAi還無(wú)法應(yīng)用于臨床治療艾滋病，阻礙這一進(jìn)程的是RNAi的傳遞模式.

2006年，向雙林等提出利用修改過(guò)的非治病性細(xì)菌在體內(nèi)及體外定向傳遞shRNA到靶細(xì)胞中以發(fā)揮干擾作用.他們將這種依賴細(xì)菌進(jìn)行的RNAi傳遞技術(shù)稱之為TransKingdom RNAi （tkRNAi）[18].該研究的最終目的是將這種依賴細(xì)菌進(jìn)行的RNAi傳遞技術(shù)應(yīng)用到干擾艾滋病病毒的基因研究中，試圖探尋更有效的RNAi傳遞方法，為將RNAi應(yīng)用到臨床上治療艾滋病提供理論依據(jù).由于HIV病毒基因的RNAi干擾實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)無(wú)法進(jìn)行，構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達(dá)HIV1型病毒蛋白的細(xì)胞模型顯得至關(guān)重要.

本實(shí)驗(yàn)從pNL43質(zhì)粒上擴(kuò)增出Nef基因，隨后與pEBMultineomyc質(zhì)粒共同經(jīng)BamHⅠ和NotⅠ雙酶切，連接并轉(zhuǎn)化構(gòu)建成pEBmycnef真核表達(dá)質(zhì)粒.通過(guò)菌液PCR驗(yàn)證、雙酶切驗(yàn)證和DNA測(cè)序分析證明nef全長(zhǎng)編碼區(qū)DNA成功插入到pEBMultineomyc質(zhì)粒中，且插入方向和閱讀框架均正確.利用 LipofectamineTM 2000將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，裂解細(xì)胞，收集蛋白，利用Western Blot技術(shù)檢測(cè)到 Nef蛋白的瞬時(shí)表達(dá).然后利用G418篩選建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的方法，首次建立了穩(wěn)定表達(dá)HIV1型Nef基因的SW480細(xì)胞系，為研究tkRNAi在艾滋病治療方面的應(yīng)用提供了細(xì)胞模型.

⒖嘉南祝

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第8篇：基因重組范文

【關(guān)鍵詞】 急性心肌梗死；心力衰竭；基因重組人腦利鈉肽

DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2017.17.053

心力衰竭在21世紀(jì)已經(jīng)成為醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)的重點(diǎn)關(guān)注疾病， 在過(guò)去的40年中， 心力衰竭死亡患者數(shù)量出現(xiàn)了急劇增加。并且心力衰竭患者集中在中老年， 心力衰竭作為一種較為嚴(yán)重的心內(nèi)科病癥， 其常見(jiàn)致病疾病為心肌梗死， 患者出現(xiàn)急性心肌梗死后會(huì)進(jìn)一步出現(xiàn)心臟排血量的異常， 同時(shí)患者的組織器官灌注不足， 從而導(dǎo)致患者出現(xiàn)瘀血綜合征[1]。本研究就本院接診的急性心肌梗死合并心力衰竭患者進(jìn)行分組， 探究基因重組人腦利鈉肽的應(yīng)用效果?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2015年9月～2016年9月在心內(nèi)科掛號(hào)住院診治的急性心肌梗死合并心力衰竭患者80例作為研究對(duì)象， 所有患者均已確診病情， 患者服用硝酸甘油不能有效緩解病情， 同時(shí)患者的心電圖檢查顯示有兩個(gè)及以上的ST段抬高， 患者的心肌損傷標(biāo)志物升高， 同時(shí)排除有心源性的休克以及收縮壓

兩組患者年齡、性別等一般資料比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）， 具有可比性。

1. 2 方法 對(duì)照組患者在治療中實(shí)施常規(guī)治療， 對(duì)患者進(jìn)行常規(guī)抗血小板凝集、斑塊穩(wěn)定以及心肌重塑逆轉(zhuǎn)治療， 患者的硝酸甘油起始劑量為5 μg/（kg?min）， 患者每10分鐘進(jìn)行劑量調(diào)整， 保證患者的血壓穩(wěn)定， 對(duì)患者進(jìn)行連續(xù)的靜脈滴注， 同時(shí)對(duì)有溶栓指標(biāo)的患者進(jìn)行阿替普酶的靜脈滴注[3]。觀察組患者則應(yīng)用基因重組人腦利鈉肽進(jìn)行治療， 其首次負(fù)荷劑量為1.5 μg/kg， 進(jìn)行勻速靜脈滴注， 然后進(jìn)行持續(xù)的靜脈滴注， 持續(xù)3 d， 維持劑量為0.0075 μg/（kg?min）， 在此過(guò)程中要保證患者的血壓穩(wěn)定。

1. 3 觀察指標(biāo)及療效判定標(biāo)準(zhǔn) 對(duì)比兩組患者的臨床治療效果以及患者治療后的尿量、左室射血分?jǐn)?shù)。療效判定標(biāo)準(zhǔn)[4]：顯效：患者的心功能改善≥2級(jí)；有效：患者的心功能改善1級(jí)；無(wú)效：患者的心功能改善

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn)。P

2 結(jié)果

^察組治療顯效12例、有效24例、無(wú)效4例， 總有效率為90.0%；對(duì)照組治療顯效9例、有效16例、無(wú)效15例， 總有效率為62.5%。觀察組患者臨床治療總有效率明顯高于對(duì)照組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

3 討論

急性心肌梗死是由于冠狀動(dòng)脈內(nèi)部出現(xiàn)不穩(wěn)定斑塊的破裂， 導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈內(nèi)部受到刺激而出現(xiàn)血小板凝集的血栓， 隨著血栓的累積堵塞管腔， 導(dǎo)致患者的管腔狹窄或者閉塞， 從而引發(fā)心肌缺血和供氧不足。相關(guān)研究指出對(duì)于心肌梗死患者其梗死面積越大則心肌的收縮能力越差， 患者的狀況越差， 導(dǎo)致心臟功能出現(xiàn)衰竭， 患者很容易引發(fā)呼吸困難以及肺水腫等合并癥， 病情控制不當(dāng)很容易引發(fā)心力衰竭， 對(duì)患者的生命安全帶來(lái)巨大威脅。腦利鈉肽是上世紀(jì)從豬腦組織中提取出來(lái)并檢測(cè)到的一種內(nèi)源性激素， 是由左心室的心肌細(xì)胞合成并分泌， 其具有較為明顯的利尿降血壓作用。在心力衰竭患者體內(nèi)， 其腦鈉肽的分泌有出現(xiàn)代償性增加， 對(duì)患者的心臟功能進(jìn)行代償性增強(qiáng)[5]。

本研究結(jié)果顯示， 觀察組治療總有效率為90.0%， 高于對(duì)照組的62.5%， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

總之， 急性心肌梗死合并心力衰竭患者在臨床診治過(guò)程中應(yīng)用基因重組人腦利鈉肽治療對(duì)患者的病癥有很好的改善， 同時(shí)提升治療效果， 值得在臨床治療中推廣應(yīng)用。

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第9篇：基因重組范文

【摘要】 目的：觀察ompL17基因表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性以及該表達(dá)蛋白在動(dòng)物模型中的分布情況。方法：提取鉤端螺旋體017株基因組DNA，擴(kuò)增出ompL17基因，與表達(dá)載體pGEX4T1重組，誘導(dǎo)表達(dá)OMPL17蛋白，分析該基因在017株中體外不同溫度的表達(dá)情況。結(jié)果：PCR和酶切分析證實(shí)構(gòu)建成功了表達(dá)載體，SDSPAGE分析證實(shí)誘導(dǎo)表達(dá)出OmpL17蛋白；體外不同溫度下發(fā)現(xiàn)該基因不表達(dá)蛋白。結(jié)論：成功表達(dá)出ompL17基因的蛋白，體外不同溫度未發(fā)現(xiàn)該蛋白的表達(dá)，為賴型鉤體的分子機(jī)制的闡明奠定了基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】 鉤端螺旋體；克隆；表達(dá)；體內(nèi)分布

鉤端螺旋體?。ê?jiǎn)稱鉤體?。┦怯摄^端螺旋體引起的一種人獸共患自然免疫源性疾病，嚴(yán)重危害人類的健康和農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)。賴型鉤體56601和哥本哈根型的測(cè)序完成[1，2]為鉤體基因組學(xué)及其功能蛋白學(xué)的研究提供了一個(gè)新的契機(jī)。ompL17基因作為本研究室從賴型鉤體強(qiáng)毒株中獨(dú)立獲得的基因，經(jīng)過(guò)基因打靶技術(shù)初步斷定為毒力相關(guān)基因。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，OmpL17屬于外膜蛋白，可能與鉤體毒力相關(guān)。因此選擇ompL17基因進(jìn)行克隆表達(dá)，分析其在大腸桿菌中的表達(dá)以及賴型鉤體017株中不同溫度下的表達(dá)研究，探討該基因是否體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)，將有助于鉤體致病的分子機(jī)理的解釋。

1 材料與方法

1.1材料

問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體賴型017株（Leptospira interrogans serovar Lai strain 017）由成都生物制品所提供，本室保存，連續(xù)在豚鼠中傳代培養(yǎng)以保持毒力。實(shí)驗(yàn)用菌株于Kornthof培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)7 d，菌數(shù)達(dá)1010條。pGEX4T1載體購(gòu)自PROMEGA 公司，大腸桿菌JM109株由本室保存。限制性內(nèi)切酶BamHI、HindⅢ，T4 DNA連接酶、牛小腸堿性磷酸酶、MassRulerTM DNA Ladder、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)均為MBI公司產(chǎn)品；ELISA 檢測(cè)試劑盒由晶美生物工程有限公司。BCA Protein Assay Reagent Kit為PIERCE公司產(chǎn)品，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分裝（分析純）。

1.2方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)參照ompL17基因全序列設(shè)計(jì)鉤體ompL17基因，P1：5’ GTC GGA TCC CGT ATG ACC CTA GAG TCC TTG–3’；P2：5’ GCG GAA TTC GTT TAT CAA AAA GGC CAT CG3’，序列中引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn) 。

1.2.2鉤體ompL17基因的擴(kuò)增回收、酶切及純化：參見(jiàn)Terpstra 等方法[3]并稍作修改進(jìn)行鉤體基因組DNA的提取與純化。以純化的鉤體017株基因組DNA為模板，反應(yīng)體系如下: 模板2 μl，Taq 0.5 μl，dNTP 4.0 μl，P1 1.0 μl，P2 1.0 μl，Sterile H2O 38.5 μl，10×PCR buffer 5.0 μl。循環(huán)參數(shù)：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30sec，59 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30循環(huán)，72 ℃延伸6 min。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定后以PCR產(chǎn)物純化試劑盒（Roche）純化回收，操作程序參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。然后用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切該產(chǎn)物，純化后備用。

1.2.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒pGEX 4T1的連接及轉(zhuǎn)化[4]：提取質(zhì)粒pGEX 4T1，加入BamHⅠ和EcoRⅠ37 ℃進(jìn)行雙酶切，純化后與同樣酶切過(guò)的ompL17基因混合，在T4連接酶作用下連接。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109株，取轉(zhuǎn)化后的菌液均勻涂布于含氨芐青霉素50 μg/ml LB平板上培養(yǎng)過(guò)夜。重組質(zhì)粒的篩選與鑒定：從轉(zhuǎn)化后生長(zhǎng)后的平板上挑取白色單菌落于含氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中增殖后提取質(zhì)粒DNA，通過(guò)酶切分析、PCR擴(kuò)增鑒定以及測(cè)序篩選出正確重組子。

1.2.4重組質(zhì)粒pGSTOmpL17在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)分別挑取含空質(zhì)粒pGEX4T1和含重組質(zhì)粒pGSTompL17的菌落接種于LB培養(yǎng)液培養(yǎng)過(guò)夜，次日取菌液按比例接種于LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)2小時(shí)后加入IPTG至終濃度1 mmol/L，在誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h時(shí)收集菌液，菌體懸于含溶菌酶的PBS中，經(jīng)反復(fù)凍融裂解細(xì)菌至菌液清亮，取裂解液上清、沉淀及收集的細(xì)菌培養(yǎng)液進(jìn)行SDSPAGE電泳，分析OmpL17蛋白的表達(dá)量及表達(dá)形式。

1.2.5賴型鉤體在體外不同溫度OmpL17蛋白表達(dá)分析[5]賴型鉤體017和雙曲鉤體PatocⅠ培養(yǎng)好后，將賴型鉤體017放在28 ℃、30 ℃和37 ℃三種溫度條件進(jìn)行培養(yǎng)24小時(shí)，然后將上述鉤體離心分鐘集菌。菌液沉淀用PBS洗滌，再用離心收集沉淀。將沉淀用PBS溶解，用純化蛋白做陽(yáng)性對(duì)照，用PatocⅠ做陰性對(duì)照，SDSPAGE操作同前，電泳后的凝膠利用半干法將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上。TTBS洗膜后加入含辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG的TTBS液中孵育后再用TTBS洗膜，加入底物二氨基聯(lián)苯胺（DAB）液顯色，直至有條帶出現(xiàn)時(shí)用蒸餾水洗滌終止反應(yīng)。

2結(jié)果

2.1 ompL17基因的PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定

以賴型017株為模板，用引物P1、P2在適宜條件擴(kuò)增出約900bp左右的特異片段見(jiàn)Fig.1。

2.2pGEX 4T1質(zhì)粒DNA的提取與純化

堿裂解法提取pGEX 4T1質(zhì)粒，電泳結(jié)果顯示質(zhì)粒DNA有超螺旋、線性、環(huán)狀三種形式的條帶出現(xiàn)，無(wú)蛋白和RNA的污染（Fig.2）。

2.3 重組質(zhì)粒的克隆及鑒定

賴型鉤體基因ompL17的PCR片段與載體pGEX 4T1質(zhì)粒純化后經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切，連接酶作用下經(jīng)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中，挑取菌落在LB中培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒DNA，以凝膠電泳初步檢測(cè)比pGEX 4T1 DNA分子量大的質(zhì)粒。酶切分析顯示BamH I 和EcoR I雙酶切產(chǎn)生4.9 kb和900 bp 兩條酶切條帶提示該重組質(zhì)粒已包含-900 bp的插入片段（圖3）。以該重組質(zhì)粒pGSTOmpL17為模板，以引物P1、P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能擴(kuò)出約900 bp條帶，而以空質(zhì)粒為模板未擴(kuò)出相應(yīng)條帶，進(jìn)一步證實(shí)重組質(zhì)粒pGSTompL17構(gòu)建成功（圖4）。

2.4 重組質(zhì)粒pGSTOmpL17在大腸桿菌中的融合表達(dá)

在變性聚丙烯酰胺凝膠上，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pGEX4T1表達(dá)產(chǎn)物在26KD處出現(xiàn)GST蛋白帶，而未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pGEX4T1沒(méi)有26KD條帶出現(xiàn)；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pGSTompL17表達(dá)產(chǎn)物在54KD處出現(xiàn)濃的蛋白帶。用不同劑量IPTG和改變IPTG誘導(dǎo)時(shí)間，可提高融合蛋白的表達(dá)量。SDSPAGE 結(jié)果見(jiàn)Fig.5。

2.5 賴型鉤體017在體外不同溫度OmpL17蛋白表達(dá)分析

分別取賴型鉤體017株在28 ℃、30 ℃、37 ℃三種溫度下表達(dá)蛋白和patoc在28 ℃表達(dá)蛋白和陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜和Western–blotting檢測(cè)，結(jié)果陽(yáng)性對(duì)照在約54KDa處檢測(cè)到陽(yáng)性雜交信號(hào)，而賴型鉤體56601和patoc無(wú)雜交信號(hào)（Fig.6）。

3討論

鉤端螺旋體外膜研究一直是鉤體分子生物學(xué)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。但是，目前鉤體外膜在致病過(guò)程中的作用機(jī)制仍不十分清楚。1993年，外膜蛋白的研究才有報(bào)道，首先Haake等從外膜蛋白純化分離入手，克隆測(cè)序了外膜蛋白OmpL1[6]，以后幾個(gè)膜脂蛋白LipL41[7]，LipL36[8]，LipL32[9] 用同樣的方法得到分離。研究表明這幾個(gè)外膜蛋白可能與鉤體致病和免疫保護(hù)有一定的相關(guān)性。本研究結(jié)果表明ompL17基因可以進(jìn)行重組表達(dá)，但是該基因在賴型鉤體017中體外不同溫度下的蛋白表達(dá)情況表明，該基因在賴型鉤體017的培養(yǎng)液中在28 ℃、30 ℃、和37 ℃培養(yǎng)都不表達(dá)，結(jié)合本研究者已做的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明該蛋白在賴型鉤體中是體外不表達(dá)而是在體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)。

目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)確認(rèn)的鉤體毒力因子為鉤體的溶血素蛋白，同時(shí)溶血素[10]有三種類型：酶類，成孔蛋白類和表面活性劑類。問(wèn)號(hào)狀賴型鉤體測(cè)序完成后[1]，通過(guò)全基因組ORF分析，發(fā)現(xiàn)9個(gè)基因與GenBank/NCBI或EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的溶血素基因相似或者相同。目前已發(fā)現(xiàn)[11]鉤體的又一種新的溶血素基因，它是鞘磷脂酶樣的蛋白質(zhì)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)它是鉤體體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)，而鉤體在體外培養(yǎng)不表達(dá)該蛋白質(zhì)，還發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)對(duì)馬肺內(nèi)皮細(xì)胞有細(xì)胞毒性，同時(shí)對(duì)馬和兔的紅細(xì)胞有一定的溶血活性。OmpL17作為一種在體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)蛋白質(zhì)，或許在鉤體致病過(guò)程中起著重要作用，但是其在鉤體致病中的具體作用以及是否與鉤體是否相關(guān)有待于進(jìn)一步的分析和探討。

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