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[關(guān)鍵詞] 組蛋白去乙?;?吸煙;慢性阻塞性肺病
[中圖分類號] R563[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1673-7210(2009)07(c)-016-04
Relationship between HDAC activity and lung function as well as smoking in peripheral blood mononuclear cells of COPD patients
CHEN Yanwei1, YANG Jiong2
(1.Department of Pulmonary Medicine, Shenzhen Nanshan Hospital of Guangdong Medical College, Shenzhen518052, China; 2.Department of Pulmonary Medicine, People's Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China)
[Abstract] Objective: To investigate the histone deacetylase (HDAC) activity in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of COPD patients, and determine the relationship between HDAC activity in PBMC and lung function as well assmoking quantity in COPD patients. Methods: COPD patients, healthy smokers and healthy nonsmokers were selected in our study. The peripheral blood of all subjects were obtained, and PBMC was separated via density gradient centrifugation. Histone was extracted and HDAC activity was detected. The lung function, smoking information of all subjects were recorded. Results: HDAC activity in PBMC from COPD patients was decreased by 40% compared with normal nonsmokers [(12.86±6.14) μmol/(L?μg) and (21.39±4.92) μmol/(L?μg), P=0.000)], this decrease showed statistical significance in stage 1, 2 and 3. HDAC activity in PBMC from healthy smoker was 40% lower than healthy nonsmokers [(12.50±4.27) μmol/(L?μg) and (21.39±4.92) μmol/(L?μg), P=0.000]. HDAC activity in PBMC from COPD was negatively correlated with smoking quantity (r=-0.867, P=0.000 for COPD patients; r=-0.607, P=0.000 for all subjects). In COPD patients who smoked more than 35 pack years and smoked less than 35 pack years, the HDAC activity in PBMC of the former decreased more than a half than that of the later. Conclusion: Smoking is one of the important reasons causing the decrease of HDAC activity in PBMC of COPD patients. HDAC activity in PBMC of COPD patients shows zero correlation with lung function (FEV1, FEV1%, FVC, FVC% and FEV1/FVC), suggesting smoking may have different mechanisms on the local and whole damage of lung.
[Key words] Histone deacetylase; Smoking; Chronic obstructive pulmonary disease
肺部炎癥是引起慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)氣流受限(肺功能)的主要原因。有研究表明,肺部炎癥的標(biāo)志物(IL-8、IL-6、CRP等)與氣流受限(肺功能)程度呈正相關(guān)。COPD患者肺組織和肺泡巨噬細(xì)胞中的HDAC活性與氣流受限呈正相關(guān),HDAC活性越低,氣道炎癥越重,FEV1%越低[1]。HDAC活性降低源于吸煙引起的氧化應(yīng)激的損傷。吸煙可引起直接肺氧化應(yīng)激損傷,也可引起間接的系統(tǒng)性氧化應(yīng)激。
肺泡巨噬細(xì)胞由外周血單核細(xì)胞遷移至肺分化而來。因此,本研究假設(shè)外周血單核細(xì)胞中HDAC活性低于健康對照,并觀察外周血單核細(xì)胞中HDAC活性與COPD患者氣流受限(肺功能)的關(guān)系,同時觀察吸煙量與HDAC活性的關(guān)系,以觀察HDAC活性是否受吸煙量的影響。
1 對象與方法
1.1 受試者基本情況
收集在武漢大學(xué)人民醫(yī)院體檢及就診的穩(wěn)定期COPD患者。正常對照為健康志愿者。經(jīng)患者知情同意,抽取外周靜脈血20 ml,加少量肝素抗凝,在4 h內(nèi)進(jìn)行外周血細(xì)胞分離。
1.2 穩(wěn)定期COPD診斷及分級標(biāo)準(zhǔn)
參照GOLD(2006修訂版)和中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會慢性阻塞性肺疾病學(xué)組制訂的慢性阻塞性肺病診治指南(2002)。所有患者均除外心、腦血管、肝、腎疾病、糖尿病、腫瘤、風(fēng)濕、結(jié)締組織疾病,以及肺結(jié)核、支氣管擴(kuò)張、支氣管哮喘及肺纖維化患者。
1.3 肺功能測定
所有受試者均行肺功能測定,采用Vmax6200(American Sensormedics, Vmax 229 series,Yorba Linda,California)肺功能系統(tǒng)檢測FVC、FVC%、FEV1、FEV1%、FEV1/FVC,由同一熟練技師操作,以保證測試的一致性。每位被測試者肺功能測定前3 d內(nèi)未使用支氣管擴(kuò)張劑,2周內(nèi)未使用茶堿和激素。
測試方法:吸入200 μg葛蘭素后10 min,平靜正常呼吸,遂后充分吸氣至肺總量位,迅速用最大力呼氣,呼氣時間≥6 s,或時間-容量曲線顯示呼氣相平臺出現(xiàn)且超過2 s后,用最快速度用力吸氣至肺總量位。每個被測試者分別至少測定3次(一般最多不超過8次),每個被測試者最佳值與次佳值2次差異小于5% FVC或0.5 L)。
1.4 人外周血單核細(xì)胞分離
人外周血單核細(xì)胞分離用密度梯度離心法[2]。將靜脈血與Hank's buffered salt solution (HBSS)1×緩沖液1∶1混合后共40 ml,裝于50 ml試管中。將混合血與人淋巴細(xì)胞分離液(Lymphoprep,Norway,1.077 g/ml)以2∶1體積混合。配平后用TDL-40L高速水平離心機(jī)離心,2 000 r/min(1 100 g/min),30 min。吸取中間白色薄霧層于新管。加HBSS于每管,將吸取液與HBSS混勻,HBSS體積大于1倍吸取液體積。配平后1 100 r/min,離心8 min。棄上清,加入HBSS吹打,移入一新試管中離心1 000 r/min,8 min,棄上清。將剩余液體混勻,吸取少量于細(xì)胞計數(shù)板計數(shù),并用臺盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞活性。如果細(xì)胞總數(shù)大于1×107個/ml,活性大于95%,視為合格標(biāo)本;用1 ml槍頭吸取剩余液體于標(biāo)記Ep管中,-70℃凍存。 1.5 直接組蛋白提取
組蛋白提取用HCl和H2SO4 4℃過夜法[3]。裂解液[10 mmol/L Tris-HCl,pH 6.5,50 mmol/L亞硫酸氫鈉,1% Triton X-100, 10 mmol/L MgCl2,8.6%蔗糖,完全蛋白酶抑制劑混合物(羅氏分子生化公司),20 min,4℃];核沖洗緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl,13 mmol/L EDTA,pH 7.4)。
將細(xì)胞微離心5 min;用冰凍裂解緩沖液反復(fù)沖洗片狀沉淀物,直至浮于表面的物質(zhì)清除(每次離心7 500 g/min,5 min)。用核沖洗緩沖液沖洗核片狀沉淀物,并且用50 μl 0.2 mol/L HCl和0.2 mol/L H2SO4在蒸餾水中懸浮。4℃過夜提取細(xì)胞核,微離心剩余物質(zhì)10 min,用1 ml冰凍丙酮混合上清液,-20℃過夜。微離心樣本10 min,用丙酮沖洗,干燥,并用蒸餾水稀釋。含有組蛋白的上清液樣品用Bradford protein kit(Bio-Rad)定量。Bradford法(考馬斯亮藍(lán))測組蛋白濃度。
1.6 HDAC活性檢測
細(xì)胞核提取物HDAC活性檢測使用HDAC活性熒光分析試劑盒(Cayman,USA),嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。
1.7 統(tǒng)計學(xué)處理
結(jié)果用SPSS 11.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多組間比較采用方差分析;相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析;P
2 結(jié)果
2.1 一般資料
COPD患者26例,均為吸煙者,其中,1期7例,2期8例,3期8例,4期3例;健康吸煙者10例;健康非吸煙者13例,所有受試者均為男性,其身高、體重等無顯著性差異(P>0.05)。COPD組與健康吸煙組吸煙量無顯著性差異(P>0.05)。COPD組平均年齡高于健康吸煙組和健康非吸煙組(P0.05)。
2.2 COPD患者外周血單核細(xì)胞中的HDAC活性
COPD患者外周血單核細(xì)胞總HDAC活性較健康非吸煙者低40%左右[(12.86±6.14) μmol/(L?μg)和(21.39±4.92) μmol/(L?μg),P=0.000];在1、2、3期達(dá)到顯著性差異(圖1);其活性與健康吸煙者比較,無顯著性差異[(12.86±6.14) μmol/(L?μg)和(12.50±4.27) μmol/(L?μg),P=0.864]。健康吸煙者外周血單核細(xì)胞中的HDAC活性較健康非吸煙者低40%,與COPD患者比較,無顯著性差異(P>0.05)。
圖1外周血單核細(xì)胞中的HDAC活性比較
Fig. 1Comparison of HDAC activity of PBMC among subgroups
2.3 COPD患者外周血單核細(xì)胞中的HDAC活性與肺通氣功能的關(guān)系
COPD患者外周血單核細(xì)胞中HDAC活性與肺通氣功能均無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)(表1)。
表1 外周血單核細(xì)胞中HDAC活性與FVC、FEV1、FEV1/FVC的關(guān)系
Tab.1 Relationship between FVC, FEV1, FEV1/FVC
and HDAC activity of PBMC
2.4 吸煙受試者外周血單核細(xì)胞中HDAC活性與吸煙量的關(guān)系
外周血單核細(xì)胞中的HDAC活性與吸煙量(包年)呈負(fù)相關(guān)(在COPD患者中,r=-0.867,P=0.000;在所有吸煙者中,r=-0.607,P=0.000)(圖2)。
圖2外周血單核細(xì)胞中HDAC活性與吸煙的關(guān)系
(A:COPD患者;B:所有吸煙者)
Fig. 2Relationship between HDAC activity in PBMC and
smoking quantity
(A: COPD patients; B: all subjects enrolled)
吸煙量超過35包年的COPD患者外周血單核細(xì)胞中的HDAC活性平均值明顯低于吸煙量低于35包年者(圖3)。
圖3吸煙量對COPD患者外周血單核細(xì)胞
中HDAC活性平均值的影響
Fig. 3Effect of smoking quantity on mean HDAC
activity of PBMC in COPD
3 討論
研究結(jié)果顯示,COPD患者外周血單核細(xì)胞中的HDAC活性低于健康非吸煙者,與健康吸煙者比較,無顯著性差異;COPD患者外周血單核細(xì)胞中HDAC活性的降低與COPD氣流受限(肺功能)無明顯相關(guān),與患者吸煙量呈負(fù)相關(guān),提示外周血單核細(xì)胞中的HDAC活性降低可能是吸煙的直接作用。
穩(wěn)定期COPD患者外周血單核細(xì)胞中的HDAC活性降低與相同吸煙量的非COPD吸煙者的下降相同,而且兩組研究對象隨吸煙量增加,HDAC的下降更為明顯,提示人外周血單核細(xì)胞中HDAC下降與吸煙密切相關(guān)。
吸煙也可以引起染色體重構(gòu)[4],影響NF-κB的表達(dá),促使炎癥基因表達(dá)[5]。吸煙時每噴煙霧中至少含有10種氧化分子[6],這些氧化分子可以產(chǎn)生氧化應(yīng)激(oxidative stress)。吸煙引起的氧化應(yīng)激使細(xì)胞核HDAC活性降低,同時可以明顯降低上皮細(xì)胞的HDAC2表達(dá)[7-8],使炎癥因子表達(dá)增加;這種氧激發(fā)可以被抗氧化物N-乙酰半胱氨酸所阻斷[9]。健康吸煙者肺泡巨噬細(xì)胞HDAC活性低于健康不吸煙者[10]。氧化應(yīng)激可以通過影響細(xì)胞核HDAC活性而影響炎癥基因的表達(dá)。體外研究顯示,氧化應(yīng)激可以明顯降低HDAC活性和上皮細(xì)胞HDAC2的表達(dá)[7]。
本研究通過提純單核細(xì)胞核HDAC并測定其活性,提示外周血單核細(xì)胞中的HDAC活性與吸煙量呈負(fù)相關(guān)。因此,COPD患者外周血單核細(xì)胞HDAC活性降低可能系吸煙所致。
本研究顯示,COPD患者外周血單核細(xì)胞中的HDAC活性降低與COPD氣流受限(肺功能)零相關(guān)。
肺功能是目前COPD分級的主要依據(jù),主要反映氣道的阻塞程度,并不能反映COPD的炎癥程度。Ito等[1]發(fā)現(xiàn)HDAC活性在COPD患者的支氣管組織和肺泡巨噬細(xì)胞中降低,這種降低與COPD氣流受限(FEV1、FEV1/FVC)呈正相關(guān)。而本研究并未發(fā)現(xiàn)外周血單核細(xì)胞中的HDAC活性降低與COPD氣流受限(肺功能)相關(guān),其原因可能與吸煙對肺部和全身的損害不同有關(guān)。
吸煙的煙霧中含有眾多物質(zhì),可以引起直接和間接肺損害。有害成分可以直接影響HDAC的活性或破壞肺組織,引起肺組織的急性損害。只有部分物質(zhì)可以進(jìn)入血液(如氧自由基等)并長期在血液中停留。這些物質(zhì)可以作用于單核細(xì)胞,通過抑制HDAC活性來促進(jìn)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。即使停止吸煙,炎癥基因的表達(dá)維持了這種慢性炎癥。炎癥基因的表達(dá)受促炎癥轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié),這些轉(zhuǎn)錄因子主導(dǎo)、放大并且維持了COPD的慢性炎癥反應(yīng)。肺部的局部急性炎癥與肺功能(氣流受限)呈正相關(guān)。而本研究顯示,在穩(wěn)定期COPD患者的外周血單核細(xì)胞中,HDAC活性與COPD肺功能(氣流受限)無關(guān),提示吸煙對肺部的直接損害與全身的間接損害可能源于不同的機(jī)制。
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【關(guān)鍵詞】 結(jié)核分枝桿菌; 抗原提呈; T細(xì)胞亞群; 流式細(xì)胞術(shù); 激光共聚焦顯微鏡
[Abstract] AIM: To explore whether the human peripheral γδ T cells stimulated by polypeptide heat resistant antigen from Mycobacterium tuberculosis (MtbHAg) express phenotype and have the fuction of antigen presentation. METHODS: The monocytes isolated by adhesion method from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were cultured with GMCSF, IL4 and induced into the mature dendritic cells by adding LPS. PBMCs were stimulated with MtbHAg and IL2 to expand predominantally γδ T cells that were further purified by flow sorting. The pure T cells were isolated from PBMCs using adhesion revomal and nylon column method, labeled with CFSE, and cultured in alone with Mtb secretory antigen (MtbSAg), in monocytes with MtbSAg, or with MtbSAg prepulsed dendritic cells or MtbHAg activated γδ T cells for 11 days. The proliferation of the CD4+T cells were measured by flowcytometry. The MtbHAg activated γδ T cells were incubated with FITC labelled MtbSAg for different time, and the ingestion of MtbSAg by γδ T cells was measured by flowcytometry and observed with laser confocal microscopye. RESULTS: The expressions of MHCII and costimulatory molecules CD80 and CD86 on γδ T cells that activated by MtbHAg marketly incrased in comparison with that on the resting γδ T cells. The expanded cell counts and proliferation index of the pure nave T cells that induced by MtbSAg pretreated activated γδ T cells were similar to that induced by mature DC. By using flowcytometer and laser confocal microscope, FITC labellaed MtbSAg was ingested by the activated γδ T cells. CONCLUSION: γδ T cells stimulated by polypeptide MtbHAg express the phenotype of professional antigenpresenting cells and they are able to present MtbSAg to nave T cells to induce the proliferation of CD4+T cells.
[Keywords]Mycobacterium tuberculosis; antigen presentation; T lymphocyte subpopulation; flow cytometry; laser confocal microscope
以往的研究表明機(jī)體在抗結(jié)核桿菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)感染免疫中, 主要有αβ T細(xì)胞(CD4+和CD8+T細(xì)胞)和巨噬細(xì)胞發(fā)揮重要作用, 而近年的許多研究證明, γδ T細(xì)胞在抗Mtb感染中也起到重要的防御作用, 并可能通過與其他免疫細(xì)胞之間相互作用, 影響機(jī)體在抗Mtb感染中的免疫應(yīng)答過程。在健康人外周血中, γδ T細(xì)胞僅占T細(xì)胞庫的2%~10%, 根據(jù)其TCRδ鏈V區(qū)片段不同又可以分為Vδ1+和Vδ2+二種亞型, Vδ1+T細(xì)胞主要分布在黏膜上皮和皮膚組織, 而Vδ2+T細(xì)胞則主要分布在外周血中。已有研究發(fā)現(xiàn)Vδ2+T細(xì)胞能識別小分子的非肽類抗原, 并在此類抗原的刺激下產(chǎn)生顯著的擴(kuò)增[1, 2]。有研究發(fā)現(xiàn), 從扁桃體分離的未活化的γδ T細(xì)胞用異戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate, IPP) 和來自大腸埃希菌的非肽類抗原4羥基3甲基2烯基焦磷酸[(E)4hydroxy3methylbut2enyl pyrophosphate, HMBPP]刺激后, 表達(dá)協(xié)同刺激分子和MHCⅡ類分子的能力與單核細(xì)胞來源的, 脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激誘導(dǎo)成熟的樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)相似[3]。但以往的研究, 以及我們以前的實驗發(fā)現(xiàn)來自結(jié)核桿菌的多肽類耐熱抗原也可優(yōu)勢擴(kuò)增人Vδ2+T細(xì)胞[4, 5]。本實驗中, 我們用多肽類Mtb耐熱抗原(Heat resistant antigen, MtbHAg)優(yōu)勢擴(kuò)增人外周血中的γδ T(Vδ2+)細(xì)胞, 觀察活化后的γδ T細(xì)胞是否能表現(xiàn)出抗原提呈細(xì)胞的表型以及是否具有抗原提呈的功能, 探討γδ T細(xì)胞在抗Mtb感染的天然免疫和獲得性免疫中的橋聯(lián)作用。
1 材料和方法
1.1 材料 Mtb耐熱抗原(MtbHAg)和Mtb分泌性抗原(MtbSAg)由本實驗室從培養(yǎng)的MtbH37Ra株制備獲得, 羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰胺酯(Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, CFSE) 購自Molecular Probes公司; RPMI1640培養(yǎng)液(GIBCO公司) 補(bǔ)充L谷氨酰胺2 mmol/L、 二巰基乙醇(2ME)50 μmol/L、 丙酮酸鈉1 mmol/L、 慶大霉素50 mg/L和新生小牛血清(NBS, 杭州四季青公司) 100 mL/L后為完全RPMI1640培養(yǎng)液; 異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC) 和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO) 購自Merk 公司; 熒光抗體小鼠抗人CD4PE、 小鼠抗人TCRγδPE、 小鼠抗人CD14FITC、 小鼠抗人HLADRPecy 5.5和小鼠抗人CD83FITC等購自Caltag公司; 小鼠抗人CD80FITC和CD86FITC購自eBioscience公司。
1.2 方法
1.2.1 γδ T細(xì)胞的活化和分選純化 抽取健康志愿者外周血5~10 mL, 肝素抗凝, 用淋巴細(xì)胞分離液和梯度離心法常規(guī)分離獲取外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood monouclear cells, PBMC), 將PBMC用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L, 加入24孔板, 再加入Mtb耐熱抗原(MtbHAg) 2.5 mg/L, 置于37℃、 50 mL/L CO2中培養(yǎng)5 d后分孔培養(yǎng), 每隔3 d加入rhIL2 5×104 U/L, 約9 d即可得到富含γδ T細(xì)胞的活化T細(xì)胞, 經(jīng)抗TCRPE染色后, 用PBS制備分選用細(xì)胞懸液(1×1010/L), 在流式細(xì)胞儀FACSCalibur上進(jìn)行分選獲取純化的γδ T細(xì)胞。
1.2.2 DC的體外培養(yǎng)及檢測 常規(guī)方法分離獲取PBMC, 加入24孔板中, 細(xì)胞密度為每孔5×109/L, 37℃、 50 mL/L
CO2培養(yǎng)2 h后吸去懸浮細(xì)胞, 并用預(yù)熱的RPMI1640輕洗培養(yǎng)孔, 以去除殘留懸浮細(xì)胞, 即獲得貼壁細(xì)胞。補(bǔ)充培養(yǎng)液后加入rhGMCSF 100 μg/L, IL4 100 μg/L, 第3天時半量換液, 并再次添加GMCSF和IL4, 第6 天半量換液的同時再加入LPS 1 mg/L, 第8天收獲懸浮細(xì)胞, 分別用小鼠抗人CD83FITC, CD14FITC和HLADRPeCy5.5標(biāo)記后在流式細(xì)胞儀檢測外周血單核細(xì)胞來源DC的成熟程度。
1.2.3 尼龍毛柱法分離純化T淋巴細(xì)胞 常規(guī)方法分離獲取PBMC, 調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L, 加入6孔板中, 2 mL/孔, 置于37℃、 50 mL/L CO2中培養(yǎng)2 h后, 吸出懸浮細(xì)胞, 調(diào)整細(xì)胞密度為1×1010/L, 注入已制備好的尼龍毛柱內(nèi), 另加入5 mL的完全RPMI1640液, 密封, 37℃、 50 mL/L CO2中孵育1 h后, 用RPMI1640完全培養(yǎng)液沖洗毛柱, 收集沖洗出來的細(xì)胞, 即為純化T細(xì)胞(purified T, pu T)。
1.2.4 CFSE標(biāo)記pu T 將獲得的pu T調(diào)整細(xì)胞密度為5×109/L, 每毫升細(xì)胞懸液加入1 μL CFSE, 使其終濃度為2 μmol/L, 37℃染色10 min后取出用含100 mL/L NBS的完全RPMI1640培養(yǎng)液洗2次后將染色后pu T制成細(xì)胞懸液(1×109/L)。此即為CFSE標(biāo)記的pu T (pu TCFSE)。
1.2.5 FITC標(biāo)記MtbSAg 將MtbSAg(1 g/L) 1 mL加入已處理過的透析袋中, 扎緊袋口放入pH9.5碳酸鹽緩沖液透析過夜, 透析后取出, 加DMSO配制FITC溶液(1 g FITC/L)混合, 使FITC/MtbSAg的比例為50 μg∶1 mg。室溫避光在水平振蕩器上慢速振搖2 h后轉(zhuǎn)入透析袋中, 對200 mL PBS透析8 h后換液, 共3次。4℃避光保存。
1.2.6 四種不同的培養(yǎng)方法刺激αβ T細(xì)胞擴(kuò)增 CFSE標(biāo)記的pu T, 調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L, 加入24孔板培養(yǎng), 每孔1 mL, 并按以下四種不同方法加入MtbSAg或抗原提呈細(xì)胞。a: CFSE標(biāo)記的pu T單獨培養(yǎng), 同時加入MtbSAg 25 mg/L。b: CFSE標(biāo)記的pu T中加入單核細(xì)胞 (單核細(xì)胞: pu TCFSE為1∶100), 加MtbSAg 25 mg/L。c: 體外培養(yǎng)的單核細(xì)胞來源的成熟DC(MDC)與終濃度25 mg/L 的MtbSAg孵育, 37℃ 2 h后, RPMI1640洗滌3次, 加入pu TCFSE (DC∶Pu TCFSE為1∶100) 中培養(yǎng)。d: 流式分選純化的MtbHAg活化γδT細(xì)胞與終濃度為25 mg/L的MtbSAg孵育, 37℃ 2 h后, RPMI1640洗滌3次, 加入到pu TCFSE(活化的γδT細(xì)胞: pu TCFSE為1∶100)中培養(yǎng)。上述4種細(xì)胞培養(yǎng)在第4天時加IL2 (5萬U/L)擴(kuò)增細(xì)胞, 隔天半量換液并添加同量的IL2以維持細(xì)胞生長。
1.2.7 FCM和激光共聚焦檢測活化γδ T細(xì)胞對FITC標(biāo)記MtbSAg的攝入 將MtbHAg活化的γδ T細(xì)胞的密度調(diào)整為1×1010/L, 取100 μL細(xì)胞懸液, 加FITC標(biāo)記的MtbSAg 10 μL, 抗TCRγδPE 3 μL, 避光 37℃, 水浴30 min 至120 min后, PBS洗滌3次, 盡量去除殘余液體, 加入10 g/L多聚甲醛200 μL 固定后用流式細(xì)胞儀檢測FITC陽性細(xì)胞數(shù), 表示攝入MtbSAg細(xì)胞的比率。同時將水浴90 min的試管輕彈混勻后取出2 μL, 加少量甘油混合后滴在載玻片上, 加上蓋玻片后即在激光共聚顯微鏡(Nikon C1 Si)下觀察和拍攝記錄, 獲取的圖象文件用Freeviewer軟件分析顯示。
1.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)以x±s表示, 數(shù)據(jù)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。樣本均數(shù)的兩兩比較, 采用t檢驗, P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 外周血單核細(xì)胞來源DC的表型檢測 PBMC來源的單核細(xì)胞經(jīng)GMCSF, IL4培養(yǎng)6 d后加入LPS誘導(dǎo)為成熟的DC后, 用FCM檢測其表型, 發(fā)現(xiàn)HLADR仍為高表達(dá)(81.89%), 代表DC成熟的CD83與培養(yǎng)前低表達(dá)(7.83%)相比非常顯著地高表達(dá)(85.40%), 而單核細(xì)胞的特征標(biāo)志CD14從培養(yǎng)前的87.2%降低到5.31%。
2.2 活化的γδT細(xì)胞表達(dá)協(xié)同刺激分子 檢測健康人外周血中靜止的γδ T細(xì)胞表面CD80、 CD86和HLADR的表達(dá)水平非常低, 分別為(1.37±2.36)%, (4.13±3.33)%和(8.84±5.44)%; 而經(jīng)MtbHAg活化后γδ T細(xì)胞CD80、 CD86和HLADR的表達(dá)分別增加到(62.33±7)%、 (89.12±3.5)%、 (80.56±7.29)% (圖1)。
2.3 不同培養(yǎng)方法對純化初始T細(xì)胞增殖總數(shù)的影響 在4種不同培養(yǎng)方案中, 加入的純化T細(xì)胞數(shù)均為1.0×106, 單獨加MtbSAg的a組, 和加單核細(xì)胞和MtbSAg的b組, 培養(yǎng)到第11天時, 細(xì)胞數(shù)分別為1.2×106和5.6×106。而純化T細(xì)胞加入預(yù)先與MtbSAg處理的DC(c組)和γδ T細(xì)胞(d組), 培養(yǎng)11 d后的細(xì)胞數(shù)分別為7.79×106和8×106(圖2)。
2.4 FCM分析CD4+T細(xì)胞的增殖情況和Modfit軟件分析CD4+T細(xì)胞的增殖指數(shù) 用CFSE標(biāo)記的純化T細(xì)胞用4種方法培養(yǎng)到第11天時, 標(biāo)記CD4熒光mAb后用流式細(xì)胞儀測定和分析, 結(jié)果表明純化T細(xì)胞單獨加MtbSAg的a組, 增殖的CD4+T細(xì)胞僅占4.5%; 加單核細(xì)胞和MtbSAg的b組, 增殖的CD4+T細(xì)胞所占比例為35.4%, 而加入MtbSAg預(yù)處理的成熟DC和活化γδT細(xì)胞的c組和d組, 增殖的CD4+T細(xì)胞所占比例分別達(dá)到56.4%和57.1%(圖3A)。用Modfit軟件中的增殖分析模塊進(jìn)行分析, 得到CD4+T細(xì)胞各代細(xì)胞所占百分率, 增殖指數(shù)(Proliferation Index, PI, 即增殖后細(xì)胞總數(shù)與增殖前細(xì)胞總數(shù)的比值。在加入MtbSAg預(yù)處理的DC(c組)和活化γδT細(xì)胞(d組), 培養(yǎng)第11天時CD4+T細(xì)胞的PI分別為58.9和51.9, 且增殖的代數(shù)主要集中在第9、 10代, 分別為75.93%和75.71%。加入單核細(xì)胞的b組CD4+T細(xì)胞的PI為24.39, 第9、 10代所占的比例為57.65%, 而僅有純化T細(xì)胞的a組中, CD4+T細(xì)胞的PI和第9、 10代所占的比例僅為4.5%和4.04%(圖3B)。
2.5 激光共聚焦顯微鏡觀察活化的γδ T細(xì)胞攝入SAg MtbHAg刺激活化的γδ T細(xì)胞與FITC標(biāo)記的MtbSAg在37℃孵育90 min 時, 同時加入抗TCRγδ PE熒光抗體, 在激光共聚焦顯微鏡下觀察, 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜被染成紅色的γδ T細(xì)胞內(nèi)分布有大量呈綠色熒光(FITC)細(xì)小散點物質(zhì)(圖4)。
2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測活化的γδ T細(xì)胞攝入MtbSAg MtbHAg激活的γδ T細(xì)胞與FITCMtbSAg在37℃孵育時, 加入抗TCRγδ PE熒光抗體, 用流式檢測發(fā)現(xiàn), MtbSAg攝入率即γδ T細(xì)胞中FITC+細(xì)胞百分?jǐn)?shù)隨時間延長不斷增加。在孵育30、 60和90 min時, 攝入率分別為(26.68±3.58)%、 (48.09±3.29)%和(53.32±3.29)%; 但是在120 min時降低至(31.28±5.80)% (圖5)。
3 討論
為了探討多肽類抗原激活的人γδ T細(xì)胞是否也具有抗原提呈作用, 首先考慮是否有涉及抗原提呈細(xì)胞有關(guān)的表型分子的表達(dá)。本實驗采用多肽類的MtbHAg作為優(yōu)勢激活γδ T細(xì)胞的抗原, 其中具有激活γδ T細(xì)胞效應(yīng)的主要組分是Mr在10 000~14 000的非分泌性耐熱多肽[4, 5]。用這種多肽抗原激活的γδ T細(xì)胞在培養(yǎng)增殖到第11天時, 其表面HLADR和協(xié)同刺激分子(CD80和CD86)從培養(yǎng)前的低表達(dá)(1%~8%)顯著上調(diào)為高表達(dá)(62%~89%), 表明這些細(xì)胞已具有抗原提呈細(xì)胞的表型。
Brandes等[3]發(fā)現(xiàn)IPP活化γδ T細(xì)胞攝入可溶性抗原后與初始αβ T細(xì)胞共同培養(yǎng)促使細(xì)胞增殖。本實驗中純化T細(xì)胞(幾乎均是αβ T細(xì)胞)與MtbSAg摻入的DC培養(yǎng)11 d后數(shù)量增加7倍, 而與MtbSAg摻入的活化γδ T細(xì)胞共同培養(yǎng)后, αβ T細(xì)胞的數(shù)量增加8倍。我們進(jìn)一步用CFSE標(biāo)記初始純T淋巴細(xì)胞后, 再與MtbSAg摻入的DC或γδ T細(xì)胞培養(yǎng), 流式細(xì)胞術(shù)檢測后用Modfit軟件進(jìn)行分析CD4+T細(xì)胞各代細(xì)胞所占百分率, 發(fā)現(xiàn)由活化γδ T細(xì)胞和成熟DC作為抗原提呈細(xì)胞的二組, 培養(yǎng)到晚期時增殖的細(xì)胞絕大多數(shù)均是集中在第9、 10代。說明引起CD4+T細(xì)胞增殖的能力幾乎相同。這些結(jié)果表明, 用MtbHAg活化的γδ T細(xì)胞和成熟DC一樣, 具有提呈可溶性抗原給初始T細(xì)胞, 引起CD4+T增殖的能力。這與 Brandes報道的用非肽類抗原刺激的γδ T細(xì)胞提呈可溶性抗原的結(jié)果相一致。
為了證實MtbHAg活化的γδ T細(xì)胞能攝入蛋白抗原, 本實驗將活化的γδ T細(xì)胞與FITC標(biāo)記的MtbSAg在37℃的條件下孵育, 流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示γδ T細(xì)胞攝入SAg的能力隨著時間的增加而增加(30 min 至 90 min)。同時, 在激光共聚焦顯微鏡下也觀察到γδ T細(xì)胞能將抗原攝入胞內(nèi)。
綜上所述, 經(jīng)MtbHAg活化γδ T細(xì)胞具有抗原提呈作用, 其功能活性似乎與成熟DC沒有明顯差別, 但γδ T細(xì)胞更容易獲取和體外操作。因此, 這種活化的γδ T細(xì)胞可在制備疫苗和免疫治療中成為新的目標(biāo)[6]。
參考文獻(xiàn)
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[2] Chen ZW, Letvin NL. Adaptive immune response of Vγ9Vδ2T cells: a new paradigm[J]. Trends Immunol, 2003, 24(4): 213-219.
[3] Brandes M, Willimann K, Moser B. Professional antigenpresentation function by human γδ T cells[J]. Science, 2005, 309(5732): 264-268.
【摘要】
目的: 本研究旨在探索紫杉醇、 順鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡后能否具有較強(qiáng)的免疫原性, 并可以被抗原提呈細(xì)胞交叉提呈并促進(jìn)免疫應(yīng)答。方法: 用巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)和白介素4(IL4)刺激人外周血單核細(xì)胞分化誘導(dǎo)為樹突狀細(xì)胞(DC), 6 d后將DC和經(jīng)紫杉醇聯(lián)合順鉑在體外誘導(dǎo)發(fā)生凋亡的人卵巢癌細(xì)胞株共同培養(yǎng), 并以凍融細(xì)胞共培養(yǎng)DC組和單獨DC組作對照, 共培養(yǎng)4 h后, 進(jìn)行激光掃描共聚焦顯微鏡觀察DC細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的吞噬作用, 同時以流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測不同培養(yǎng)組DC的分化和成熟程度。結(jié)果: 紫杉醇、 順鉑誘導(dǎo)的凋亡卵巢癌細(xì)胞可被DC有效吞噬, 與對照組相比, 凋亡組DCs的表達(dá)及成熟度均明顯增高, 并具有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.05)。結(jié)論: 紫杉醇、 順鉑誘導(dǎo)的凋亡卵巢癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的免疫原性, 可以促進(jìn)DC的分化和成熟。
【關(guān)鍵詞】 紫杉醇; 順鉑; 樹突狀細(xì)胞; 細(xì)胞凋亡; 抗原提呈
[Abstract] AIM: To explore wheather apoptotic ovarian cancer cells induced by paclitaxelcisplatin could be crosspresented by antigen presenting cells and promote immune responses. METHODS: DCs were generated from peripheral blood monocytes in RPMI1640 supplemented with GMCSF and IL4. After 6 days’ incubation, DCs were further cocultured with either apoptotic HO8910 cell lines induced by paclitaxelcisplatin or control cells for four hours. Maturation of DCs was compared among different groups according to their surface markers through flow cytometry assay and their phagocytosis ability was evaluated by confocal microscopy scanning assay. RESULTS: Apoptotic ovarian cancer cells induced by paclitaxelcisplatincan were phagocytized more efficiently by DCs.Resulting is more cellularity and maturation of DCs in apoptotic cellinduced groups than control group(P
[Keywords]paclitaxel; cisplatin; dendritic cells; apoptotic cells; antigen presentation
化療藥物通過誘導(dǎo)凋亡來殺死腫瘤細(xì)胞, 而凋亡的腫瘤細(xì)胞是否具有免疫原性一直是倍受爭議的話題, 近來研究表明化療藥物誘導(dǎo)的凋亡腫瘤細(xì)胞能否有效激發(fā)免疫應(yīng)答, 與腫瘤細(xì)胞的性質(zhì)和化療藥物有關(guān)[1]。本研究旨在探索紫杉醇聯(lián)合順鉑化療藥物誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡后的免疫原性, 探討誘導(dǎo)凋亡的腫瘤細(xì)胞能否被樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)交叉提呈, 從而促進(jìn)免疫應(yīng)答, 為臨床制定合理的化療聯(lián)合免疫療法治療腫瘤提供理論依據(jù)。
1 材料和方法
1.1 材料 紫杉醇、 順鉑購自山東齊魯制藥廠; 淋巴細(xì)胞分離液購自上?;瘜W(xué)試劑廠; 巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor, GMCSF)、 白介素4(interleukin4, IL4)、 腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα, TNFα)均購自R&D公司; CFSE(carboxyfluorescein succinimidylester)活細(xì)胞探針購自Invitrogen公司; 小鼠抗人抗體CD14、 CD80、 CD83、 CD86、 CD1a單克隆抗體(mAb)購自ebioscience公司; AnnexionⅤPI核酸染料購自深圳晶美公司; RPMI1640培養(yǎng)液、 2.5 g/L胰酶、 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自Gibco公司; 人卵巢癌HO8910細(xì)胞株為上海市免疫學(xué)研究所饋贈; 人濃縮白細(xì)胞由自愿者提供。
1.2 方法
1.2.1 人外周血細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化和培養(yǎng)DC 取60 mL濃縮WBC, PBS稀釋至200 mL, 采用淋巴細(xì)胞分離液經(jīng)密度梯度離心分離獲取外周血單個核細(xì)胞, PBS洗滌細(xì)胞2次, 細(xì)胞計數(shù), 在6孔板中以無血清RPMI1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞至密度為5×109/L, 置37℃、 50 mL/L CO2培養(yǎng)箱2 h后取出, 洗去懸浮細(xì)胞(收集備用), 加入含GMCSF(100 μg/L)、 IL4(50 μg/L)和100 mL/L FBS的RPMI1640培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞, 第3天半量換液, 第6天收集懸浮細(xì)胞, 計數(shù)。
1.2.2 HO8910凋亡細(xì)胞的制備 將HO8910細(xì)胞按紫杉醇和順鉑不同的作用劑量和不同時間分組處理, 紫杉醇順鉑濃度分別為2.5~0.3 mg/L、 25~3 mg/L、 125~15 mg/L、 250~30 mg/L, 分別作用12 h、 24 h和36 h后, 用2.5 g/L胰酶消化貼壁細(xì)胞, 將細(xì)胞用PBS重懸至1×109/L, 取100 μL, 以藥物未處理組為空白對照, 參照Annexin VPI試劑盒說明書檢測各組細(xì)胞的凋亡率。
1.2.3 HO8910凍融抗原制備 收獲HO8910細(xì)胞, 用PBS重懸至2×1010/L, 置液氮內(nèi)10 min, 取出后速投入37℃水浴溶解, 反復(fù)5次。以3 000 r/min離心10 min, 收集上清, -80℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.4 DC與凋亡細(xì)胞激光共聚焦掃描 消化對數(shù)增長期HO8910細(xì)胞株, 以PBS 重懸細(xì)胞至1×109/L, 加入CFSE終濃度為25 μmol/L, 50 mL/L CO2、 37℃培養(yǎng)箱共孵育30 min, RPMI1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1次后, 用含100 mL/L胎牛血清(FBS)的RPMI1640液重懸細(xì)胞, 并鋪板培養(yǎng)。次日加入紫杉醇和順鉑(濃度為250~30 mg/L), 培養(yǎng)24 h(此條件為1.2.2步驟實驗得出誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的最佳濃度和時間)后取出, 收集懸浮細(xì)胞, 計數(shù)。凋亡細(xì)胞與培養(yǎng)6 d后的DC以1∶1比例共孵育, 以未處理細(xì)胞為對照, 按相同比例和DC共培養(yǎng), 4 h后取出, 用PBS洗滌細(xì)胞, 加入小鼠抗人PECD83抗體, 共孵育30 min后, 用PBS洗滌細(xì)胞, 并用40 g/L多聚甲醛固定懸浮細(xì)胞, 置于細(xì)胞甩片機(jī)中1 000 r/min離心3 min, 將細(xì)胞固定于載玻片上, 500 mL/L甘油PBS封片, 激光共聚焦顯微鏡檢測。
1.2.5 不同類型腫瘤抗原負(fù)載DC表面標(biāo)志的檢測 DC培養(yǎng)至6 d, PBS沖洗收獲所有的DC, 分為3組進(jìn)行實驗: 空白組, 單純DC組; 凍融組: HO8910凍融抗原負(fù)載DC組; 凋亡組: 紫杉醇順鉑誘導(dǎo)HO8910凋亡細(xì)胞負(fù)載DC組。共培養(yǎng)4 h后洗滌細(xì)胞, 用100 mL/L FBS1640懸浮細(xì)胞, 并加入TNFα至100 μg/L, 培養(yǎng)24 h后流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測DC細(xì)胞表面CD1a、 CD14、 CD80、 CD83、 CD86的表達(dá)。
1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 計量資料以x±s表示, 采用SPSS11.5數(shù)據(jù)包方差分析, P
2 結(jié)果
2.1 紫杉醇順鉑誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞株HO8910凋亡最佳時間與劑量的選擇 為確定紫杉醇和順鉑聯(lián)合誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞株HO8910的最佳作用劑量和最適作用時間, 我們選取了4個作用濃度和3個作用時間點(見前)處理HO8910細(xì)胞, 結(jié)果顯示紫杉醇順鉑作用濃度為125~15 mg/L, 作用時間12 h后細(xì)胞凋亡開始明顯增加, 以250~30 mg/L濃度作用24 h細(xì)胞基本完全凋亡。顯微鏡下可見作用24 h后, 細(xì)胞呈懸浮狀, 部分細(xì)胞胞膜不完整。作用36 h后FCM檢測結(jié)果顯示細(xì)胞大多呈壞死狀態(tài), 顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞呈碎片。上述結(jié)果表明, 紫杉醇和順鉑聯(lián)合誘導(dǎo)HO8910細(xì)胞凋亡時, 濃度250~30 mg/L, 作用24 h為凋亡最適劑量、 最佳時間點效應(yīng)(圖1)。
圖1 紫杉醇/順鉑作用不同濃度與不同時間細(xì)胞的凋亡比例(略)
Fig 1 The percentage of apoptotic cells induced by Paclitaxel/Cisplatin at different concentrations and time points
a: 125 paclitaxel+15 mg/L cisplatin for 12 h; b: 250 paclitaxel+ 30 mg/L cisplatin for 24 h; c: 250 paclitaxel+30 mg/L cisplatin for 36 h.
2.2 外周血單核細(xì)胞來源的DC的體外誘導(dǎo) 經(jīng)常規(guī)貼壁法獲得外周血單核細(xì)胞后, 采用通用的GMCSF和IL4條件培養(yǎng)基體外誘導(dǎo)分化DC, 培養(yǎng)3 d后, 在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察可見細(xì)胞開始呈集簇生長, 部分細(xì)胞的細(xì)胞膜有突起, 培養(yǎng)至第6天, 可見大部分細(xì)胞懸浮生長, 胞體大且外形不規(guī)則, 細(xì)胞膜呈樹突狀突起, 胞質(zhì)豐富, 并具有典型DC形態(tài)(圖2), 表明細(xì)胞已向DC分化, 可用于進(jìn)一步表型分析和功能檢測。
圖2 倒置顯微鏡下DC的形態(tài)特征(略)
Fig 2 The morphology of induced DC observed with inverted microscope(×400)
2.3 誘導(dǎo)DC細(xì)胞的表型檢測 外周血來源的單核細(xì)胞經(jīng)GMCSF和IL4誘導(dǎo)培養(yǎng)6 d后, 獲得未成熟的DC細(xì)胞, 采用單獨TNFα作用、 TNFα﹢凍融細(xì)胞和TNFα﹢凋亡細(xì)胞培養(yǎng)24 h后, FCM檢測DC表面標(biāo)志的表達(dá)。結(jié)果顯示條件培養(yǎng)第6天較培養(yǎng)前CD14的表達(dá)明顯下降, CD1a、 CD80、 CD86的表達(dá)上調(diào), CD83的表達(dá)為10%左右(圖3)。培養(yǎng)7 d后單獨TNFα作用和TNFα+凍融細(xì)胞作用后CD83表達(dá)約35%左右, 兩者間無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 但其在TNFα﹢凋亡細(xì)胞作用后表達(dá)上升為50%, 且與前兩者間有統(tǒng)計學(xué)意義(P
圖3 誘導(dǎo)前、 GMCSF/IL4、 GMCSF/IL4/TNFα誘導(dǎo)后細(xì)胞表面標(biāo)志變化(略)
Fig 3 Alteration of surface markers on preinduced monocytes, GMCSF/IL4 induced and GMCSF/IL4/TNFα induced DC cells
表1 不同腫瘤抗原刺激后DC表面標(biāo)志的表達(dá)(略)
Tab 1 Comparative analysis of surface markers on DC pulsed with different types of tumor antigens
aP
2.4 凋亡細(xì)胞可以被DC細(xì)胞有效的吞噬 比較DC與凋亡的HO8910細(xì)胞和未處理HO8910細(xì)胞共培養(yǎng)后, DC對兩類細(xì)胞的吞噬情況, 結(jié)果顯示(圖4)僅在凋亡組中可見DC膜與凋亡細(xì)胞融合、 DC細(xì)胞胞體內(nèi)有凋亡小體、 小顆粒狀溶解碎片等一系列DC吞噬凋亡細(xì)胞的現(xiàn)象, 而DC對正常的HO8910無吞噬作用。進(jìn)一步通過FCM檢測DC吞噬凋亡細(xì)胞在時相上是否存在差異, 結(jié)果表明隨共培養(yǎng)時間延長, DC的吞噬未見增加, 4 h與24 h之間無統(tǒng)計學(xué)意義。
圖4 DC對凋亡腫瘤細(xì)胞、 未處理的腫瘤細(xì)胞吞噬的激光共聚焦掃描(略)
Fig 4 Phagocytosis of dendritic cells against apoptotic and normal HO8910 cell lines
A: Apoptosis HO8910 cell lines; B: HO8910 cell lines.
3 討論
卵巢癌死亡率極高, 減少卵巢癌復(fù)發(fā)、 提高預(yù)后的一個重要策略是在手術(shù)和化療后再應(yīng)用如免疫治療、 分子靶向治療和基因治療等鞏固療法[2]。近年來研究表明化療藥物誘導(dǎo)的凋亡腫瘤細(xì)胞能夠有效激發(fā)免疫應(yīng)答[3]。如果能將卵巢癌免疫治療與傳統(tǒng)治療方法合理聯(lián)合將為卵巢癌的治療開辟新的途徑、 帶來新的曙光。研究證明腫瘤免疫逃逸的機(jī)制不僅由于缺乏抗原, 而且與抗原不能被有效提呈給T細(xì)胞而不能產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答有關(guān)[4]。因此腫瘤免疫治療的一個巨大挑戰(zhàn)是如何使抗原被有效提呈而激發(fā)有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答。如果化療誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞具有免疫原性、 能被APCs提呈則是化療聯(lián)合免疫治療的基礎(chǔ)。
Nowak等[5]學(xué)者發(fā)現(xiàn)二氟脫氧胞嘧啶核苷介導(dǎo)的凋亡細(xì)胞不是耐受原, 凋亡細(xì)胞能誘導(dǎo)DC成熟并激活相關(guān)的T細(xì)胞。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)化療誘導(dǎo)的凋亡腫瘤細(xì)胞數(shù)目增加, 使得APCs吞噬作用加強(qiáng), APCs被激活后釋放更多的前炎性細(xì)胞因子, 從而促進(jìn)APCs對腫瘤抗原的交叉提呈[6]。而Casares等[7]發(fā)現(xiàn)絲裂霉素C致凋亡的腫瘤細(xì)胞不具有免疫原性。上述研究結(jié)果提示, 不同腫瘤細(xì)胞經(jīng)不同化療藥物作用后, 其免疫原性仍然存在不確定性。紫杉醇和鉑類是目前國內(nèi)外公認(rèn)的卵巢癌一線化療藥物, 本實驗中應(yīng)用紫杉醇聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞株凋亡后, 論證凋亡細(xì)胞對DC的影響。應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)與凋亡細(xì)胞共培養(yǎng)的DC胞內(nèi)見吞噬凋亡小體, 且DC胞體中出現(xiàn)小顆粒狀溶解碎片, 而DC對正常HO8910無吞噬作用。同時FCM檢測發(fā)現(xiàn)與凋亡細(xì)胞共培養(yǎng)的DC, 其共刺激分子表達(dá)較空白組和凍融組顯著升高, 因此相同數(shù)量凋亡腫瘤細(xì)胞的免疫原性強(qiáng)于凍融腫瘤抗原, 表明DC通過吞噬負(fù)載凋亡細(xì)胞后其成熟度的表達(dá)明顯增加, 行使抗原提呈的功能顯著增強(qiáng)。本實驗結(jié)果證明紫杉醇+順鉑誘導(dǎo)的凋亡卵巢癌細(xì)胞并不隔離抗原, 相反使交叉提呈的腫瘤抗原性顯著增加, 促進(jìn)了DC的成熟與提呈作用。
此外, 本研究中還有一個發(fā)現(xiàn), 即凍融組在加凍融抗原前后, DC的共刺激分子表達(dá)無明顯改變, DC未被凍融抗原活化。我們認(rèn)為部分原因有可能是由于加入凍融抗原的效價過低, 但更可能是來源于HO8910的凍融腫瘤抗原本身不具有誘導(dǎo)異體DC活化的抗原表位, 但凋亡組加凋亡細(xì)胞后, DC的共刺激分子表達(dá)改變明顯。本研究認(rèn)為應(yīng)用凋亡的細(xì)胞作為抗原可能不需要識別腫瘤特異性肽段和受MHC限制, 化療誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞有望成為免疫治療的自身抗原, 這些對于DC疫苗的制備及化療聯(lián)合免疫治療提供了重要的信息。
腫瘤的免疫治療規(guī)范化是一個尚未解決的問題, 如何將免疫治療與傳統(tǒng)的化療結(jié)合起來更是一個空白的領(lǐng)域。越來越多的研究認(rèn)為化療誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞促進(jìn)免疫應(yīng)答反應(yīng)。因此如何將免疫治療與化療合理結(jié)合將是今后致力研究的課題, 本課題為此研究提供了重要理論依據(jù)。
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關(guān)鍵詞:PET 連續(xù)聚合工藝 節(jié)能環(huán)保
在連續(xù) PET 裝置中,為了使酯化反應(yīng)和縮聚反應(yīng)向正反應(yīng)方向進(jìn)行,正反應(yīng)所生成的水和 EG 需及時排出。從反應(yīng)器頂部排出的這股物料還包括乙醛、二甘醇以及少量低聚物。EG 作為 PET 生產(chǎn)的原料需進(jìn)行回用,故設(shè)置工藝塔進(jìn)行精餾分離。工藝塔是在 PET 生產(chǎn)過程中用來進(jìn)行酯化反應(yīng)的主設(shè)備之一,其作用是將酯化系統(tǒng)中產(chǎn)生的水和 EG蒸氣的混合物以及從粗 EG 低位收集槽送至的粗EG 進(jìn)行分離提純[1]。其所在的系統(tǒng)主要包括以下單元:( 1) 工藝塔本體;( 2) 塔釜回流系統(tǒng);( 3) 塔項冷凝系統(tǒng)。
一、工藝設(shè)計
1.主要工藝設(shè)計參數(shù)
工作介質(zhì): EG,水; 工作壓力: 0.115 MPa; 工作溫度: 215 ℃; 塔徑: 1.3 m; 總高: 約15 m;總體積:約 18 m3;塔釜液位: 約70%。
2.塔結(jié)構(gòu)
優(yōu)化后的工藝塔結(jié)構(gòu)簡示如圖 1 所示。
圖1 工藝塔結(jié)構(gòu)簡圖
在塔的上部設(shè)置導(dǎo)向裝置,該裝置可以控制塔器在運行中的撓度,防止運行中塔的晃動,設(shè)計時考慮塔在溫度變化時的自由伸縮。一般用數(shù)個導(dǎo)向輪沿圓周均布,小型塔可以采用用塔箍結(jié)構(gòu)。導(dǎo)向孔的開口方向與塔盤上的液流方向一致。在操作中,從導(dǎo)向孔噴出的少量氣體推動塔盤上的液體流動,可以減少塔盤上的液體流動,從而可明顯減少塔盤上的液面梯度。液體返混是很小。液體滯止區(qū)小,用于氣液傳質(zhì)過程具有良好的操作性能。
二、PET連續(xù)聚合工藝流程優(yōu)化
五釜和三釜PET工藝流程的主要特點分別是:(1)三釜流程預(yù)縮聚反應(yīng)器中同時存在真空狀態(tài)下的醋化反應(yīng),優(yōu)于五釜流程醋化階段帶壓操作;(2)三釜流程物料通過反應(yīng)器的停留時間比五釜流程略短;(3)三釜流程的反應(yīng)溫度要比五釜流程高;(4)三釜流程的動設(shè)備比五釜流程少;(5)三釜流程一般采用氣相熱媒加熱;(6)三釜流程的催化劑及其它添加劑是從齊聚物管道上注人的,而五釜流程則在漿料調(diào)制時加入[3]。
充分利用原有資源達(dá)到繼續(xù)增產(chǎn)的目標(biāo),關(guān)鍵是降低產(chǎn)品的成本,即提高裝置生產(chǎn)能力、降低能耗。更換或改造反應(yīng)器就成了最主要的選擇。通過該工藝流程的優(yōu)化改造后,可實現(xiàn)單線再增量40 t/d。
五釜流程原生產(chǎn)能力是單線160 t/d,經(jīng)過本次改造后,生產(chǎn)能力達(dá)到了200 t/d,其主要工藝參數(shù)也向三釜流程工藝參數(shù)靠近,如表1所示。
表1 PET四釜流程的主要工藝參數(shù)
改造后整個流程的反應(yīng)時間由5.6h縮短到4.3h,有利于產(chǎn)品質(zhì)量的提高。同時改造后的工藝參數(shù)與三釜流程相比,仍然屬于較為溫和的工藝,以溫度為例:三釜流程的醋化溫度為283-285℃,上流式預(yù)縮聚反應(yīng)器(UFPP)溫度290-292℃;改造后四釜流程的醋化溫度為280-283℃,UFPP溫度為285-287℃。
在真空系統(tǒng)流程中,預(yù)縮釜出來的工藝氣體經(jīng)預(yù)縮一級刮板冷凝器、預(yù)縮二級刮板冷凝器后進(jìn)入四級水蒸氣噴射泵抽真空。終縮釜出來的工藝氣體經(jīng)過終縮一級刮板冷凝器、終縮二級刮板冷凝器后進(jìn)入四級水蒸氣噴射泵抽真空。該裝置的真空系統(tǒng)采用了 1.5 MPa 水蒸氣四級噴射器,每小時消耗 0.856 t 蒸汽和 82 t 循環(huán)水。噴射級數(shù)多,運行成本較高。而且真空系統(tǒng)總是隨著公用工程的波動而變化,影響了 PET 裝置的平穩(wěn)運行。又由于水蒸氣不斷沖刷,真空泵的噴嘴遭到嚴(yán)重磨損,導(dǎo)致真空系統(tǒng)能力不足。且水蒸氣對從聚合反應(yīng)帶出的低聚物溶解性較低,容易堵塞真空系統(tǒng)。在近 10 年的生產(chǎn)過程中,該系統(tǒng)能源消耗較大,產(chǎn)生的噴射泵冷凝液較多( 含少量 EG) ,污水處理的成本較大,不符合目前國家倡導(dǎo)的節(jié)能減排政策。在 PET 裝置真空系統(tǒng)的改造設(shè)計中,采用三級EG 蒸氣噴射泵代替原來的四級水蒸氣噴射泵。為得到較高的真空度,EG 蒸氣噴射泵采用多級串聯(lián)的形式。在多級串聯(lián)噴射系統(tǒng)里,前一級噴射器噴出的氣流中不僅有被抽氣體,而且還有該級的工作蒸氣,使后一級的負(fù)擔(dān)增加,為減少后一級的蒸氣消耗,在 2 級噴射之間安裝有冷凝器,使混合氣體中大部分可凝氣體冷凝下來。冷凝器的冷卻介質(zhì)可與混合氣體間接或直接接觸?;旌蠚怏w主要成分是EG 和不凝氣體,因而冷卻介質(zhì)可用 EG 直接噴淋。其最后一級通過液環(huán)泵后將不凝氣體排入大氣,這樣 EG 真空噴射泵在生產(chǎn)過程中就無廢水產(chǎn)生。液環(huán)泵屬于變?nèi)菔秸婵毡?,靠泵腔容積的變化來實現(xiàn)吸氣、壓縮和排氣的。
三、節(jié)能環(huán)保的流程改造
(1)改造后的酯化工序。經(jīng)過改造,采用了1個UF即代替原流程的R-22和R-1,UFPP同時承擔(dān)R-2的進(jìn)一步醋化反應(yīng)的作用,將醋化率從89%左右提高到了99%以上。(2)添加劑注人。根據(jù)生產(chǎn)品種,在R-1到E-31的移液管線上,物料進(jìn)預(yù)聚釜UFPP前注入縮聚催化劑、穩(wěn)定EG和其它各種添加劑,如DEG、Tio2等。經(jīng)過改造,增加了催化劑溶液、穩(wěn)定EG、消光劑以及液體DEG等添加劑的添加系統(tǒng)。添加時通過流量計計量,由調(diào)節(jié)閥控制加人量,通過相應(yīng)的注射器加人到齊聚物的管線中[4]。(3)預(yù)縮聚。設(shè)計的UFPP由3部分組成,管式反應(yīng)加熱器、反應(yīng)塔和醋化分離器。同時UFPP還配備了EG噴淋冷凝系統(tǒng)、真空系統(tǒng)(三級蒸汽噴射泵)和熱媒系統(tǒng)。改造后,UFPP同時保證了后期醋化反應(yīng)和預(yù)縮聚反應(yīng)的正常進(jìn)行,醋化率和聚合度均能滿足生產(chǎn)要求。(4)終縮聚。齊聚物經(jīng)R-31,首先進(jìn)人前終縮聚反應(yīng)器R-32,在臥式單軸反應(yīng)釜R-32中,聚合體的聚合度由26提高到63左右。再由其出料齒輪泵輸送至后終縮聚反應(yīng)器R-33,在臥式雙軸攪拌反應(yīng)釜R-33中,聚合體的聚合度由63提高到102左右。再由出料齒輪泵送出,經(jīng)熔體過濾器過濾,除去劣化物和凝聚粒子后,切粒、包裝。在終縮聚反應(yīng)過程中,R-2、R-33反應(yīng)器的真空分別由四級蒸汽噴射泵和五級蒸汽噴射泵產(chǎn)生;在R-32、R-33反應(yīng)器的出料熔體管線上,分別設(shè)置有毛細(xì)管粘度計在線檢測物料粘度,以保證產(chǎn)品的粘度穩(wěn)定[5]。根據(jù)真空噴射泵的結(jié)構(gòu)及原理可知: 由于 EG噴射泵是采用原料 EG 作為噴射泵的動力蒸氣,縮聚抽出的 EG 全部回收利用,所以幾乎不存在 EG 的損失。與水蒸氣噴射泵相比較,不存在廢水的排出,減少了廢水處理的負(fù)擔(dān)。而且噴射級數(shù)只有 3 級,比水蒸氣噴射泵噴射級數(shù)少,運行成本較低; EG 蒸氣對從聚合反應(yīng)帶出的低聚物有一定的溶解性,采用 EG 蒸氣噴射泵可以大大減少真空系統(tǒng)堵塞的概率。
通過手動打開泵出口壓力調(diào)節(jié)閥,利用燃料油輸送泵提供動力進(jìn)行燃料油循環(huán),僅需要每周機(jī)泵試運2 次即可。熱媒爐增壓泵電機(jī)功率為4 kW,按照每kW?h 電0.7 元計算,每年節(jié)約費用4×24 ×360 ×0.7 = 24192( 元) 。
四、結(jié)論
結(jié)合目前連續(xù)聚酯工藝特征及作者多年從事聚酯工程設(shè)計和生產(chǎn)的經(jīng)驗,通過對工藝塔中原來 18層塔盤改進(jìn)為下部用4 層塔盤、上部用 2 層3000 mm填料的結(jié)構(gòu),改變法蘭連接形式,改變加熱盤管結(jié)構(gòu)等方法,對工藝塔進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計,并成功運用于連續(xù)工程 PET 案例,一次開車成功,目前使用已有4 a,運行穩(wěn)定。通過優(yōu)化工藝參數(shù),降低塔頂換熱器循環(huán)水用量,逐步將工藝塔頂廢水溫度上調(diào)至 50 ℃左右,在保證汽提系統(tǒng)進(jìn)水溫度的情況下,使汽提系統(tǒng)的加熱蒸汽得到優(yōu)化。
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【摘要】
目的 觀察新診斷老年糖尿?。―M)患者胰島β細(xì)胞功能特點及其與胰淀素、褪黑素的關(guān)系。方法 收集初診DM患者60例,其中老年DM組27例,成年DM組33例,對照組30例。均行口服葡萄糖耐量試驗(OGTT),計算胰島β細(xì)胞功能指數(shù)(HOMAβ)。采用ELISA法檢測患者空腹血清胰淀素、褪黑素水平。同時測定所有受試者的血脂、體重指數(shù)(BMI)和腰臀比(WHR),并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果 (1)老年DM組與成年DM組比較HOMAβ明顯降低〔(58.20±24.89) vs (81.20±40.80),P
【關(guān)鍵詞】 糖尿?。焕夏?;胰島β細(xì)胞功能;胰淀素;褪黑素
老年糖尿病(DM)與成年DM比較具有起病隱匿、癥狀不典型、進(jìn)展緩慢等特點,其發(fā)病原因尚不明了,胰島β細(xì)胞功能下降是其發(fā)病的主要機(jī)制之一。胰淀素和褪黑素是分別由胰腺和松果腺分泌的老年相關(guān)激素,近年國外有些研究表明胰淀素、褪黑素與老年DM的發(fā)生有一定的關(guān)系〔1,2〕。本研究通過口服葡萄糖耐量試驗(OGTT),分析老年DM患者的胰島β細(xì)胞功能特點;并檢測老年DM患者血清胰淀素、褪黑素的濃度,進(jìn)一步探討兩種老年相關(guān)激素與胰島β細(xì)胞功能的關(guān)系。
1 對象與方法
1.1 對象
病例組60例,為2007年10月至2009年8月期間在我院內(nèi)分泌科住院及門診新診斷的2型糖尿?。═2DM)患者,年齡25~94歲,均未接受胰島素治療,符合下列標(biāo)準(zhǔn):(1)行OGTT后均符合1999年WHO T2DM的診斷標(biāo)準(zhǔn);(2)空腹胰島素(Fins)≥5 μIU/ml;(3)空腹血糖(FPG)≤10 mmol/L。(4)谷氨酸脫羧酶抗體、胰島細(xì)胞自身抗體均陰性。按發(fā)病年齡分為兩組,老年DM組(≥60歲)27例,男14例,女13例,平均年齡(74.59±8.79)歲,成年≥組(25~59歲)33例,男17例,女16例,平均年齡(45.76±8.54)歲。健康老年對照組30例,選擇同期健康體檢者,年齡、性別與老年糖尿病組相匹配,無吸煙史,排除糖尿病、糖耐量減低、冠心病、高血壓、腦血管病及腫瘤等疾病。
1.2 方法
1.2.1 標(biāo)本收集
所有受試者對本試驗知情。老年健康體檢者在禁食12~14 h后,在無應(yīng)激情況下采空腹肘靜脈血。60例DM人均做OGTT及胰島素釋放試驗,清晨空腹取靜脈血后一次性口服75 g葡萄糖,并分別于0.5、1、2、3 h后取靜脈血做血糖及胰島素測定。所有收集的血液分離出血清,于-70 ℃冰箱中保存待用。
1.2.2 檢測指標(biāo)
采用OLYMPUS AU540全自動生化分析儀測定血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)和血清葡萄糖(GLU)。胰島素(INS)測定采用電化學(xué)發(fā)光免疫法,試劑由羅氏公司提供,儀器:電化學(xué)發(fā)光免疫法測定儀2010Elecsys。胰淀素、褪黑素測定采用ELISA,應(yīng)用美國R&D公司試劑盒(板內(nèi)板間變異系數(shù)均小于10%),按說明書操作。腰圍、臀圍、身高、體重由專人測定。
1.2.3 計算指標(biāo)
體重指數(shù)(BMI)=體重(kg)/身高2(m2)。腰臀比(WHR)=腰圍(cm)/臀圍(cm)。按HOMA模型計算胰島素抵抗指數(shù)〔HOMAIR=(Fins×FPG)/22.5〕及胰島β細(xì)胞功能指數(shù)〔HOMAβ=20×Fins/(FPG-3.5)〕。
1.3 統(tǒng)計學(xué)分析
所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS13.0軟件進(jìn)行,連續(xù)性計量資料以x±s表示,非正態(tài)分布的資料以對數(shù)轉(zhuǎn)換成正態(tài)分布后輸入。兩組間比較采用獨立t檢驗 ,計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。相關(guān)分析采用直線相關(guān)分析。
2 結(jié) 果
2.1 各DM組OGTT各點血糖、胰島素值的比較
老年DM組OGTT 2 h血糖及胰島素值均高于成年DM組(均P
2.2 各組研究對象的臨床指標(biāo)比較
老年DM組與成年DM組比較,HOMAβ、TG均明顯降低(P
2.3 老年糖尿病組HOMAβ與其他指標(biāo)的相關(guān)性
在老年DM組內(nèi),HOMAβ與褪黑素呈明顯正相關(guān)(r=0.403,P=0.016),與胰淀素(r=-0.461,P=0.003)、HOMAIR(r=-0.238,P=0.009)呈明顯負(fù)相關(guān),與FPG、INS、TG、WHR則無明顯相關(guān)性,見表3。表3 老年糖尿病組胰島β細(xì)胞功能與其他指標(biāo)的相關(guān)性(略)
3 討 論
胰淀素,又稱胰島淀粉樣多肽(IAPP),在胰島β細(xì)胞和胰島素一起表達(dá)、合成、分泌,被認(rèn)為是胰島素的孿生兄弟,各種影響胰島素分泌的因素同時也影響胰淀素的分泌。本研究結(jié)果顯示,老年DM組血清胰淀素水平明顯高于老年健康組,與國外〔3〕的研究結(jié)果相一致。相關(guān)分析還顯示HOMAβ與胰淀素、HOMAIR呈明顯負(fù)相關(guān),說明增高的胰淀素可能是老年糖尿病患者胰島素分泌缺陷的一個重要原因。胰淀素之所以能夠?qū)е乱葝u功能受損,一方面可能由于胰淀素能抑制胰島素的釋放,提高血漿游離脂肪酸的水平,抑制肌肉組織對葡萄糖的攝取,抑制肝細(xì)胞對葡萄糖的利用和促進(jìn)葡萄糖的產(chǎn)生而誘導(dǎo)胰島素抵抗的發(fā)生。另一方面,胰淀素可自我聚集、變性、沉積在胰島β細(xì)胞內(nèi),通過直接的氧化作用,在細(xì)胞膜形成特異性鈣離子通道,增加P53和P21的表達(dá)等機(jī)制引起胰島β細(xì)胞的損傷和凋亡,導(dǎo)致胰島β細(xì)胞絕對數(shù)目的減少〔4〕,使胰島素分泌最終減少。
通過抑制胰淀素的代謝異常、阻止胰淀素的聚集或拮抗其作用,均具有抗老年糖尿病的潛力。以胰淀素為作用靶點的藥物將可能成為治療老年糖尿病的全新手段。
褪黑素,N乙酰5甲氧基色胺,是色氨酸的衍生物。近年研究表明其是迄今已知的最強(qiáng)的自由基清除劑,能對抗氧化應(yīng)激,對DM及其并發(fā)癥有一定的治療作用〔5,6〕。Ha等〔7〕通過實驗證明褪黑素在分子水平上對血糖有穩(wěn)定作用,并進(jìn)一步推斷老化使內(nèi)源性褪黑素水平下降,可能與老年DM的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本文亦發(fā)現(xiàn),老年DM組血清褪黑素水平明顯低于健康對照組,進(jìn)一步說明了衰老導(dǎo)致的褪黑素水平下降可能為老年DM發(fā)生的原因之一。經(jīng)相關(guān)分析,本文還發(fā)現(xiàn)HOMAβ與褪黑素呈正相關(guān)。大量的動物及人體試驗也證明褪黑素能夠降低血糖,對胰島β細(xì)胞具有保護(hù)作用〔8,9〕。
綜上,胰淀素、褪黑素均與老年糖尿病胰島β細(xì)胞功能有一定的相關(guān)性,但具體的分子機(jī)制目前尚不清楚,仍有待進(jìn)一步深入研究。由于本研究樣本量有限,還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量更深入了解胰淀素、褪黑素與老年DM胰島β細(xì)胞功能的相互關(guān)系,從而尋求有效預(yù)防及治療老年DM的新途徑。
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關(guān)鍵詞: 腎病綜合征;受體,白細(xì)胞介素2;T淋巴細(xì)胞;免疫,細(xì)胞
摘 要:目的 觀察原發(fā)性腎病綜合征(PNS)患者細(xì)胞免疫功能變化. 方法 采用雙抗體夾心ELISA法檢測血清可溶性白細(xì)胞介素2受體(sIL-2R),流式細(xì)胞儀測定外周血T細(xì)胞亞群(CD3+ ,CD4+ ,CD8+ )及紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)(RBC-C3b RR)和紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)(RBC-ICR)試驗. 結(jié)果 原發(fā)性腎病綜合征組sIL-2R明顯高于對照組[(398±122)vs(202±84)pmol?L-1 ,P
+ ,CD8+ 較對照組明顯降低(0.50±0.08)vs(0.71±0.07),(0.26±0.07)vs(0.36±0.07),(0.22±0.05)vs(0.31±0.06),P
Keywords:nephrotic syndrome;receptors,interleukin-2;T-lymphocytes;immunity,cellular
Abstract:AIM To investigate cellular immune function and erythrocyte immune function in patients with primary nephrotic syndrome(PNS).METHODS Soluble interleukin2receptors(sIL-2R)were detected by ELISA.T-lympho-cyte subsets(CD3+ ,CD4+ and CD8+ )were also evaluated by flow cytometry(FCM).The red blood cell C3b receptor rosette(RBC-C3b RR)and the red blood cell immune com-plexs rosette(RBC-ICR)were measured.RESULTS Serum sIL-2R levels were significantly higher in PNS than in normal controls [(398±122)vs(202±84)pmol?L-1 ,P
0 引言
研究發(fā)現(xiàn),機(jī)體免疫功能的異?;蛭蓙y是引起腎臟疾病的基礎(chǔ)[1,2] ,它在腎臟疾病的免疫發(fā)病機(jī)制中的作用日益受到重視[3,4] .我們通過檢測原發(fā)性腎病綜合征(PNS)患者血清可溶性白細(xì)胞介素2受體(sIL-2R),T細(xì)胞亞群及紅細(xì)胞免疫功能,旨在探討PNS患者細(xì)胞免疫功能變化的意義.
1 對象和方法
1.1 對象 PNS患者40(男22,女18)例,年齡16~64(平均40)歲,均為住院患者,通過實驗檢查及臨床確診.對照組20(男13,女7)例,年齡20~40(平均30)歲,血、尿常規(guī)及肝腎功能正常.
1.2 方法
1.2.1 血清SIL-2R的測定 采用雙抗體夾心ELISA法,試劑盒由第四軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室提供,具體操作步驟按說明書進(jìn)行. 1.2.2 T細(xì)胞亞群的測定 取抗凝全血100μL,分別加10μL FITC標(biāo)記抗CD3、抗CD4、抗CD8和IgG鼠單抗混勻,室溫放置15min后,用QPREP自動細(xì)胞制備儀(Bekmn-coulter公司產(chǎn)品),加ABC液溶解紅細(xì)胞和穩(wěn)定淋巴細(xì)胞,輕輕搖蕩10min立即用ProfileⅡ型流式細(xì)胞儀(美國Coullter公司產(chǎn)品)分析,所用激光光源為15mW氫離子激光,波長為A488nm ,檢測1000個以上細(xì)胞.
1.2.3 紅細(xì)胞免疫功能的測定 采用C3b 受體花環(huán)(RBC-C3b RR)和紅細(xì)胞免疫復(fù)合物花環(huán)(RBC-ICR)試驗(第四軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室提供).預(yù)備試驗:將補(bǔ)體致敏的酵母和未致敏的酵母凍干試劑,按說明書要求溶解、洗滌,配制成1×1011 個?L-1 的密度;另取患者末梢血或肝素125kU?L-1 抗凝血1滴,加入2mL生理鹽水,每次經(jīng)2000r?min-1 離心3min后,配制成1.25×1010 個?L-1 密度的紅細(xì)胞懸液.
吸取致敏酵母菌懸液與未致敏酵母菌懸液各50μL,分別加入試管中,混勻,置37℃水浴中30min后取出涂片,加2.5g?L-1 戊二醛1滴,輕輕混勻,自然干燥,進(jìn)行姬姆薩染色,用油鏡(Olympus,日本產(chǎn))觀察.1個紅細(xì)胞上結(jié)合兩個或兩個以上酵母菌者為1個陽性花環(huán)細(xì)胞,共計數(shù)200個紅細(xì)胞,計算出RBC-C3b RR和RBC-ICR的百分率(%).
統(tǒng)計學(xué)處理:實驗數(shù)據(jù)以x ±s表示,兩組間比較采用t檢驗,用SPLM統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析.
2 結(jié)果
2.1 sIL2R及T淋巴細(xì)胞亞群的變化 PNS患者外周血sIL-2R水平較對照組明顯增高,有顯著差異(P
+ ,CD8+ 較對照組明顯降低,有顯著差異(P
表1 sIL-2R及T淋巴細(xì)胞亞群的變化 略
2.2 紅細(xì)胞免疫功能的變化 PNS患者RBC-C3bRR明顯低于對照組,有顯著差異(P
表2 紅細(xì)胞免疫功能的變化 略
3 討論
PNS是由原發(fā)性腎臟病引起,并非是細(xì)菌等致病因子直接侵犯腎臟引起,而是與免疫反應(yīng)相關(guān),當(dāng)致病的抗原進(jìn)入人體后,被吞噬細(xì)胞攝取,淋巴細(xì)胞對這些抗原進(jìn)行識別引起免疫反應(yīng),造成腎小球損傷.目前已證實是一組免疫介導(dǎo)性疾病[5] .T淋巴細(xì)胞亞群是構(gòu)成機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要因素,體內(nèi)免疫平衡是通過輔T細(xì)胞CD4+ 和抑制性T細(xì)胞CD8+ 形成的T細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)來維持調(diào)節(jié)免疫功能的平衡[6] ,二者的升高與降低,均可使兩者的比例失調(diào),導(dǎo)致機(jī)體免疫功能的異?;蛭蓙y[7] .免疫學(xué)研究證實,紅細(xì)胞具有抗原提呈細(xì)胞作用,能促進(jìn)T細(xì)胞的免疫功能,擴(kuò)大細(xì)胞免疫效應(yīng),參與細(xì)胞免疫調(diào)控[8] ,并能清除體內(nèi)的免疫復(fù)合物,促進(jìn)吞噬細(xì)胞的吞噬功能,調(diào)節(jié)體液免疫和細(xì)胞免疫,粘附自身的T細(xì)胞,增強(qiáng)T細(xì)胞免疫功能,更有效地清除免疫復(fù)合物[9] .本資料顯示PNS患者血清sIL-2R水平明顯高于對照組(P
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【摘要】 目的 觀察連枷胸犬胸壁加壓包扎、肋骨牽引和手術(shù)內(nèi)固定的治療效果。方法 實驗用Beagle犬24只,隨機(jī)分為A組(對照組)、B組(包扎治療組)、C組(牽引治療組)和D組(手術(shù)固定組),每組6只,建立大面積(15cm2/kg)浮動胸壁動物摸型。用MPA動物肺功能記錄儀、血氣分析、胸腔置管等觀察犬呼吸頻率(RR)、潮氣量(Vt)、每分鐘靜息通氣量(VE) 、肺順應(yīng)性(CL)、氣道阻力(Raw)、動脈血氧分壓(PaO2)、動脈血二氧化碳分壓(PaCO2)、動脈血氧飽和度(SaO2)、剩余堿(BE)及胸膜腔內(nèi)壓(IPP)等變化,比較胸壁加壓包扎、肋骨牽引固定和手術(shù)內(nèi)固定的治療效果。結(jié)果 浮動胸壁模型完成后,均出現(xiàn)反常呼吸,胸膜腔內(nèi)壓負(fù)壓絕對值減小(P
【關(guān)鍵詞】 連枷胸;生理學(xué);肋骨骨折;牽引術(shù);包扎;內(nèi)固定
Abstract: Objective To study curative effect of pressure dressing on chest wall,traction and internal fixation on pulmonary function in dogs with flail chest.Methods A total of 24 Beagle dogs were set up as great floating thoracic wall models(15cm2/kg), then pided into internal fixation group,rib skeletal traction group,pressure dressing group and control group randomly,with 6 dogs in each group.The change of respiratory rate(RR),tidal volume(Vt),minute ventilation(VE),lung compliance(CL),airway resistance(Raw),partial pressure of oxygen in artery (PaCO2),partial pressure of carbon dioxide in artery(PaCO2),arterial oxygen saturation(SaO2),base excess(BE),intrapleural pressure(IPP) were observed and recorded by MPA pulmonary function recorder and blood gas analysis.At last the therapeutic effect was compared among 4 groups.Results Paradoxical respiration occurred;intrapleural pressure decreased(P
Key words:flail chest;physiology;rib fracture;traction;dressing;internal fixation
連枷胸是最嚴(yán)重的胸壁損傷,其病死率達(dá)12%~50%[1]。對連枷胸浮動胸壁固定治療,其固定方法的選擇與對連枷胸所牽涉的復(fù)雜的病理生理的認(rèn)識密切相關(guān)。近年來,國內(nèi)外學(xué)者大多認(rèn)為連枷胸所致的呼吸困難主要是由肺挫傷和反常呼吸引起[2] 。筆者通過動物實驗,排除肺挫傷的影響。觀察大面積浮動胸壁對犬呼吸功能的影響以及胸壁加壓包扎、肋骨牽引和手術(shù)內(nèi)固定治療的作用。
材料與方法
1 動物分組與模型建立
試驗用Beagle犬24只,體重為(10.32±1.56)kg。用3%戊巴比妥鈉(25mg/kg)靜脈注射麻醉,氣管插管后在右側(cè)胸部相應(yīng)面積(15cm2/kg)肋骨的兩端切開胸壁皮膚,各游離肋骨3cm,保持胸膜完整,切斷并剪去肋骨1cm,以確保損傷區(qū)域的胸壁能隨呼吸自由浮動,縫合切口。模型制成后,隨機(jī)分為4組,每組各6只犬(雌雄不拘)。A組為對照組,不進(jìn)行治療干預(yù);B組為包扎治療組:以浮動胸壁為中心,選用相應(yīng)大小的厚棉墊加壓包扎,使浮動胸壁極度內(nèi)陷,進(jìn)而消除反常呼吸;C組為牽引治療組:行肋骨巾鉗懸吊牽引固定,牽引重量為0.5~1kg,以正好對抗反常呼吸運動為宜;D組行手術(shù)切開復(fù)位,鋼板+螺絲釘內(nèi)固定治療。上述3種治療方法,在治療過程中均需保持胸膜腔完整。
2 觀察指標(biāo)
對實驗犬行全麻氣管插管后,氣管插管外接MPA動物肺功能記錄儀,測呼吸頻率(RR)、潮氣量(Vt)、每分鐘通氣量(VE)、肺順應(yīng)性(CL)、氣道阻力(Raw)。于術(shù)側(cè)腋中線第8肋間置胸腔管,接MPA動物肺功能記錄儀測胸膜腔內(nèi)壓(IPP),適時記錄測量結(jié)果。采抽取動脈血測動脈血氧分壓(PaO2)、動脈血二氧化碳分壓(PaCO2)、動脈血氧飽和度(SaO2)、剩余堿(BE)、SB等。分別記錄模型建立前、制模1小時、A組制模4小時、B、C、D組模型建立后4小時的上述觀察指標(biāo)。
3 數(shù)據(jù)處理
所測數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 13.0統(tǒng)計軟件,采用多個樣本均數(shù)間的多重比較的統(tǒng)計學(xué)方法(SNKq)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
結(jié) 果
浮動胸壁模型完成后,24只犬均出現(xiàn)胸壁反常運動,浮動幅度2~3cm。胸膜腔內(nèi)壓負(fù)壓絕對值減小(P
討 論
1 連枷胸行胸壁固定治療的理論依據(jù)
胸壁的完整性對呼吸功能的維持有重要作用。連枷胸肺容量的減少主要是胸壁不穩(wěn)及肺挫傷所致的纖維化導(dǎo)致。通常將連枷胸分類為前外側(cè)區(qū)和后外側(cè)區(qū),兩種類型均包含側(cè)面區(qū)域,該區(qū)有反映呼吸力學(xué)的前鋸肌指狀突的插入。Borrelly等[3]報道前鋸肌在連枷區(qū)錯位復(fù)雜的病理生理過程中有重要作用,當(dāng)涉及肩關(guān)節(jié)活動或作為吸氣肌時,連于每根肋骨上的前鋸肌指狀突有如拉抽屜一樣使連枷區(qū)錯位,使其向后上方移位,由此產(chǎn)生肋骨斷端重疊,并會導(dǎo)致傷者肺容量減少的惡性循環(huán)。外科手術(shù)固定骨折肋骨可有效防止或中止肋骨錯位的惡性循環(huán),早期復(fù)位和固定骨折肋骨,恢復(fù)胸壁的幾何形狀,保持胸壁的完整性,避免了因胸壁變形對肺功能的損害。Voggenreiter等[4]證實了對無肺挫傷連枷胸患者首先行手術(shù)治療的重要性。據(jù)Clark等[5]統(tǒng)計31%的孤立性肺挫傷患者需要機(jī)械通氣治療,而57%的孤立性連枷胸患者需要機(jī)械通氣治療,再次強(qiáng)調(diào)了胸壁機(jī)械性完整性的重要作用。
2 胸壁加壓包扎固定的治療效果
20世紀(jì)初期對連枷胸采用捆綁固定的方法進(jìn)行治療,當(dāng)時認(rèn)為包扎固定可增加胸壁穩(wěn)定性、減少疼痛和可能有助于咳嗽。本實驗結(jié)果表明,在大面積連枷胸包扎固定后與對照組比較,IPP、Raw、RR顯著升高(P
3 牽引固定的治療效果
肋骨牽引固定是過去臨床常用于浮動胸壁的一種方法,認(rèn)為牽引固定后連枷胸側(cè)胸壁的幾何形狀可恢復(fù),胸腔容積可增加,牽引固定保持了胸壁的完整性,避免了因胸壁變形對其下肺區(qū)域的壓迫,從而能產(chǎn)生足夠的潮氣量。本實驗結(jié)果表明:與對照組比較,牽引治療后Vt、Raw顯著升高(P0.1)。說明牽引治療后實驗犬的潮氣量雖有部分增加,但I(xiàn)PP、PaO2、PaCO2、SaO2、BE、CL、VE、RR變化不明顯,其低氧狀態(tài)未能得到有效改善。這主要是因為大面積浮動胸壁形成后,牽引固定雖能部分改善通氣,但由于牽引外力持續(xù)作用于傷側(cè)胸壁,對抗其彈性回縮,被牽引的浮動胸壁無法與健側(cè)胸壁進(jìn)行協(xié)同呼吸運動,無法恢復(fù)肋骨生理狀態(tài)杠桿作用,胸廓生理狀態(tài)的完整性未能得以恢復(fù),肺的順應(yīng)性改善不明顯,故呼吸功能仍不能恢復(fù)正常,缺氧狀態(tài)無法得到有效改善。所以,至少對于大面積連枷胸來說,單純行牽引固定無法達(dá)到滿意療效。
4 手術(shù)內(nèi)固定的治療效果
1975年Richardson等[6]首次報道了用鋼絲修復(fù)胸骨骨折的方法。連枷胸手術(shù)內(nèi)固定可有效地減少機(jī)械通氣時間和ICU時間,減少肺炎的發(fā)病率及降低病死率,恢復(fù)胸壁的幾何形狀及生理狀態(tài)的完整性,恢復(fù)肋骨生理狀態(tài)杠桿作用,提高傷側(cè)肺的順應(yīng)性,進(jìn)而改善呼吸功能。本實驗結(jié)果表明,與對照組比較,手術(shù)內(nèi)固定治療后PaO2、PaCO2、SaO2、CL、Vt、VE顯著升高(P
參考文獻(xiàn)
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[關(guān)鍵詞] 伊貝沙坦;比索洛爾;心力衰竭;細(xì)胞因子;左心室功能
[中圖分類號] R541.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701(2011)32-01-03
The Effects of Combination of Irbesartan and Bisoprolol on Serum Cytokine Levels and Left Ventricular Function Parameters of Patients with Chronic Heart Failure.
ZENG Lizhong XIE Zhenhua YANG Weiping
1.The Chronic Diseases Hospital of Luohu District of Shenzhen City in Guangdong Province,Shenzhen 518023,China;2.Shenzhen City Luohu District Hospital for Chronic Diseases,Shenzhen 518023,China;3. Guangdong Province Huizhou Central People’s Hospital,Huizhou 516001,China
[Abstract] Objective To investigate the effects of combination of irbesartan and bisoprolol on the serum cytokine levels and left ventricular function of patients with chronic heart failure. Methods We chose 80 cases of chronic heart failure patients and randomly divided them. The patients in treatment group were administrated combination of irbesartan 150mg Qd and bisoprolol 5mg Qd for one year,and those in control group were only administrated irbesartan 150mg Qd for one year. Before and after the treatment,the levels of serum cytokine levels and left ventricular function parameters were measured,and the side effects of two groups were also observed. Results In both groups,the levels of the serum levels of cytokines including interleukin-1(IL-1),interleukin-6(IL-6) and tumor necrosis factor-α(TNF-α) were lower than those before treatment(P<0.05). Compared with the control group,the changes in treatment group were significant(P<0.05). The left ventricular functions of both groups were significantly improved(P<0.05),and more significant changes were found in patients of treatment group(P<0.05). Conclusion Combination of irbesartan and bisoprolol can effectively lower the serum levels of cytokines in patients with chronic heart failure,and improve their left ventricular function. Therefore,it can be an ideal method of therapy for the patients with chronic heart failure.
[Key words] Irbesartan;Bisoprolol;Heart failure;Cytokine;Left ventricular function
慢性心力衰竭是指由各種心臟疾病導(dǎo)致心功能不全的一種常見臨床綜合征,絕大多數(shù)情況下是指心肌收縮力下降使心排出量不能滿足機(jī)體代謝需要,器官組織灌流不足,同時出現(xiàn)體循環(huán)和(或)肺循環(huán)淤血,是各種器質(zhì)性心臟病發(fā)展的最終階段,也是導(dǎo)致心臟病患者死亡的重要原因。研究表明,慢性心力衰竭是一個以免疫激活和低程度的慢性炎癥為特點的疾病。一些炎癥因子能通過促進(jìn)心肌細(xì)胞肥厚、心肌收縮功能惡化以及誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡,在心衰的發(fā)展過程中具有重要作用。其中,血清腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(Interleukin-1,IL-1)及白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)等細(xì)胞因子異常激活參與了心力衰竭和心肌重構(gòu)的發(fā)生過程,是心力衰竭重要的發(fā)病機(jī)制[1-3]。
伊貝沙坦(安博維,杭州賽諾菲-安萬特民生制藥有限公司)作為血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑,是高血壓和慢性心衰治療的一線藥物[4,5]。比索洛爾是選擇性β-腎上腺素受體阻斷劑,能抑制慢性心力衰竭患者的心肌重塑,降低心衰死亡率[6]。本研究隨機(jī)選擇慢性心衰患者80例,探討合用伊貝沙坦和比索洛爾對慢性心衰患者細(xì)胞因子和左室功能的作用。
1 資料與方法
1.1 一般資料
采用隨機(jī)的方式選擇2006年10月~2008年9月在本院住院或門診就診的慢性心衰患者共80例,隨機(jī)分成治療組和對照組。在強(qiáng)心和利尿等常規(guī)治療基礎(chǔ)上,治療組口服伊貝沙坦150mg/d,比索洛爾5mg/d;對照組口服伊貝沙坦150mg/d,療程為1年。其中,治療組共40例,男性29例,女性11例,平均(67±11)歲,按NYHA心功能分級為Ⅱ級31例,Ⅲ級9例;對照組40例,男性28例,女性12例,平均年齡(68±10)歲,Ⅱ級32例,Ⅲ級8例。兩組患者在年齡、性別和心功能分級上均無顯著差異(P=0.62,0.47,0.85)。入選的患者依據(jù)病史、癥狀、體征、超聲心動圖和X線檢查等確診慢性心衰,并除外急性腦血管病、肝腎功能不全和惡性腫瘤者。
1.2 檢測指標(biāo)
服藥前和及服藥后1年清晨抽取空腹血10mL,離心取血清置于-80℃冰箱保存待測。用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)測定血清IL-1、IL-6和TNF-α水平,試劑盒產(chǎn)于福建邁新生物公司,嚴(yán)格按照說明書操作。采用美國HP-1000型超聲心動圖機(jī)檢測左室功能指標(biāo):左心室射血分?jǐn)?shù)(EF)、心輸出量(CO)、左室舒張末期容量(LVEDV)和左心室小徑縮短率(FS)。同時嚴(yán)密觀察患者不良反應(yīng)。
1.3 統(tǒng)計學(xué)處理
采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)用(χ±s)表示,組間比較采用分組t檢驗,治療前后比較采用配對t檢驗,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 兩組患者血清IL-1、IL-6和TNF-α水平比較
兩組患者治療前血清IL-1、IL-6和TNF-α水平無明顯差異(P>0.05)。治療后兩組患者IL-1、IL-6和TNF-α水平降低(P<0.05),但治療組降低較對照組更為明顯(P<0.05)。見表1。
2.2 兩組患者左心室功能指標(biāo)比較
治療前治療組和對照組左心室功能指標(biāo)無顯著差異(P>0.05);治療后兩組患者左心室功能均明顯改善(P<0.05),治療組改善更加明顯(P<0.05)。見表2。
2.3 兩組患者血壓和心率比較
治療組和對照組患者血壓和心率治療前無顯著差異(P>0.05)。治療后兩組患者血壓和心率均有下降(P<0.05),但是兩組相比無明顯差異(P>0.05)。見表3。
2.4 不良反應(yīng)觀察
治療組發(fā)生低血壓3例,不良反應(yīng)發(fā)生率是7.5%,對照組發(fā)生低血壓2例,不良反應(yīng)發(fā)生率是5%,兩組無顯著性差異(P=0.54)。所有患者未出現(xiàn)血管神經(jīng)性水腫和腎功能不全等嚴(yán)重不良反應(yīng)。
3 討論
報道表明細(xì)胞因子在慢性心力衰竭病理生理和發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用。慢性心力衰竭患者常伴炎癥細(xì)胞因子的過度激活,導(dǎo)致IL-1、IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子的過度分泌,促進(jìn)心肌重塑, 引起心肌細(xì)胞凋亡、壞死和間質(zhì)增生,造成心肌受損與加重心功能惡化,是慢性心力衰竭發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制[7]。其中,IL-1是由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的多肽物質(zhì),具有廣泛的生物學(xué)活性,在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中起著重要的作用。IL-1能通過影響基因水平上的C型利鈉肽表達(dá),促進(jìn)其在心衰中自分泌和內(nèi)分泌作用,參與慢性心衰過程中的左心室心肌重塑[8]。IL-6是由一種具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子,可介導(dǎo)炎癥細(xì)胞激活和炎癥因子釋放,導(dǎo)致炎癥細(xì)胞聚集和心肌細(xì)胞損害。TNF-α是重要的炎性介質(zhì),可以通過促進(jìn)內(nèi)皮素-1產(chǎn)生,導(dǎo)致炎癥和心肌細(xì)胞壞死,降低心肌收縮力,引起心肌損傷[9]。此外,TNF-α還可通過激活基質(zhì)金屬蛋白酶和抑制基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑表達(dá)參與細(xì)胞外基質(zhì)重塑,促進(jìn)心肌重塑,加重左心室衰竭的發(fā)生。IL-1、IL-6和TNF-α可通過心肌細(xì)胞與細(xì)胞因子受體反應(yīng),提高誘生型一氧化氮合成酶活性,削弱兒茶酚胺正性肌力作用,誘導(dǎo)氧自由基生成,促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡及壞死,加速促進(jìn)心肌重構(gòu)。心肌損傷又可引起上述細(xì)胞因子過度分泌,形成惡性循環(huán),促進(jìn)心衰發(fā)生發(fā)展。因此,炎癥細(xì)胞因子的過度激活是慢性心衰的重要發(fā)病機(jī)制。
伊貝沙坦能較完全地阻斷血管緊張素Ⅱ和醛固酮的過度激活,是當(dāng)前慢性心衰治療的一線用藥。本研究發(fā)現(xiàn)對照組患者經(jīng)伊貝沙坦治療后,細(xì)胞因子水平明顯降低,左室功能改善,表明伊貝沙坦能有效抑制細(xì)胞因子的分泌,改善左室功能。血管緊張素Ⅱ與受體結(jié)合后,作用于核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB并上調(diào)多種炎癥細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄,誘導(dǎo)IL-1和IL-6等多種炎癥細(xì)胞因子分泌[10]。所以,伊貝沙坦可能通過阻斷血管緊張素Ⅱ受體,抑制IL-1、IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄和分泌,抑制炎癥反應(yīng)并改善左心室功能。血管緊張素Ⅱ還能通過拮抗血管緊張素Ⅱ縮血管作用,增加腎臟血流,促進(jìn)ET清除[11],阻斷ET和血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引起的心肌重塑,同時減少緩解肽降解,增加緩解肽水平,拮抗心肌細(xì)胞凋亡,防止心肌損傷和心功能受損。
比索洛爾是一種選擇性β1受體阻滯劑,在目前各種選擇性β1受體阻滯劑異性最高,能較完全地阻斷神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)過度激活產(chǎn)生的不良作用,是具有良好心血管保護(hù)作用的藥物。本文發(fā)現(xiàn)聯(lián)用伊貝沙坦和比索洛爾能更顯著降低慢性心衰患者細(xì)胞因子水平,改善左心室功能,這表明比索洛爾可以協(xié)同伊貝沙坦,發(fā)揮抑改善左心室功能和心肌保護(hù)的作用。研究表明,炎癥細(xì)胞因子的分泌與交感神經(jīng)興奮和兒茶酚胺產(chǎn)生增加有關(guān)[12],所以,比索洛爾可能通過選擇性阻斷β1受體,抑制交感神經(jīng)系統(tǒng)的過度激活,減少兒茶酚胺的產(chǎn)生,抑制上述細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄及其分泌,降低血清IL-1、IL-6和TNF-α水平,改善左心室功能。同時,本研究發(fā)現(xiàn)兩組患者治療后血壓和心率無顯著差異,說明比索洛爾對慢性心衰患者細(xì)胞因子和左心室功能的作用與其對血壓和心率的影響無關(guān)。同時,兩組患者治療不良反應(yīng)較少,說明聯(lián)用伊貝沙坦和比索洛爾有較好安全性。
總之,與單用伊貝沙坦相比,聯(lián)用伊貝沙坦和比索洛爾能更有效降低慢性心衰患者細(xì)胞因子水平,改善其左心室功能,是慢性心力衰竭理想的治療方案。
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本研究從[專業(yè)提供寫作論文和論文寫作服務(wù),歡迎您的光臨dylw.net]種植體周圍炎患者脫落種植體周圍骨組織中獲取成骨細(xì)胞,通過對炎癥與正常組織來源的成骨細(xì)胞進(jìn)行對比,探討種植體周圍炎對成骨細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,為種植修復(fù)提供理論基礎(chǔ)。
1 材料和方法
1.1 臨床樣本收集
種植體周圍炎的骨組織樣本來自中國總醫(yī)院種植科,選取患者年齡小于等于60歲、種植體植入年限小于等于3年、種植于磨牙區(qū)且因種植體周圍炎出現(xiàn)種植體脫落的患者4例,刮取種植體附著以及種植窩中的骨組織。正常組織來源的樣本來自中國總醫(yī)院口腔外科,選取4例身體健康的相同年齡段的第三磨牙拔除術(shù)患者,夾取舌側(cè)骨板。所有患者均排除牙周炎,且近期沒有急性感染、糖尿病、家族遺傳病和骨質(zhì)疏松癥等全身系統(tǒng)性疾病。本研究已經(jīng)中國總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),且每例患者均簽署了知情同意書。
1.2 成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)與純化
PBS反復(fù)沖洗5次組織塊,將較大的組織塊剪為1 mm3大小,轉(zhuǎn)移至離心管中,加入含有13.7 g·L-1 Ⅳ型膠原酶(北京索萊寶科技有限公司)和5 g·L-1胰蛋白酶(Amresco公司,美國)的消化液,37 ℃震蕩消化45 min。1 000 r·min-1離心8 min,去上清,加入H-DMEM培養(yǎng)液(GIBCO公司,美國)和10%胎牛血清(Invitrogen公司,美國),吸管反復(fù)吹打成細(xì)胞懸液,接種培養(yǎng)皿中,置于37 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后觀察細(xì)胞貼壁及生長情況,待鋪皿80%進(jìn)行傳代。采用反復(fù)貼壁法[3]對細(xì)胞進(jìn)行純化。
1.3 堿性磷酸酶鑒定染色
將第3代分離純化后的成骨細(xì)胞以每孔1×104個的密度接種于24孔板,細(xì)胞達(dá)70%時,用4%多聚甲醛在4 ℃固定30 min。PBS反復(fù)沖洗后,使用堿性磷酸酶試劑盒(Sigma公司,美國)染色1 h。PBS反復(fù)沖洗后,在倒置相差顯微鏡下進(jìn)行常規(guī)觀察及照相。
1.4 MTT法檢測成骨細(xì)胞的增殖能力
取對數(shù)生長期第3代細(xì)胞,經(jīng)胰蛋白酶消化后離心加入DMEM(10%胎牛血清)終止成細(xì)胞混懸液,調(diào)整密度為2×104個·mL-1接種于96孔板,每孔0.2 mL。貼壁后隔天換液,連續(xù)培養(yǎng)8 d。每隔24 h取3孔,每孔加入20 μL 5 g·L-1 MTT溶液,37 ℃、5%
CO2[專業(yè)提供寫作論文和論文寫作服務(wù),歡迎您的光臨dylw.net]孵箱中孵育4 h,加入二甲基亞砜200 μL。采用酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm波長下檢測吸光度值,實驗重復(fù)3次。
1.6 Western blot法檢測成骨細(xì)胞相關(guān)蛋白OCN的表達(dá)
取第3代細(xì)胞進(jìn)行接種,培養(yǎng)7 d后,將細(xì)胞用0.01 mol·L-1 PBS反復(fù)沖洗3遍,裂解細(xì)胞提取蛋白。取等量蛋白經(jīng)8%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后,將凝膠轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上,脫脂奶粉封閉過夜。加入鼠抗人OCN(Abcam公司,英國)(1︰1 000稀釋)和β-actin(1︰2 000稀釋),37 ℃孵育2 h,洗膜后,經(jīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG2a(Abcam公司,英國)(1︰4 000稀釋)孵育50 min,化學(xué)發(fā)光法顯示抗原抗體復(fù)合物,X線片顯影并定影,所有雜交信號經(jīng)成像分析儀系統(tǒng)測定條帶密度進(jìn)行定量分析,以目的蛋白灰度值與內(nèi)參β-actin的比值表示蛋白的表達(dá)水平。
1.7 統(tǒng)計學(xué)分析
采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,獨立樣本t檢驗進(jìn)行兩組間比較,P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。
2 結(jié)果
2.1 成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)及純化
種植體周圍炎來源的成骨細(xì)胞與正常組織來源的成骨細(xì)胞在培養(yǎng)過程中狀態(tài)基本相同,10~14 d時從組織塊中爬出,形狀多為不規(guī)則形和三角形(圖1)。反復(fù)貼壁法純化成骨細(xì)胞貼壁后,2種來源的細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上無明顯差異,細(xì)胞均呈長梭形和多邊形,胞核可見多核仁,呈圓形或橢圓形(圖2)。
2.2 堿性磷酸酶鑒定染色
細(xì)胞固定后按堿性磷酸酶活性檢測試劑盒要求進(jìn)行檢測,可見藍(lán)黑色顆粒沉積在胞漿堿性磷酸酶活性部位(圖3)。2種來源細(xì)胞都表現(xiàn)出了堿性磷酸酶陽性,但正常組織來源的成骨細(xì)胞比種植體周圍炎來源成骨細(xì)胞內(nèi)可見更多染色顆粒。
2.3 2種來源的成骨細(xì)胞增殖能力的比較
MTT檢測結(jié)果(圖4)表明,正常組織來源與種植體周圍炎來源的成骨細(xì)胞都表現(xiàn)出了一定的體外擴(kuò)增能力,從第4天起2種來源細(xì)胞的增殖能力出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),種植體周圍炎來源的成骨細(xì)胞的增殖活力明顯低于正常組織來源的成骨細(xì)胞。
2.5 2種來源的成骨細(xì)胞相關(guān)蛋白的比較
Western blot檢測結(jié)果表明,培養(yǎng)7 d時,與正常組織來源的成骨細(xì)胞相比,種植體周圍炎來源的成骨細(xì)胞OCN的表達(dá)降低,相對灰度值分析表明種植體周圍炎來源的成骨細(xì)胞OCN的表達(dá)水平約為正常組織來源的1/3(P<0.05)(圖6)。
3 討論
骨結(jié)合是牙種植手術(shù)的基礎(chǔ)。種植體與頜骨骨性結(jié)合面的形成與種植區(qū)的骨密度密切相關(guān),骨密度越高,種植體與骨的結(jié)合率就越高[4]。種植體周圍炎正是在炎性微環(huán)境下,破壞了種植體與頜骨的骨結(jié)合,從而使種植體周圍支撐骨組織的功能喪失。成骨細(xì)胞在骨組織的修復(fù)和改建中起到重要作用,是維持骨組織新陳代謝[專業(yè)提供寫作論文和論文寫作服務(wù),歡迎您的光臨dylw.net]的主要細(xì)胞;因此,研究炎癥組織來源的成骨細(xì)胞很有意義。
本研究從種植體周圍炎種植體脫落患者的頜骨骨組織中分離培養(yǎng)獲得了炎癥組織來源的成骨細(xì)胞,通過比較炎癥組織來源的成骨細(xì)胞和正常組織來源的成骨細(xì)胞的增殖能力以及相關(guān)骨組織修復(fù)基因的表達(dá)等生物學(xué)功能變化,探討炎性微環(huán)境對成骨細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。
本實驗選用的成骨細(xì)胞均為第4代以內(nèi)的細(xì)胞,結(jié)果表明,炎癥組織來源的細(xì)胞在體外培養(yǎng)后仍然具有一定的炎癥組織來源特異性。炎性細(xì)胞因子和種植體周圍炎致病菌的毒力因子會導(dǎo)致成骨細(xì)胞的增殖能力顯著 下降。本研究結(jié)果顯示,種植體周圍炎來源的成骨細(xì)胞雖然在形態(tài)學(xué)上并沒有表現(xiàn)出和正常組織來源的成骨細(xì)胞有明顯差異,但是在細(xì)胞增殖活力方面表現(xiàn)出了不同,種植體周圍炎來源的成骨細(xì)胞的增殖活力整體低于正常組織來源的成骨細(xì)胞。筆者認(rèn)為這是由于種植體周圍炎的炎性微環(huán)境抑制了成骨細(xì)胞的增殖能力。
Runx2和Col Ⅰ是反應(yīng)成骨細(xì)胞分化能力的重要指標(biāo),Runx2是成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,在骨組織的形成與重建過程中具有重要的作用[5]。炎性因子會影響Runx2的表達(dá)從而抑制成骨細(xì)胞的分化能力[6-7]。Col Ⅰ是成骨細(xì)胞分化成骨的重要基質(zhì)。研究[8]表明,種植體周圍炎的齦溝液中Col Ⅰ水平下降。本研究結(jié)果顯示,種植體周圍炎來源的成骨細(xì)胞的Runx2和Col Ⅰ表達(dá)水平相比正常組織來源顯著下降,表明炎性微環(huán)境可影響成骨細(xì)胞的成骨分化能力,抑制Runx2和Col Ⅰ的正常表達(dá),這與Liu等[9]對干細(xì)胞的研究結(jié)果一致。
OCN與成骨細(xì)胞的礦化緊密相關(guān),在一定程度上反應(yīng)了成骨細(xì)胞礦化的能力。學(xué)者[10]研究證實炎性微環(huán)境會降低[專業(yè)提供寫作論文和論文寫作服務(wù),歡迎您的光臨dylw.net]OCN的表達(dá)。本研究中,種植體周圍炎來源的成骨細(xì)胞由于在炎性微環(huán)境下降低了OCN mRNA的表達(dá),從而導(dǎo)致OCN蛋白水平也明顯降低??梢娧仔晕h(huán)境抑制了成骨細(xì)胞礦化的能力。
炎性微環(huán)境下成骨細(xì)胞的生物學(xué)功能受多方面調(diào)控,通過對比種植體周圍炎來源的成骨細(xì)胞和正常組織來源的成骨細(xì)胞的生物學(xué)功能變化,可以確定炎性微環(huán)境下成骨細(xì)胞的生物學(xué)功能受到影響,成骨分化及礦化能力顯著降低,這是種植體周圍骨組織吸收的重要原因。其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步的深入研究。
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