臨床醫(yī)學(xué)流式細(xì)胞術(shù)研究

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摘要：流式細(xì)胞術(shù)是能在分子水平上對(duì)細(xì)胞內(nèi)外因子進(jìn)行快速定性和定量研究的一種細(xì)胞分析和檢測的手段，是當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)。是近代細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、分子免疫學(xué)和單克隆技術(shù)、激光技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)技術(shù)等學(xué)科高度發(fā)展的結(jié)晶。其具有測量指標(biāo)多、采集數(shù)量大、可高速分析上萬個(gè)細(xì)胞，而且可同時(shí)檢測一個(gè)樣本中的多個(gè)被測因子，可進(jìn)行多參數(shù)測量等優(yōu)點(diǎn)。近年來流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展取得了顯著的成果，其應(yīng)用領(lǐng)域和使用范圍也在不斷擴(kuò)大。本文對(duì)流式細(xì)胞術(shù)的工作原理和流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了簡單的概述，并對(duì)其在血液學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)菌學(xué)、中醫(yī)學(xué)等方面進(jìn)行了綜述。

關(guān)鍵詞：流式細(xì)胞術(shù)；臨床醫(yī)學(xué)；應(yīng)用

近年來，隨著單克隆抗體的應(yīng)用及流式細(xì)胞術(shù)的快速發(fā)展，流式細(xì)胞術(shù)（FCM）已成為許多疾病診斷和分性的重要依據(jù)。流式細(xì)胞術(shù)是20世紀(jì)70年展起來的一項(xiàng)高新技術(shù)，它作為一門生物檢測技術(shù)集計(jì)算機(jī)技術(shù)、測量技術(shù)、激光技術(shù)、流體動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)于一體，是對(duì)快速直線運(yùn)動(dòng)狀態(tài)中的細(xì)胞、生物顆?；蛞后w中的大分子物質(zhì)進(jìn)行多參數(shù)的、快速的定量分析和分選的一種技術(shù)［1］。1973年美國BD公司推出全國第一臺(tái)流式細(xì)胞儀，通過對(duì)流動(dòng)液體中排列成單列細(xì)胞或顆粒進(jìn)行逐個(gè)檢測得到該細(xì)胞或顆粒的光散射和熒光指標(biāo)，分析它們的體積、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等物理及化學(xué)性質(zhì)，還能對(duì)所需要的細(xì)胞進(jìn)行分選等。具有檢測速度快、測量指標(biāo)多、采集數(shù)量大，對(duì)所需的細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行分析或分選等特點(diǎn)［2］，其在生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、遺傳免疫學(xué)、腫瘤學(xué)等眾多研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

1流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)及工作原理

1．1流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)

主要由五部分組成：（1）流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)；（2）激光光源及光束形成系統(tǒng)；（3）光學(xué)系統(tǒng)；（4）信號(hào)檢測與儲(chǔ)存、顯示、分析系統(tǒng)；（5）細(xì)胞分選系統(tǒng)。

1．2流式細(xì)胞儀的工作原理

將待測細(xì)胞染色后制成單細(xì)胞懸液，用一定壓力將待測樣品壓入流動(dòng)室，不含細(xì)胞的硫酸緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管入口方向與待測樣品流成一定角度，這樣鞘液就能夠包繞樣品高速流動(dòng)，組成一個(gè)圓形的流束，待測細(xì)胞在鞘液的包繞下單行排列，依次通過檢測區(qū)域。流式細(xì)胞儀通常以激光作為光源，經(jīng)過聚焦整形后的光束，垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細(xì)胞在激光束的照射下，產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光，這兩種信號(hào)同時(shí)被前向光電二極管和90°方向的光電倍增管接收，光散射信號(hào)在前向小角度進(jìn)行檢測，這種信號(hào)基本上反映了細(xì)胞體積的大?。粺晒庑盘?hào)的接受方向與激光束垂直，經(jīng)過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個(gè)不同波長的熒光信號(hào)，這些熒光信號(hào)的強(qiáng)度代表了所測細(xì)胞膜表面抗原的強(qiáng)度或核內(nèi)物質(zhì)的濃度，經(jīng)光電倍增管接收后可轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，再通過模／數(shù)轉(zhuǎn)換器將連續(xù)的電信號(hào)轉(zhuǎn)換為可被計(jì)算機(jī)識(shí)別的數(shù)字信號(hào)，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)將這些數(shù)字信號(hào)收集、儲(chǔ)存，以一維直方圖或二維點(diǎn)陣圖及數(shù)據(jù)表或三維圖形顯示出來，可以用不同的標(biāo)記物進(jìn)行雙參數(shù)、三參數(shù)甚至多參數(shù)的分析［3，4］。

2流式細(xì)胞儀的技術(shù)指標(biāo)

包括：（1）分析速度：很高可以達(dá)到5000個(gè)／s左右，大型的流式細(xì)胞儀的分析速度可達(dá)10000個(gè)／s；（2）熒光檢測靈敏度：單個(gè)細(xì)胞上的熒光分子＜600個(gè)，或兩個(gè)細(xì)胞之間的熒光差＞5％就能區(qū)分；（3）前向角散射光檢測靈敏度：一般的可以檢測到的最小顆粒直徑在0．2～0．5μm；（4）分辨率（CV）：一般流式細(xì)胞儀能夠達(dá)到＜2．0％；（5）分選速度：一般流式細(xì)胞儀分選速度＞100個(gè)／s，分選細(xì)胞純度可達(dá)99％［5］。

3流式細(xì)胞術(shù)在臨床中的應(yīng)用

3．1在血液學(xué)中的應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)通過對(duì)外周血細(xì)胞和骨髓細(xì)胞表面抗原和DNA的檢測分析對(duì)各種血液病如白血病、淋巴瘤等血液系統(tǒng)疾病的分型、診斷、治療及預(yù)后判斷均有重要作用。血細(xì)胞在白細(xì)胞系、紅細(xì)胞系、巨核細(xì)胞系、血小板及非造血細(xì)胞均有不同的分化抗原表達(dá)，分布在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜中。血液腫瘤細(xì)胞的特征是喪失了正常細(xì)胞的系類專一性和分化階段的規(guī)律性，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)將具有系列特異性并涵蓋不同分化階段的單克隆體作為分子探針來檢測血液腫瘤細(xì)胞的內(nèi)外抗原，可以反映其本質(zhì)上與正常造血細(xì)胞的差異［6］。流式細(xì)胞術(shù)采用各種抗血細(xì)胞表面分化抗原的單克隆抗體，借助于各種熒光染料（異硫氰基熒光素FITC，藻紅蛋白PE等）測定一個(gè)細(xì)胞的多種參數(shù)，以正確判斷出該細(xì)胞的屬性。流式細(xì)胞術(shù)還可以應(yīng)用在白血病免疫分型方面，目前國內(nèi)外均主張采用FCMCD45／SSC雙參數(shù)散點(diǎn)圖設(shè)計(jì)方法進(jìn)行白血病免疫分析。采用此法可將骨髓細(xì)胞清晰地分成淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、成熟粒細(xì)胞、幼稚細(xì)胞和有核紅細(xì)胞群，這樣可以排除正常細(xì)胞對(duì)免疫分型的干擾，從而提高免疫分析的準(zhǔn)確性，而且測量細(xì)胞一般在1～5萬個(gè)細(xì)胞，快速特異、準(zhǔn)確性好，并且能夠提供正常細(xì)胞在演變成惡性腫瘤過程細(xì)胞基因及抗原標(biāo)志發(fā)生變化的信息。而這種細(xì)胞的變化是常規(guī)FAB法所不能分辨的。這種分型對(duì)于治療方案的正確選擇與預(yù)后有著重要的意義同時(shí)也提供了可靠的依據(jù)［7］。近年研究發(fā)現(xiàn)，在臨床血液病檢測和診斷中診斷準(zhǔn)確率高達(dá)90％以上，與普通檢測法相比準(zhǔn)確率提高達(dá)20％［8］。流式細(xì)胞術(shù)可以通過某些熒光染料與紅細(xì)胞中的RNA結(jié)合，定量地測定網(wǎng)織紅細(xì)胞中的RNA，得到網(wǎng)織紅細(xì)胞占成熟紅細(xì)胞的百分比，從而準(zhǔn)確地反映骨髓造血功能。有作者報(bào)道FCM方法比目測法結(jié)果精確度更高［9］。此外FCM還可以測出網(wǎng)織紅細(xì)胞的成熟度，對(duì)紅細(xì)胞增值能力的判斷很有意義，為干細(xì)胞移植術(shù)后恢復(fù)的判斷、貧血的治療監(jiān)測、腫瘤患者放化療對(duì)骨髓的抑制狀況等提供依據(jù)。

3．2在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用主要是對(duì)腫瘤細(xì)胞DNA含量進(jìn)行測定，包括癌前病變及早期癌變的檢出，輔助腫瘤的早期診斷和鑒別診斷。不僅如此，還可以根據(jù)化療過程中腫瘤DNA分布直方圖的變化評(píng)估療效，了解細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的變化。臨床醫(yī)生可根據(jù)各細(xì)胞周期各時(shí)相的分布情況，結(jié)合化療藥物對(duì)細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的干擾理論，設(shè)計(jì)最佳治療方案，再依照DNA直方圖直接地看到腫瘤細(xì)胞的殺傷變化，及時(shí)調(diào)整治療方案，選取有效藥物以使對(duì)腫瘤細(xì)胞達(dá)到最大的殺傷效果［10］。

3．3在免疫學(xué)中的應(yīng)用

利用抗原抗體特異性反應(yīng)的原理將流式細(xì)胞儀與單克隆抗體結(jié)合，對(duì)細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)抗原、癌基因蛋白及膜受體進(jìn)行定量檢測，廣泛應(yīng)用于臨床，對(duì)人體細(xì)胞免疫功能的評(píng)估具有重要的意義。流式細(xì)胞術(shù)可進(jìn)行T、B和NK淋巴細(xì)胞水平的分析，還可以進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群的分析，區(qū)分不同的淋巴細(xì)胞亞群，計(jì)算其相互間的比例，進(jìn)而了解淋巴細(xì)胞的分化功能。更重要的是，通過研究大多數(shù)疾病的特異性淋巴細(xì)胞亞群，對(duì)一些疾病如免疫性疾病、感染性疾病、腫瘤等的診斷、治療、免疫功能的重建具有重要的指導(dǎo)意義。例如CD4是輔助性淋巴細(xì)胞，它是遲發(fā)性超敏反應(yīng)的啟動(dòng)者，是促使B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的輔助性細(xì)胞，也是抑制性T細(xì)胞的誘導(dǎo)細(xì)胞，而CD8是抑制性T細(xì)胞，是細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞，是抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的抑制性細(xì)胞［11］。在許多免疫性疾病中，淋巴細(xì)胞亞群的增多與減少對(duì)疾病的發(fā)展具有重要的作用。如在先天性發(fā)育不良綜合征中FCM分析顯示外周血CD3TCD4＋和CD8＋T細(xì)胞均減少，在殘余T細(xì)胞中T細(xì)胞受體（TCR）αβ分子表達(dá)減少，γδ分子表達(dá)正常，CD4＋／CD8＋T細(xì)胞比例升高，隨著受累者年齡的增加CD8＋細(xì)胞數(shù)增多，而有些患者T細(xì)胞數(shù)量增加，最終可達(dá)正常［12］。流式細(xì)胞術(shù)還可以進(jìn)行HLA群體分析，在強(qiáng)直性脊柱炎患者中用流式細(xì)胞術(shù)檢測HLA－B27抗原陽性率高達(dá)92．6％，而且可以排除交叉反應(yīng)，提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性［13］。

3．4在中醫(yī)藥研究方面的應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)可用于單味中藥有效成分的作用效果測定分析。如研究復(fù)方苦參方劑對(duì)大腸癌LoVo細(xì)胞體外增值凋亡的影響中，分析DNA含量及細(xì)胞周期，結(jié)果顯示Lo－Vo細(xì)胞可檢測亞G1峰，凋亡率于對(duì)照組相對(duì)比例增高，細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)S期阻滯現(xiàn)象，表明復(fù)方苦參方劑具有一定的抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用［14］。在慢性阻塞性肺疾病的肺氣虛證、肺陰虛證患者中CD4＋、CD4＋／CD8＋均降低，CD8＋升高，說明肺氣虛證與肺陰虛證患者均存在細(xì)胞免疫功能低下［15］。

3．5在細(xì)菌學(xué)中的應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)具有快速、靈敏、精確并能進(jìn)行多參數(shù)分析的特點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的診斷和藥敏實(shí)驗(yàn)，是研究細(xì)菌異質(zhì)性、細(xì)菌抗生素后效應(yīng)、多種病原菌混合感染等的有效方法。常用的為流式細(xì)胞術(shù)藥敏試驗(yàn)：檢測不同細(xì)菌時(shí)，根據(jù)藥物對(duì)細(xì)菌的作用機(jī)理選擇合適的熒光染料，通過細(xì)菌總體平均熒光強(qiáng)度束反映抗生素對(duì)細(xì)菌的抗菌活性，3h左右即可得出檢測結(jié)果，尤其適用于急需藥敏報(bào)告的重癥感染病菌的檢測。

3．6在血小板疾病診斷中的作用

血小板是止血機(jī)制中一個(gè)重要因素，其表面含有多種糖蛋白及各種受體，這些受體與相應(yīng)的配體相結(jié)合后，血小板被激活，并發(fā)生形態(tài)變化，血小板聚集和顆粒釋放等一系列反應(yīng)。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板標(biāo)志物在許多血小板相關(guān)疾病的診斷上具有重要的臨床價(jià)值［16］。如GPⅠb／Ⅸ復(fù)合物先天缺陷導(dǎo)致巨大血小板綜合征；GPⅡb／Ⅲa復(fù)合物先天缺陷導(dǎo)致血小板無力癥［17］。在免疫性血小板減少性紫癜的患者中，F(xiàn)CM可以測定患者血液中的PAIgG、PAIgM、PAIgA，熒光陽性百分率的診斷效率為45．8％，平均熒光強(qiáng)度的診斷效率為72．5％，兩項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合的診斷效率為74．2％［18］；因此FCM檢測血小板抗體可用于免疫性血小板減少性紫癜的診斷及治療監(jiān)測。用FCM內(nèi)參定位法定量分析血小板微粒在血栓性疾病和血栓前狀態(tài)的發(fā)生發(fā)展中的作用，有利于血栓性疾病的診斷和治療。

3．7在精子相關(guān)疾病檢測中的應(yīng)用

精子質(zhì)量檢測是診斷男性不育癥的重要手段，由于檢測精子數(shù)低及主觀因素的影響，常規(guī)的精液檢查只能反映精子的形態(tài)特征和有限的功能，不能為生育能力提供準(zhǔn)確評(píng)估的依據(jù)，用FCM檢查精液可把定性的描述變成定量的研究，提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，可對(duì)精液進(jìn)行高通量、多參數(shù)分析，得到不同時(shí)期的細(xì)胞數(shù)據(jù)及精子形態(tài)指標(biāo)，對(duì)臨床診斷精子發(fā)生障礙的性質(zhì)、原因和程度提高了客觀依據(jù)，可對(duì)少、弱精子和無精子癥的判斷、治療及療效的觀察作出正確的評(píng)價(jià)，為客觀評(píng)價(jià)男性生育能力提供了有力的依據(jù)。用FCM檢測生精細(xì)胞凋亡情況是迅速、準(zhǔn)確、客觀、可靠地評(píng)估精子功能和男性生育力的新方法［19］。

3．8在器官移植中的作用

可用流式細(xì)胞術(shù)判斷供者與受者之間的配型是否合適。檢測受者血清中抗供者的抗HLA抗體，如果受者血清中存在針對(duì)供者的循環(huán)抗體，就會(huì)同供者的淋巴細(xì)胞結(jié)合，在加入熒光素的二抗來顯示這種結(jié)合，就可在移植前后發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)抗體，以判斷供者與受者之間是否合適。移植后的免疫表型監(jiān)測也很重要，移植后的CD4／CD8比值低下的患者排斥反應(yīng)發(fā)生較多，受者血清中產(chǎn)生抗供體細(xì)胞抗體預(yù)后較差，應(yīng)及時(shí)監(jiān)測以便進(jìn)行抗排斥的預(yù)防和治療［4］。綜上所述，流式細(xì)胞術(shù)是一種在醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)、臨床及科學(xué)研究中具有廣泛應(yīng)用前景的細(xì)胞分析技術(shù)。它具有分辨率高、分辨細(xì)胞數(shù)量大、參數(shù)多、準(zhǔn)確性高、速度快等優(yōu)點(diǎn)。隨著流式細(xì)胞分析技術(shù)與方法的迅速發(fā)展，流式細(xì)胞術(shù)在臨床的應(yīng)用范圍也不斷拓展，并將成為推動(dòng)臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要手段。

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作者：李素芝 單位：天津市安寧醫(yī)院