生物質(zhì)譜技術(shù)與方法精選(九篇)

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第1篇：生物質(zhì)譜技術(shù)與方法范文

關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)，質(zhì)譜分析，應(yīng)用

前言：

蛋白質(zhì)是生物體中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物細胞，約占細胞干質(zhì)量的50%以上，作為生命的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，蛋白質(zhì)在催化生命體內(nèi)各種反應(yīng)進行、調(diào)節(jié)代謝、抵御外來物質(zhì)入侵及控制遺傳信息等方面都起著至關(guān)重要的作用，因此蛋白質(zhì)也是生命科學中極為重要的研究對象。關(guān)于蛋白質(zhì)的分析研究，一直是化學家及生物學家極為關(guān)注的問題，其研究的內(nèi)容主要包括分子量測定，氨基酸鑒定，蛋白質(zhì)序列分析及立體化學分析等。隨著生命科學的發(fā)展，儀器分析手段的更新，尤其是質(zhì)譜分析技術(shù)的不斷成熟，使這一領(lǐng)域的研究發(fā)展迅速。

自約翰.芬恩(JohnB.Fenn)和田中耕一(Koichi.Tanaka)發(fā)明了對生物大分子進行確認和結(jié)構(gòu)分析的方法及發(fā)明了對生物大分子的質(zhì)譜分析法以來，隨著生命科學及生物技術(shù)的迅速發(fā)展，生物質(zhì)譜目前已成為有機質(zhì)譜中最活躍、最富生命力的前沿研究領(lǐng)域之一[1]。它的發(fā)展強有力地推動了人類基因組計劃及其后基因組計劃的提前完成和有力實施。質(zhì)譜法已成為研究生物大分子特別是蛋白質(zhì)研究的主要支撐技術(shù)之一，在對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的研究中占據(jù)了重要地位[2]。

1．質(zhì)譜分析的特點

質(zhì)譜分析用于蛋白質(zhì)等生物活性分子的研究具有如下優(yōu)點：很高的靈敏度能為亞微克級試樣提供信息，能最有效地與色譜聯(lián)用，適用于復雜體系中痕量物質(zhì)的鑒定或結(jié)構(gòu)測定，同時具有準確性、易操作性、快速性及很好的普適性。

2．質(zhì)譜分析的方法

近年來涌現(xiàn)出較成功地用于生物大分子質(zhì)譜分析的軟電離技術(shù)主要有下列幾種：1)電噴霧電離質(zhì)譜；2)基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜；3)快原子轟擊質(zhì)譜；4)離子噴霧電離質(zhì)譜；5)大氣壓電離質(zhì)譜。在這些軟電離技術(shù)中，以前面三種近年來研究得最多，應(yīng)用得也最廣泛[3]。

3．蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析

蛋自質(zhì)是一條或多條肽鏈以特殊方式組合的生物大分子，復雜結(jié)構(gòu)主要包括以肽鏈為基礎(chǔ)的肽鏈線型序列[稱為一級結(jié)構(gòu)]及由肽鏈卷曲折疊而形成三維[稱為二級，三級或四級]結(jié)構(gòu)。目前質(zhì)譜主要測定蛋自質(zhì)一級結(jié)構(gòu)包括分子量、肽鏈氨基酸排序及多肽或二硫鍵數(shù)目和位置。

3.1蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析原理

以往質(zhì)譜(MS)僅用于小分子揮發(fā)物質(zhì)的分析，由于新的離子化技術(shù)的出現(xiàn)，如介質(zhì)輔助的激光解析/離子化、電噴霧離子化，各種新的質(zhì)譜技術(shù)開始用于生物大分子的分析。其原理是：通過電離源將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為氣相離子，然后利用質(zhì)譜分析儀的電場、磁場將具有特定質(zhì)量與電荷比值(M/Z值)的蛋白質(zhì)離子分離開來，經(jīng)過離子檢測器收集分離的離子，確定離子的M/Z值，分析鑒定未知蛋白質(zhì)。

3.2蛋白質(zhì)和肽的序列分析

現(xiàn)代研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)越來越多的小肽同蛋白質(zhì)一樣具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽庫是現(xiàn)在的研究熱點之一。因此需要高效率、高靈敏度的肽和蛋白質(zhì)序列測定方法支持這些研究的進行。現(xiàn)有的肽和蛋白質(zhì)測序方法包括N末端序列測定的化學方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化學降解法等，這些方法都存在一些缺陷。例如作為肽和蛋白質(zhì)序列測定標準方法的N末端氨基酸苯異硫氰酸酯(phenylisothiocyanate)PITC分析法(即Edman法，又稱PTH法)，測序速度較慢(50個氨基酸殘基/天)；樣品用量較大(nmol級或幾十pmol級)；對樣品純度要求很高；對于修飾氨基酸殘基往往會錯誤識別，而對N末端保護的肽鏈則無法測序[4]。C末端化學降解測序法則由于無法找到PITC這樣理想的化學探針，其發(fā)展仍面臨著很大的困難。在這種背景下，質(zhì)譜由于很高的靈敏度、準確性、易操作性、快速性及很好的普適性而倍受科學家的廣泛注意。在質(zhì)譜測序中，靈敏度及準確性隨分子量增大有明顯降低，所以肽的序列分析比蛋白容易許多，許多研究也都是以肽作為分析對象進行的。近年來隨著電噴霧電離質(zhì)譜(electrosprayionisation，ESI)及基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜(matrixassistedlaserdesorption/ionization，MALDI)等質(zhì)譜軟電離技術(shù)的發(fā)展與完善，極性肽分子的分析成為可能，檢測限下降到fmol級別，可測定分子量范圍則高達100000Da，目前基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法(MALDITOFMS)已成為測定生物大分子尤其是蛋白質(zhì)、多肽分子量和一級結(jié)構(gòu)的有效工具，也是當今生命科學領(lǐng)域中重大課題——蛋白質(zhì)組研究所必不可缺的關(guān)鍵技術(shù)之一[5]。目前在歐洲分子生物實驗室(EMBL)及美國、瑞士等國的一些高校已建立了MALDITOFMS蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)(序列)譜庫，能為解析FAST譜圖提供極大的幫助，并為確證分析結(jié)果提供可靠的依據(jù)[6]。

3.3蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析方式

質(zhì)譜用于肽和蛋白質(zhì)的序列測定主要可以分為三種方法：一種方法叫蛋白圖譜(proteinmapping)，即用特異性的酶解或化學水解的方法將蛋白切成小的片段，然后用質(zhì)譜檢測各產(chǎn)物肽分子量，將所得到的肽譜數(shù)據(jù)輸入數(shù)據(jù)庫，搜索與之相對應(yīng)的已知蛋白，從而獲取待測蛋白序列。將蛋白質(zhì)繪制“肽圖”是一重要測列方法。第二種方法是利用待測分子在電離及飛行過程中產(chǎn)生的亞穩(wěn)離子，通過分析相鄰同組類型峰的質(zhì)量差，識別相應(yīng)的氨基酸殘基，其中亞穩(wěn)離子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用誘導碎裂.第三種方法與Edman法有相似之處，即用化學探針或酶解使蛋白或肽從N端或C端逐一降解下氨基酸殘基，形成相互間差一個氨基酸殘基的系列肽，名為梯狀測序(laddersequencing)，經(jīng)質(zhì)譜檢測，由相鄰峰的質(zhì)量差知道相應(yīng)氨基酸殘基。

3.3.1蛋白消化

蛋白的基團越大，質(zhì)譜檢測的準確率越低。因此，在質(zhì)譜檢測之前，須將蛋白消化成小分子的多肽，以提高質(zhì)譜檢測的準確率。一般而言，6-20個氨基酸的多肽最適合質(zhì)譜儀的檢測?，F(xiàn)今最常用的酶為胰蛋白酶(trypsin)，它于蛋白的賴氨酸(lysine)和精氨酸(arginine)處將其切斷。因此，同一蛋白經(jīng)胰蛋白酶消化后，會產(chǎn)生相同的多肽。

3.3.2基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時間質(zhì)譜測量法(MALDI-TOFMS)[7]

簡而言之，基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時間質(zhì)譜測量儀是將多肽成分轉(zhuǎn)換成離子信號，并依據(jù)質(zhì)量/電荷之比(mass/charge，m/z)來對該多肽進行分析，以判斷該多肽源自哪一個蛋白。待檢樣品與含有在特定波長下吸光的發(fā)光團的化學基質(zhì)(matrix)混合，此樣品混合物隨即滴于一平板或載玻片上進行揮發(fā)，樣品混合物殘余水份和溶劑的揮發(fā)使樣品整合于格狀晶體中，樣品然后置于激光離子發(fā)生器(lasersource)。激光作用于樣品混合物，使化學基質(zhì)吸收光子而被激活。此激活產(chǎn)生的能量作用于多肽，使之由固態(tài)樣品混合物變成氣態(tài)。由于多肽分子傾向于吸收單一光子，故多肽離子帶單一電荷.這些形成的多肽離子直接進入飛行時間質(zhì)量分析儀(TOFmassanalyzer)。飛行時間質(zhì)量分析儀用于測量多肽離子由分析儀的一端飛抵另一端探測器所需要的時間。而此飛行時間同多肽離子的質(zhì)量/電荷的比值成反比，即質(zhì)量/電荷之比越高，飛行時間越短。最后，由電腦軟件將探測器錄得的多肽質(zhì)量/電荷比值同數(shù)據(jù)庫中不同蛋白經(jīng)蛋白酶消化后所形成的特定多肽的質(zhì)量/電荷比值進行比較，以鑒定該多肽源自何種蛋白.此法稱為多肽質(zhì)量指紋分析(peptidemassfin-gerprinting)?；|(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時間質(zhì)譜測量法操作簡便，敏感度高，同許多蛋白分離方法相匹配，而且，現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中有充足的關(guān)于多肽質(zhì)量/電荷比值的數(shù)據(jù)，因此成為許多實驗室的首選蛋白質(zhì)譜鑒定方法。

3.3.3電子噴霧電離質(zhì)譜測量法(electrosprayion-izationmassspectrometry,ESI-MS)[8]

同基質(zhì)輔助激光解吸電離/飛行時間質(zhì)譜測量法在固態(tài)下完成不同，電子噴霧電離質(zhì)譜測量法是在液態(tài)下完成，而且多肽離子帶有多個電荷，由高效液相層析等方法分離的液體多肽混合物，在高壓下經(jīng)過一細針孔。當樣本由針孔射出時，噴射成霧狀的細小液滴，這些細小液滴包含多肽離子及水份等其他雜質(zhì)成分。去除這些雜質(zhì)成分后，多肽離子進入連續(xù)質(zhì)量分析儀(tan-demmassanalyzer)，連續(xù)質(zhì)量分析儀選取某一特定質(zhì)量/電荷比值的多肽離子，并以碰撞解離的方式將多肽離子碎裂成不同電離或非電離片段。隨后，依質(zhì)量/電荷比值對電離片段進行分析并匯集成離子譜(ionspectrum)，通過數(shù)據(jù)庫檢索，由這些離子譜得到該多肽的氨基酸序列。依據(jù)氨基酸序列進行的蛋白鑒定較依據(jù)多肽質(zhì)量指紋進行的蛋白鑒定更準確、可靠。而且，氨基酸序列信息即可通過蛋白氨基酸序列數(shù)據(jù)庫檢索，也可通過核糖核酸數(shù)據(jù)庫檢索來進行蛋白鑒定。

4．蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析的應(yīng)用

1981年首先采用FAB雙聚焦質(zhì)譜測定肽分子量，分析十一肽(Mr=1318)，質(zhì)譜中出現(xiàn)準分子離子[M+1]+=1319強峰。分子量小于6kDa肽或小蛋白質(zhì)合適用FAB質(zhì)譜分析，更大分子量的多肽和蛋自質(zhì)可用MALDI質(zhì)譜或ESI質(zhì)譜分析。用MALDI-TOF質(zhì)譜分析蛋自質(zhì)最早一例是HillenKramp等[9]于1988年提出用紫外激光以煙酸為基質(zhì)在TOF譜儀上測出質(zhì)量數(shù)高達60kDa蛋白質(zhì)，精確度開始只有0.5%，后改進到0.1-0.2%。質(zhì)譜技術(shù)主要用于檢測雙向凝膠電泳或“雙向”高效柱層析分離所得的蛋白質(zhì)及酶解所得的多肽的質(zhì)量，也可用于蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)間相互作用等方面的研究[10,11],三條肽段的精確質(zhì)量數(shù)便可鑒定蛋白質(zhì)。近年來，串聯(lián)質(zhì)譜分析儀發(fā)展迅猛，其數(shù)據(jù)采集方面的自動化程度、檢測的敏感性及效率都大大提高，大規(guī)模數(shù)據(jù)庫和一些分析軟件(如:SEQUEST)的應(yīng)用使得串聯(lián)質(zhì)譜分析儀可以進行更大規(guī)模的測序工作。目前，利用2D電泳及MS技術(shù)對整個酵母細胞裂解產(chǎn)物進行分析，已經(jīng)鑒定出1484種蛋白質(zhì)，包括完整的膜蛋白和低豐度的蛋白質(zhì)[12]；分析肝細胞癌患者血清蛋白質(zhì)組成分[13]，并利用質(zhì)譜進行鑒定磷酸化蛋白研究工作[14]及采用質(zhì)譜技術(shù)研究許旺細胞源神經(jīng)營養(yǎng)蛋白(SDNP)的分子結(jié)構(gòu)[15]等。

結(jié)束語：

在蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析中，質(zhì)譜的準確性(accuracy)對測定結(jié)果有很大影響，因此質(zhì)譜測序現(xiàn)在仍很難被應(yīng)用于未知蛋白的序列測定。肽和蛋白的質(zhì)譜序列測定方法具有快速、用量少、易操作等優(yōu)點，這些都非常適合于現(xiàn)在科學研究的需要。我們相信，隨著各種衍生化方法和酶解方法的不斷改進，蛋白雙向電泳的應(yīng)用[16]以及質(zhì)譜技術(shù)的不斷完善，質(zhì)譜將會成為多肽和蛋白質(zhì)分析最有威力的工具之一。

參考文獻

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第2篇：生物質(zhì)譜技術(shù)與方法范文

【摘要】 脂質(zhì)的生物功能具有多樣性，其代謝與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。脂質(zhì)的分析量化對研究疾病發(fā)生機理和診斷治療，以及醫(yī)藥研發(fā)有非常重要的生物學意義。分析技術(shù)的快速發(fā)展，特別是質(zhì)譜及其聯(lián)用技術(shù)的運用，促使脂質(zhì)分析不斷完善。脂組學就是對生物樣本中脂質(zhì)的整體分析，是代謝組學的重要組成部分，能夠促進代謝組學的發(fā)展。本文就脂質(zhì)的生物功能、脂質(zhì)分析以及脂組學的研究現(xiàn)狀作簡要評述。

【關(guān)鍵詞】 脂組學，脂質(zhì)分析，電噴霧離子化質(zhì)譜，代謝組學，評述

1 引 言

脂類物質(zhì)是生物體的能量提供者，參與了大量的生命活動，具有非常重要的生理功能。脂質(zhì)分子在與其它化合物的相互作用，構(gòu)成了復雜的代謝過程，對生物體疾病的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生重要影響。據(jù)報道，很多疾病都與脂代謝紊亂有關(guān)，如：糖尿病、肥胖病、老年癡呆癥、癌癥等[1～6]。因此，生命體中脂類物質(zhì)及其代謝過程的研究成為疾病發(fā)病機理和診斷治療以及醫(yī)藥研發(fā)過程的重點。為了得到生物樣本中更為全面的脂質(zhì)信息，更好地反映生物體內(nèi)脂類物質(zhì)的作用機制，并能找到與疾病相關(guān)的生物標志物或代謝規(guī)律，為疾病的治療提供科學依據(jù)，科學家已經(jīng)將脂質(zhì)的整體分析做為了研究的重點。

隨著生命分析化學的發(fā)展，電噴霧離子化質(zhì)譜(ESIMS)成功地運用到脂質(zhì)的分析，特別是色譜質(zhì)譜技術(shù)的聯(lián)用，為脂質(zhì)的整體分析提供了技術(shù)支持，也加速了脂組學的誕生。2003年，Han等[7]正式提出了脂組學(Lipidomics) 的概念，即對生物樣本中脂質(zhì)進行全面的系統(tǒng)分析，并以此為依據(jù)推測其它與脂質(zhì)作用的生物分子的變化，進而揭示脂質(zhì)在各種生命現(xiàn)象中的重要作用機制。上世紀90年代興起的代謝組學，是以分析生命體中的所有小分子代謝物為研究內(nèi)容的。對脂質(zhì)及其代謝物進行整體分析的脂組學，則可以看作是代謝組學的一個分支，并能夠在一定程度上促進代謝組學的發(fā)展。

目前，脂組學已經(jīng)受到越來越多科研機構(gòu)的關(guān)注[8]，其中以美國的研究機構(gòu)最為著名：美國國立綜合醫(yī)學研究所(National lnstitute of general medical sciences， NIGMS)、由王學敏教授領(lǐng)導組建的堪薩斯州立大學脂組學研究中心(Kansas lipdomics research center，KLRC) 和華盛頓大學的ORY課題組;歐洲和亞洲也同樣出現(xiàn)了脂組學的研究機構(gòu)：格拉茨大學、奧地利科學院及格拉茨技術(shù)大學等共同成立了格拉茨脂組學研究中心(Lipidomics research center graz，LRCGraz);新加坡國立大學Wenk教授也成立了Lipid Profile課題組。此外，還有很多課題組致力于脂組學與代謝組學的研究。

可見，脂組學的研究已經(jīng)成為眾多科研機構(gòu)研究的熱點。本文就脂組學的研究現(xiàn)狀作簡要評述，并通過了解脂組學與代謝組學等其它組學的關(guān)系，對脂組學的發(fā)展前景進行了展望。

2 脂的分類與生物功能

脂質(zhì)在化學組成和結(jié)構(gòu)上有很大差異，但都有一個共同特性，即：不溶于水而易溶于乙醚、氯仿等非極性溶劑。脂質(zhì)通常分為真脂和類脂兩大類 (如圖解1所示)。脂質(zhì)是組成生物體的重要成分，如磷脂是構(gòu)成生物膜的重要組分，油脂是機體代謝所需燃料的貯存和運輸載體。脂類物質(zhì)也可為動物機體提供必需的脂肪酸和脂溶性維生素。某些萜類及類固醇類物質(zhì)如維生素A，D，E，K，膽酸及類固醇激素具有營養(yǎng)、代謝及調(diào)節(jié)功能。有機體表面的脂類物質(zhì)有防止機械損傷與熱量散發(fā)等保護作用。脂類作為細胞的表面物質(zhì)，與細胞識別、種特異性和組織免疫等有密切關(guān)系。對脂質(zhì)進行分析時應(yīng)充分了解其化學組成和結(jié)構(gòu)特點，從而確定樣本分析的色譜分離條件和質(zhì)譜條件。

3 脂組學及其研究現(xiàn)狀

3.1 脂組學的研究內(nèi)容及特點

脂組學的研究內(nèi)容為生物體內(nèi)的所有脂質(zhì)分子，并以此為依據(jù)推測與脂質(zhì)作用的生物分子的變化，揭示脂質(zhì)在各種生命活動中的重要作用機制[7～10]。通過研究脂質(zhì)提取物， 可獲得脂質(zhì)組 (Lipidome)的信息，了解在特定生理狀態(tài)下脂質(zhì)的整體變化。脂組學是代謝組學不可或缺的一部分。脂組學的研究有以下優(yōu)勢：只研究脂質(zhì)物質(zhì)及其代謝物，脂質(zhì)物質(zhì)在結(jié)構(gòu)上的共同點決定了樣品前處理及分析技術(shù)平臺的搭建較為容易，而且可以借鑒代謝組學的研究方法;脂組學數(shù)據(jù)庫的建立和完善速度較快，并能建立與其它組學的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系;脂質(zhì)組分析的技術(shù)平臺可用于代謝組學的研究，促進代謝組學發(fā)展。

3.2 脂組學的研究方法

3.2.1 樣品制備 脂質(zhì)主要從細胞、血漿、組織等樣品中提取。由于脂質(zhì)物質(zhì)在結(jié)構(gòu)上有共同特點，即有極性的頭部和非極性的尾部。所以，脂質(zhì)采用了氯仿和甲醇的混合提取液，能夠更好地溶出樣本中的脂質(zhì)物質(zhì)。Yoo 等[11]將 3 mL的氯仿/甲醇 (1∶2， V/V) 加入 4 mL的細胞懸浮液，然后加入 0.8 mL水，超聲 0.5 min，再加入 1 mL氯仿和 1 mL水后 2000×g 離心 5 min，室溫靜置 30 min，取氯仿層，氮氣吹干，進樣前采用流動相溶解干物待用。這種脂質(zhì)提取方法，能夠提出血漿、腦組織樣品中的總脂[1， 12]。Matyash 等[13]用甲基叔丁酰乙醚(methyltertbutyl ether， MTBE)提取樣品中的脂質(zhì)物質(zhì)。這種方法簡化了富集過程，降低了損失率，不溶于MTBE的雜質(zhì)在容器底部形成小球，容易離心去除。結(jié)果表明，用MTBE提取比脂質(zhì)提取的“金標準”—— Folch or bligh and dyer recipes效果更好。

對于只檢測總脂中的部分脂質(zhì)，固相萃取(SPE) 是一個較好的方法。Persson等[14]發(fā)展了利用C18柱和硅膠柱分離萃取腸液中磷脂、中性脂等包含游離脂肪酸的方法。譚力等[15]采用硅膠固相萃取柱萃取可以在短時間內(nèi)連續(xù)處理較多數(shù)量的樣品，操作簡單，重復性好。

3.2.2 脂質(zhì)的檢測方法 隨著分析技術(shù)的不斷發(fā)展，脂類的分析方法也在不斷的改進?？傮w而言，大部分的分析技術(shù)都能用來分析脂質(zhì)，包括：脂肪酸、磷脂、神經(jīng)鞘磷脂、甘油三酯和類固醇等。常規(guī)的薄層色譜(Thin layer chromatography， TLC)已被分辨率更好的色譜技術(shù)所取代。與其它研究方法相比，ESI/MS方法有其自身的特點：樣品前處理簡單、分辨率高、容易實現(xiàn)自動化，適合對脂質(zhì)混合物(尤其是磷脂混合物)進行快速、靈敏和高通量的定性定量研究[8， 16，17]。色質(zhì)聯(lián)用的引入極大地推動了脂組學的發(fā)展，其中的核心技術(shù)就是ESI/MS，加上色譜等技術(shù)對樣品中脂質(zhì)分離的強化，實現(xiàn)了脂質(zhì)分離鑒定的高通量、高靈敏度和高效率。多維的質(zhì)譜技術(shù)在脂組學的研究中也取得了新的進展[18]。

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GCMS) 適合檢測分子量小于500 Da的所有種類脂質(zhì)分子。利用GCTOF技術(shù)平臺中的BinBase 和 SetupX，能夠一次性得到800種脂質(zhì)類化合物中的80種物質(zhì)的半定量結(jié)果，并可根據(jù)FiehnLib的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫驗證結(jié)果的可靠性[19]。

用于脂質(zhì)分析的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)主要包括：高效液相色譜芯片質(zhì)譜聯(lián)用 (High performance liquid chromatographychip/Mass spectrum， HPLCChip/MS)，超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用 (Ultraperformance liquid chromatographyMass spectrum， UPLC/MS)，超高效液相色譜質(zhì)傅立葉變換質(zhì)譜聯(lián)用(Ultraperformance liquid chromatography/fourier transformMass spectrum， UPLC/FTMS)，液相色譜飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用(Liquid ChromatographyTime of Flight/Mass Spectrum， LCTOF/MS)。質(zhì)荷比為100～2000的脂質(zhì)輪廓都可以通過液質(zhì)聯(lián)用方法得到。色譜技術(shù)可以使血漿或組織樣品中的干擾得到較好地分離，但會延長分析時間，并對流動相有一定要求。Pang等[1]建立了正相液相色譜/飛行時間質(zhì)譜分析血漿中腦磷脂(Glycerophosphoehtanolamine， PE)， 磷脂酰甘油(Phosphatidylglycerol， PG)， 磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol， PI)， 磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine， PS)， 磷酸卵磷酯 (Phosphatidylcholine， PC)， 鞘磷脂 (Sphingomyelin， SM) 和 溶血磷脂膽堿 (Lyso phosphatidylcholine， LysoPC)等7大類磷脂的方法，定量分析正常人、糖尿病、糖尿病和腎病不同分期患者血漿樣品中7類磷脂，并發(fā)現(xiàn)了7類磷脂在糖尿病和腎病患者不同分期階段的變化規(guī)律，為糖尿病和腎病患者磷脂代謝研究提供了有效可靠的辦法。

nano ESIFT/MS是基于芯片技術(shù)的電噴霧傅立葉轉(zhuǎn)換質(zhì)譜(Nano electrospray fourier transform/Mass spectrum)，用于脂質(zhì)的快速分類、半定量、結(jié)構(gòu)鑒定以及脂質(zhì)指紋圖譜的建立。利用NanoMate 芯片與高分辨率的傅立葉變換質(zhì)譜FTMS或Orbitrap 技術(shù)可以在1 min內(nèi)快速得到血漿和組織 (植物、人類、細菌等) 的粗提物中脂質(zhì)的輪廓。Kraft等[20]建立了nano ESIFT MS對脂膜進行分析的新方法，能在納米水平上測定膜上不同脂質(zhì)的分布，從而獲得“脂質(zhì)膜相結(jié)構(gòu)”的信息。大多數(shù)膜的脂質(zhì)分子組成是類似的，平均只有20%的偏差。這種差別是由膜上脂質(zhì)分子的分類機制決定的。Schneiter等[21]利用nanoESIMS/MS研究了釀酒酵母膜的脂質(zhì)分子組成，發(fā)現(xiàn)基于?；湻诸悪C制維持了酵母細胞膜脂質(zhì)分子種類的組成。Holz等[22]同時定性和定量了視網(wǎng)膜色素細胞中的脂褐素(Lipofuscin， LF)，定量結(jié)果表明，LF的含量隨著年齡的增長與視網(wǎng)膜病情的嚴重程度升高，脂質(zhì)分子組成的改變會影響脂質(zhì)代謝以及脂質(zhì)物質(zhì)整體的深層變化。該方法為視網(wǎng)膜疾病發(fā)病機制的研究提供了重要的技術(shù)支持。

3.2.3 脂組學研究的相關(guān)數(shù)據(jù)庫 隨著脂組學的迅速發(fā)展過程，相關(guān)數(shù)據(jù)庫也逐步建立。現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫能夠查詢脂質(zhì)物質(zhì)結(jié)構(gòu)、質(zhì)譜信息、分類及實驗設(shè)計、實驗信息等，其功能也越來越完善。數(shù)據(jù)庫的建立無疑成為推動脂組學自身發(fā)展的良好工具。最大的數(shù)據(jù)庫LIPID Maps，是由美國國立綜合醫(yī)學研究機構(gòu)(National institute of general medical sciences， NIGMS)組織構(gòu)建的。它包含了脂質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)信息、質(zhì)譜信息、分類信息、實驗設(shè)計等。數(shù)據(jù)庫中除了游離脂肪酸、膽固醇、甘油三酯、磷脂等8000余種單一脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息外，還包括了81個大類、276個亞類脂質(zhì)化合物的結(jié)構(gòu)信息。除此之外，不少國家和科研團隊也建立了自己的數(shù)據(jù)庫 (脂組學數(shù)據(jù)庫如表1所示)。表1 脂組學研究應(yīng)用的數(shù)據(jù)庫

3.3 脂組學的研究現(xiàn)狀

3.3.1 脂組學在醫(yī)藥研發(fā)中的應(yīng)用 近年來，研究者對脂質(zhì)的研究興趣重新被激活，質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用也使脂組學的發(fā)展日趨迅猛。脂質(zhì)是生物事件從膜運輸?shù)酱x信號最基本的因子。脂質(zhì)代謝的擾動與代謝紊亂和疾病的發(fā)展密切相關(guān)[6]。由于這些擾動可能發(fā)生在分子水平，全面解決復雜脂質(zhì)的量化問題變得非常必要。隨著液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的不斷發(fā)展，基于四級桿飛行時間雜交質(zhì)譜儀 (QSTAR Pulsar) 的鳥槍脂組學已使復雜分子構(gòu)成的脂質(zhì)的同時定性與定量分析成為可能[23～25]。Ejsing等[26]得到了微量樣本的總脂提取物中數(shù)百種脂質(zhì)分子的定量輪廓。這一成果在實驗室研究和制藥行業(yè)中，特別是在生物標志物和藥物發(fā)現(xiàn)過程領(lǐng)域引起了極大的興趣，更高通量的實驗結(jié)果是可以預(yù)見的。高通量、半自動化的方法學的新發(fā)展已經(jīng)開始傾向于鳥槍脂組學的研究。機器人輔助樣本制備顯著提高了數(shù)據(jù)自動解釋的效率，并能夠在數(shù)據(jù)質(zhì)量沒有任何損失的情況下完成大量樣本的分析。隨著鳥槍脂組學的不斷發(fā)展，豐度相當小的脂質(zhì)分子的定量測定也是可以實現(xiàn)的。更多的脂質(zhì)輪廓的建立會加強磷脂在細胞膜和代謝功能障礙殊作用的解釋。這將有利于發(fā)現(xiàn)具有更好選擇性和非毒性的藥物靶點。Su等[2]發(fā)現(xiàn)糖尿病鼠心肌細胞內(nèi)鈣不依賴性磷脂酶A2(iPLA2)的表達對心肌缺血或心律不齊有重要影響。通過模擬和優(yōu)化與iPLA2特異結(jié)合的脂質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，有望找到一種有效的以iPLA2為靶蛋白的治療糖尿病、心肌炎的新藥。脂組學還能作為評價藥物療效的一個輔助手段。Huang等[27， 28]研究了甲基硝基亞硝基肌(NmethylNnitroNnitrosoguanidine， MNNG) 對SM的作用，發(fā)現(xiàn)MNNG不但能引起SM代謝的變化，而且SM代謝相關(guān)的關(guān)鍵酶——酸性鞘磷脂酶出現(xiàn)由分散到集中于脂筏的趨勢。因此，逆轉(zhuǎn)脂代謝紊亂有利于疾病的治療，監(jiān)測藥物作用后機體內(nèi)脂代謝變化情況，及時反應(yīng)機體生理生化狀態(tài)的改變，有助于評價藥物的藥效及確定可能的副作用。

目前所面臨的挑戰(zhàn)則是精確找到脂質(zhì)分子結(jié)構(gòu)定義上的作用位點，精確指定每個不飽和脂肪酸雙鍵的位置，并對這些脂質(zhì)進行高通量的量化。Thomas等[29]證實臭氧誘導解離技術(shù) (Ozoneinduced dissociation technology， OzID) 與鳥槍脂組學的整合應(yīng)用是非常有前途的。因此，高通量的鳥槍脂組學具有巨大的潛力，并會在細胞生物學、分子醫(yī)學、藥物發(fā)現(xiàn)和生物標志物的診斷方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。

3.3.2 脂生物標志物的發(fā)現(xiàn) 隨著分析技術(shù)的不斷進步，有關(guān)低豐度的脂質(zhì)分子分析與量化的方法已多有報道。運用這些方法，代謝綜合癥和其它脂質(zhì)相關(guān)的疾病的生化機制得到明確闡釋。更重要的是，對疾病發(fā)生發(fā)展過程中脂質(zhì)生物標志物的發(fā)現(xiàn)有重要意義[30]。Brugger等[31]借助質(zhì)譜方法詳細分析了HIV與其宿主的膜脂組的差異，發(fā)現(xiàn)病毒富集二氫鞘磷脂(Dihydrosphingomyelin)，而且當抑制宿主細胞的鞘脂質(zhì)合成途徑后，傳染率明顯下降，由此推斷這類脂質(zhì)在HIV復制循環(huán)中起關(guān)鍵作用。通過系統(tǒng)研究病原體的脂質(zhì)組，還能有效地確定在宿主病原體交互作用時起作用的脂質(zhì)，進而找到相關(guān)的致病途徑。Han等[32]運用脂質(zhì)組學方法分析糖尿病鼠心肌線粒體膜脂急劇減少的細節(jié)，指出心肌磷脂及其直接的代謝前體(Phosphatidylglycerol， PG) 在糖尿病人并發(fā)心肌病時起關(guān)鍵作用，并以此為依據(jù)，提出了糖尿病心肌病在發(fā)病學上的一種可能代謝紊亂機制。

3.3.3 脂組學在疾病診斷中的應(yīng)用 發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)的診斷指標是進行疾病診斷的關(guān)鍵。脂組學所提供的方法能夠監(jiān)測疾病患者與正常人之間的脂質(zhì)的變化，從其中找到差異較大的脂質(zhì)化合物，作為疾病早期診斷的指標。Gadomska等[33]定量研究了4例健康的年紀相符的女性、64例卵巢癌患者和27例良性卵巢腫瘤患者血清中各種膽固醇及脂蛋白的含量變化。結(jié)果表明：以載脂蛋白AI (aPoAI) 和游離膽固醇 (FC) 為診斷指標排除卵巢瘤的正確率高達95.5%，綜合aPoAI，F(xiàn)C，高密度脂蛋白游離膽固醇 (HDLFC)、高密度脂蛋白總膽固醇 (HDLTC)、載脂蛋白B (aPoB) 及高密度脂蛋白3 (HDL3) 片斷診斷卵巢癌的準確率達到97%。另有研究報道溶血磷脂酸在卵巢癌的診斷中表現(xiàn)出高度的敏感性和特異性，能夠作為早期診斷卵巢癌及術(shù)后隨訪的生物學指標[34]。

4 脂組學與代謝組學的關(guān)系

代謝組學與蛋白組學、基因組學和轉(zhuǎn)錄組學相互關(guān)聯(lián)共同組成整體的系統(tǒng)生物學。組學的研究是以物質(zhì)組為基礎(chǔ)的研究，是考察“系統(tǒng)”與“系統(tǒng)”的相互作用[35]。代謝組學則是研究生物體內(nèi)所有小分子代謝產(chǎn)物的一門學科，現(xiàn)在已經(jīng)派生出了糖組學、毒素組學和其它一些以單一化學物質(zhì)組為研究對象的分支，脂組學也是其中的成員之一 (如圖解2所示)。脂組學通過研究脂質(zhì)提取物，可以獲得脂質(zhì)組(Lipidome) 的信息，它反映了在特定生理狀態(tài)下脂質(zhì)的整體變化。研究生物體在正常狀態(tài)和疾病狀態(tài)下脂代謝的整體差異，識別疾病脂生物標志物，結(jié)合相關(guān)酶的研究，就有可能深入地研究代謝途徑或致病機制，最終發(fā)展出有效的診斷和治療手段。

Scheme 2 Relationship between lipidomics and metabonomics代謝物是生理活動中基因水平和蛋白質(zhì)水平調(diào)控的終端體現(xiàn)。因此，脂組學作為代謝組學的分支能與基因組學及蛋白質(zhì)組學相互結(jié)合， 對生物現(xiàn)象進行不同層次的分析，加深對生命本質(zhì)的了解。脂組學可以借鑒代謝組學技術(shù)的整合運用[36]，增加脂質(zhì)分析中的信息含量，通過多維的數(shù)據(jù)處理，建立其與蛋白質(zhì)組學、基因組學的數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。van Helemond等[37]結(jié)合蛋白質(zhì)組學和脂組學對血吸蟲外殼膜的成分進行分析，確定了血吸蟲在進行養(yǎng)分攝取和免疫逃避時起作用的外殼上的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)血吸蟲外殼富集宿主缺乏的脂質(zhì)，而且外殼上富集的蛋白質(zhì)也與數(shù)據(jù)庫內(nèi)其它物種表現(xiàn)的蛋白質(zhì)不同，這意味著可能是這些特殊的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)造成了外殼的獨特功能。但是，研究這些特殊蛋白的功能特征依然存在很大的挑戰(zhàn)，需要借助基因組學中的RNAi “擊倒” (RNAinterference“knock down”)技術(shù)[38， 39]，對其進行表型鑒定，從而闡釋特異蛋白和脂質(zhì)的功能。因此，脂組學、蛋白質(zhì)組學、基因組學的結(jié)合能夠更好地闡釋化合物在生物體內(nèi)的功能及作用機制。

5 展 望

脂組學自誕生以來發(fā)展迅猛，已經(jīng)在細胞生物學、疾病診斷、疾病生物標志物的發(fā)現(xiàn)及醫(yī)藥研發(fā)等方面取得了相應(yīng)的進展。但由于起步晚，其仍處于一個早期發(fā)展階段，存在許多機遇和挑戰(zhàn)。由于脂質(zhì)種類繁多，相互作用復雜，現(xiàn)有的分析技術(shù)不能同時將生物樣本中的脂質(zhì)完全檢測出來。但是，脂組學所表現(xiàn)出來的巨大潛力不容忽視，特別是鳥槍脂組學的迅猛發(fā)展，加快了復雜脂質(zhì)分子的定性和高通量量化等問題的解決。隨著分析技術(shù)的不斷發(fā)展，脂質(zhì)分析會登上一個新的臺階，人們對脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)及作用機制的認識將逐步加深，也將為遺傳和細胞生物學發(fā)現(xiàn)新的脂質(zhì)分子的作用機制提供可能的手段。此外，脂組學數(shù)據(jù)庫的建立和完善對脂組學的研究將起到非常大的促進作用。

近年來，代謝組學、蛋白質(zhì)組學、基因組學等技術(shù)的不斷發(fā)展對脂組學的研究起到了積極的帶動作用。脂組學與其它組學的整合不但為生物體中脂脂、脂蛋白質(zhì)及相關(guān)基因調(diào)控的相互作用提供數(shù)據(jù)支持，不斷完善著生物體的代謝網(wǎng)絡(luò)，為尋找致病機制及與其相關(guān)的潛在生物標志物提供新的手段，也為毒理學研究提供嶄新視角?？梢哉f，脂組學與蛋白組學、基因組學的整合運用將增加脂質(zhì)研究的數(shù)據(jù)信息，為藥物研發(fā)、發(fā)現(xiàn)生物標志物的臨床前和早期臨床階段了解脂質(zhì)功能提供了新的契機[40]。要充分發(fā)揮代謝組學研究的優(yōu)勢，從脂代謝水平研究疾病的發(fā)生、發(fā)展過程的變化規(guī)律，尋找疾病相關(guān)的脂生物標志物，進一步提高疾病的診斷效率，并為疾病的治療提供更為可靠的依據(jù)。脂組學能夠在一定程度上促進代謝組學的發(fā)展，并通過代謝組學技術(shù)的整合運用建立與其它組學之間的關(guān)系，最終實現(xiàn)系統(tǒng)生物學的整體進步。

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第3篇：生物質(zhì)譜技術(shù)與方法范文

關(guān)鍵詞超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜法；生物胺類神經(jīng)化學物質(zhì)；氨基酸類神經(jīng)化學物質(zhì)；腦組織

1引言

神經(jīng)遞質(zhì)（Neurotransmitter）在神經(jīng)化學傳遞中是充當“信使”的特定化學物質(zhì)。腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)分為4類，即生物胺類、氨基酸類、肽類和其它類。隨著神經(jīng)生物學的發(fā)展，陸續(xù)在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)了大量具有神經(jīng)活性的物質(zhì)。生物胺類遞質(zhì)是最先發(fā)現(xiàn)的一類神經(jīng)遞質(zhì)，包括多巴胺（DA）、去甲腎上腺素（NE）、腎上腺素（E）、5羥色胺（5HT）。酪氨酸（Tyr）是DA、NE和E的前體，色氨酸（Try）是5HT的前體，在多種應(yīng)激情況下，維持正常的生物胺類遞質(zhì)代謝和腦功能的發(fā)揮。5羥吲哚乙酸（5HIAA）是5HT代謝的產(chǎn)物，5HIAA的變化也可間接反應(yīng)5HT的變化。褪黑激素（Melatonin）主要是由哺乳動物和人類的松果體產(chǎn)生的一種胺類激素，5HT在N乙?；D(zhuǎn)移酶的作用下，轉(zhuǎn)化成N乙酰基5羥色胺，最后合成Melatonin。生物胺類神經(jīng)化學物質(zhì)在人體和哺乳動物的中樞神經(jīng)、心血管和內(nèi)分泌等組織系統(tǒng)中發(fā)揮著廣泛的調(diào)節(jié)作用，參與情緒、情感、應(yīng)激行為和睡眠覺醒等多種生理過程[1＼]，含量的變化與人類多種疾病密切相關(guān)，是診斷阿爾茨海默癥、唐氏綜合征、抑郁癥和帕金森等疾病的重要依據(jù)[2～5＼]。組胺（Histamine）是一種活性胺化合物，作為身體內(nèi)的一種化學傳導物質(zhì)，可以影響許多細胞的反應(yīng)，中樞組胺能神經(jīng)系統(tǒng)影響腦部神經(jīng)傳導，參與睡眠、荷爾蒙的分泌、體溫調(diào)節(jié)、食欲與記憶形成等功能[6＼]。乙酰膽堿（Ach）是中械堿能系統(tǒng)中重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一，其主要功能是維持意識的清醒，在學習記憶中起重要作用。被確定為神經(jīng)遞質(zhì)的氨基酸有γ氨基丁酸（GABA）、甘氨酸（Gly）、谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）、牛磺酸（Tau）和絲氨酸（Ser）[7＼]。谷氨酰胺（Gln）作為大腦的一種能量來源，具有保護大腦的功能，能改善心情、增強智力，并有益于長期與短期記憶[8，9＼]。氨基酸類神經(jīng)化學物質(zhì)對于調(diào)節(jié)機體生理活動具有重要作用，其含量及比例的變化與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[2～5，10＼]。因此，生物樣品中生物胺類及氨基酸類神經(jīng)化學物質(zhì)的準確測定對于某些疾病的篩查、診斷和治療以及藥物在體內(nèi)的作用具有重要意義。

神經(jīng)化學物質(zhì)在生物樣品中的含量很低，而生物樣品本身基體復雜，內(nèi)源性干擾物質(zhì)較多，因此高效快速的樣品前處理方法和高靈敏度的檢測手段是開展神經(jīng)化學物質(zhì)研究的難點。采用高效液相色譜分離，再以紫外、熒光、電化學和質(zhì)譜方法檢測，是測定神經(jīng)化學物質(zhì)較常用的方法[11～21＼]。由于氨基酸無紫外吸收，用液相色譜法進行檢測時需對氨基酸進行柱前或柱后衍生[16～20＼]。生物胺類神經(jīng)化學物質(zhì)為強極性化合物，在反相色譜柱上保留極弱，對熒光和質(zhì)譜的響應(yīng)信號較弱，可通過衍生化處理改善色譜保留行為和離子化效率[16～19，21＼]。但衍生操作步驟繁瑣，耗時耗力，而且衍生程度也難以保證，JP衍生反應(yīng)還可能生成非目標衍生物，這些對神經(jīng)化學物質(zhì)的準確測定都會產(chǎn)生影響。目前，HPLCMS/MS兼具分離能力強和靈敏度高的優(yōu)勢，已逐漸發(fā)展成為復雜生物體系中痕量生物活性物質(zhì)分析的強有力手段[22～26＼]。

本研究采用超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜法建立了對大鼠海馬和大腦皮層中生物胺類及氨基酸類共17種神經(jīng)化學物質(zhì)同時快速分析的方法。本方法的選擇性和重現(xiàn)性好，靈敏度高，并且無需對樣品進行衍生化和固相萃取等復雜的前處理，簡化了分析步驟，提高了分析效率。對比了兩種不同腦組織樣品前處理方法對神經(jīng)化學物質(zhì)含量測定結(jié)果的影響。本方法可應(yīng)用于腦組織中生物胺類及氨基酸類神經(jīng)化學物質(zhì)的分析測定，為臨床檢測提供了有效的樣品前處理方法和檢測手段。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

DionexUltimate3000超高效液相色譜儀TSQEndura三重四極桿質(zhì)譜儀，Hypercarb色譜柱（100mm×2.1mm，5μm）（ThermoScientific公司）；電子分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；BioGenPRO200型精密勻漿器（PROScientific公司）；EppendorfAG22331Hamburg離心機（GermanyEppendorf公司）。

多巴胺（DA）、腎上腺素（E）、去甲腎上腺素（NE）、5羥色胺（5HT）、5羥吲哚乙酸（5HIAA）、褪黑激素（Melatonin）、γ氨基丁酸（GABA）、酪氨酸（Tyr）、甘氨酸（Gly）、谷氨酸（Glu）、谷氨酰胺（Gln）、天冬氨酸（Asp）、?；撬幔═au）、絲氨酸（Ser）、色氨酸（Try）、乙酰膽堿（ACh）、組胺（Histamine）對照品均購于Sigma公司；甲醇和甲酸（色譜純，F(xiàn)isher公司）；實驗用水為MilliQ超純水。

Wistar大鼠20只（雄性，體重180～200g），適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為2組。

2.2實驗方法

2.2.1色譜條件流動相A：0.1%甲酸；流動相B：甲醇；流速：0.2mL/min；柱溫：25℃；進樣量：2μL；梯度洗脫：0～3min，0%B；3～10min，0%～100%B；10～12min，100%～0%B。10～12min流出物切換至廢液，不進入質(zhì)譜檢測。

2.2.2質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），采用正離子模式，多反應(yīng)檢測（MRM），毛細管電壓為3.0kV，離子傳輸管溫度為300℃；霧化器溫度為300℃；鞘氣流速35arb；輔助氣流速5arb。質(zhì)譜采集參數(shù)如表1所示。

2.2.3對照品溶液的配制分別準確稱取DA，E，NE，5HT，5HIAA，Melatonin，GABA，Tyr，Gly，Glu，Gln，Asp，Tau，Ser，Try，ACh、Histamine對照品各5mg，以0.1%甲酸溶解，分別定容至5mL，配成濃度為1mg/mL溶液。

2.2.4供試樣品的處理腦組織樣品前處理方法A：取大鼠斷頭處死，冰臺上立即取腦，放于冰冷的生理鹽水中漂洗，濾紙吸干生理鹽水，將腦置于冰臺上迅速剝離海馬體與大腦皮層，稱重。冰冷的0.1%甲酸加入到腦組織中，按1KG-3∶KG-510（V/W）勻漿。4℃下，12000r/min離心20min，取上清液，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，待測。

腦組織樣品前處理方法B[26＼]：取大鼠斷頭處死，立即取腦，置于80℃水浴2min后取出，用濾紙吸干水，迅速剝離海馬體與大腦皮層，稱重。冰冷的0.3%甲酸乙腈加入到腦組織中，按1KG-3∶KG-510（V/W）勻漿。4℃下，12000r/min離心20min，取上清液，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，待測。

3結(jié)果與討論

3.1色譜、質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別取DA，E，NE，5HT，5HIAA，Melatonin，GABA，Tyr，Gly，Glu，Gln，Asp，Tau，Ser，Try，ACh，Histamine對照品的1mg/mL溶液，以0.1%甲酸溶液稀釋至5μg/mL。采用直接進樣方式，電噴霧離子源（ESI），優(yōu)化各神經(jīng)化學物質(zhì)三重四極桿質(zhì)譜分析條件，分別嘗試正、負離子模式；毛細管電壓為2.0～5.0kV；離子傳輸管溫度為200～400℃；霧化器溫度為200～400℃；鞘氣流速20～50arb；輔助氣流速0～10arb。并自動優(yōu)化各神經(jīng)化學物質(zhì)在多反應(yīng)檢測（MRM）時所產(chǎn)生的碎片離子種類和豐度以及所需碰撞能量。

色譜條件優(yōu)化，考慮到所分析神經(jīng)化學物質(zhì)的極性較強、水溶性^好和在色譜柱上的保留問題，嘗試了不同類型的色譜柱（C8、C18和Hypercarb），Hypercarb色譜柱以多孔石墨化碳為固定相，對強極性化合物的保留和分離效果更好，且在不同梯度洗脫時，在100%水相條件下，保持穩(wěn)定的保留和分離；考慮神經(jīng)化學物質(zhì)的離子化效率較低的問題，比較了純水和不同濃度甲酸溶液作為流動相對分離、分析效果的影響，結(jié)果表明，0.1%甲酸為流動相時分析效果更佳。最終建立了無需衍生化、對腦組織樣品中17種神經(jīng)化學物質(zhì)同時定量分析的UPLCMS/MS方法。

3.2方法學考察

3.2.1標準曲線及定量限采用外標法定量，各取適量按照上述方法配制的對照品溶液混合，再根據(jù)需要用0.1%甲酸溶液逐級稀釋成不同濃度的系列混合對照溶液。以待測物濃度作為橫坐標，定量離子對峰面積為縱坐標，得到17種待測神經(jīng)化學物質(zhì)的線性回歸方程。以信噪比（S/N）>10確定方法的定量限（LOQ）。各神經(jīng)化學物質(zhì)的線性范圍、相關(guān)系數(shù)及定量限結(jié)果列于表2。

3.2.2精密度配制高、中、低3個濃度水平的混合對照品溶液，平行測定6次，計算各神經(jīng)化學物質(zhì)峰面積的RSD，測得日內(nèi)精密度（Intradayprecision）。連續(xù)測定3日，計算各神經(jīng)化學物質(zhì)峰面積的RSD，測得日間精密度（Interdayprecision）。測定結(jié)果如表2所示。LM

3.2.3加標回收率

取同一腦組織樣品勻漿液，分別加入高、中、低3個濃度水平的混合對照品溶液，按照2.2.4節(jié)中樣品處理方法A操作，平行測定6次，計算各神經(jīng)化學物質(zhì)的加標回收率（Recovery），結(jié)果如表2所示。

3.2.4重復性取同一腦組織樣品勻漿液6份，按照2.2.4小節(jié)中樣品處理方法A操作，平行測定6次，計算各神經(jīng)遞化學物質(zhì)峰面積的RSD，測得重復性（Repeatability），結(jié)果如表2所示。

3.3腦組織樣品前處理方法比較結(jié)果

大鼠大腦皮層中17種神經(jīng)化學物質(zhì)經(jīng)UPLCMS/MS分析所得的提取離子流圖如圖1所示。不同前處理方法下大鼠海馬和大腦皮層中17種神經(jīng)化學物質(zhì)的含量水平結(jié)果如表3所示。所測4組樣品均檢測到待測的17種神經(jīng)化學物質(zhì)，經(jīng)方法A處理的海馬和大腦皮層中5HT、Melatonin、GABA、Gln、Glu、Ser、Gly、Asp、Tyr和Try的測得含量顯著高于經(jīng)方法B處理的海馬和大腦皮層中的測得含量；DA、E、NE、5HIAA、ACh、Histamine和Tau的測得含量在經(jīng)方法A處理的海馬和大腦皮層中略高于經(jīng)方法B處理的海馬和大腦皮層。綜上所述，腦組織樣品前處理方法A優(yōu)于方法B。

4結(jié)論

本實驗建立了UPLCMS/MS法對大鼠海馬與大腦皮層中生物胺類及氨基酸類17種神經(jīng)化學物質(zhì)同時快速檢測的方法。利用超高效液相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的優(yōu)勢，分別優(yōu)化液相色譜和質(zhì)譜條件，選擇合適的電離模式，對質(zhì)譜參數(shù)進行了優(yōu)化，對檢測的6種生物胺類和11種氨基酸類神經(jīng)化學物質(zhì)分別選擇一對定性離子對和定量離子對，最終實現(xiàn)對17種神經(jīng)化學物質(zhì)的分離、提取及確證，實現(xiàn)了它們的定量分析。此方法可在10min內(nèi)完成17種神經(jīng)化學物質(zhì)同時分析，檢測時間短、線性關(guān)系較好、方法回收率高、穩(wěn)定性良好，滿足分析要求。本實驗對大鼠海馬和大腦皮層前處理方式進行探究，對比了兩種樣品前處理方法，實驗結(jié)果表明，冷環(huán)境處理方式下測得大鼠海馬與大腦皮層中神經(jīng)化學物質(zhì)含量較高，此方法無需衍生化、操作簡單、可直接測定。

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AbstractAnultraperformanceliquidchromatographytandemmass（UPLCMS/MS）spectrometrymethodwasestablishedfordeterminationofthecontentsofbioamineandaminoacidneurochemicalsinhippocampusandcerebralcortexofrat.Hypercarbcolumn（100mm×2.1mm，5μm）wasusedforthesampleseparationwith0.1%formicacidmethanolasthemobilephaseundergradientelution.TheneurochemicalsweredetectedbyMS/MSusingESIionsourceunderpositiveionizationmodewithMRMscan.Bothquantificationandconfirmationionswerechosenforeach6bioamineand11aminoacidneurochemicals.Theinfluenceoftwodifferentprocessingmethodsonthecontentsofneurochemicalsinbraintissueswascompared.Total17neurochemicalsweresimultaneouslydetectedin10min.Thecalibrationcurvewaswithagoodlinearrelationship.Theintradayandinterdayprecision，averagerecoveryandrepeatabilitycouldmeettheanalysisrequirement.ThisUPLCMS/MSmethodshowsexcellentselectivity，accuracy，highsensitivity，specificityandgoodrepeatability，andissuitablefortheseparationandquantizationofbioamineandaminoacidneurochemicalsinbraintissue.

第4篇：生物質(zhì)譜技術(shù)與方法范文

關(guān)鍵詞：氣質(zhì)聯(lián)用儀；氣體分析；應(yīng)用

中圖分類號：O659 文獻標識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20150940009

隨著氣體制造和應(yīng)用技術(shù)的不斷發(fā)展進步，對于氣質(zhì)聯(lián)用儀器分析方法也提出了相當高要求，也就是電子工業(yè)中標準氣體對于氣體純度要求越來越高，氣體的組成部分也非常復雜，一般分析很難達到衡量雜志要求標準。近年來技術(shù)發(fā)展迅速，分析具有一定靈敏度，樣品量、分析速度加快、分離和鑒定也有很多有點，技術(shù)應(yīng)用范圍也在涉及到了化學、化工、環(huán)境和能源等很多領(lǐng)域，同時還有儲糧糙米和稻谷釋放氣體方面也有很多研究課題。

1 氣體聯(lián)用儀的工作原理

混合物樣品經(jīng)過色譜柱分離進入質(zhì)譜儀離子，在離子源被電離成為離子時，離子經(jīng)過質(zhì)量分析器和檢測器成為質(zhì)譜信號輸入計算機，樣品由色譜柱不斷流入到離子源里，離子由離子源質(zhì)量分析器然后設(shè)定好分析器質(zhì)量范圍，計算并采集到質(zhì)譜。這樣計算機就可以自動將每一個質(zhì)譜中離子強度相加，顯示出總體離子強度，隨著時間變化曲線中總離子色譜圖形狀和一般色譜圖能夠相互一致，這樣就是質(zhì)譜檢測器的色譜圖。

質(zhì)譜儀掃描方式一般有兩種，全掃描和選擇離子掃描，前者是制定質(zhì)量范圍中離子掃描記錄，能夠最終得到一個正常的質(zhì)譜圖，也就是質(zhì)譜圖提供未知圖。另一個就是選擇離子檢測，只針對選定離子進行檢測，離子不被記錄，最大優(yōu)點就是對于離子進行選擇性檢測，對于不相關(guān)離子統(tǒng)統(tǒng)都被排擠在外，后者的檢測靈敏度比較高，是普通的一百倍，但是缺點就是不能得到非常完整的質(zhì)譜圖，所以不能用來對于未知物的定性分析使用，它的主要用途是定量分析，可以把全掃描方式出的復雜色譜圖變簡單，消除造成干擾的因素，對于被測部分影響可以降低主峰，一般都采用切割技術(shù)，或者使用氣路相對比較復雜的技術(shù)，通過離子選擇技術(shù)來避開主體。

2 對于進樣方法的選擇

由于分析樣品比較復雜，所以對于氣體和液體樣品來說，氣體進樣通常都使用六通進樣方法，液體取樣一般采用的是注射方法，但是對于液化氣體就比較麻煩，因為壓力比較高，所以采用注射方法，這樣就可以使得儀器適用于檢測不同的樣品。色譜分離和質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集同時進行，使得每一個分組得到分離鑒定，設(shè)置合適的色譜和質(zhì)譜分析方法，色譜條件包括色譜柱、固定液化、氣化溫度和溫升程序等，設(shè)置原則是一般情況使用毛細管，非極性樣品采用級毛細管柱，使用后再進行調(diào)整，質(zhì)譜條件包括電離和電子電流等方面內(nèi)容，一般都是根據(jù)樣品情況進行設(shè)定，保護燈絲，設(shè)定質(zhì)譜條件后還要進行溶劑去除，通過離子源打開燈絲。

3 氣質(zhì)聯(lián)用儀在糙米和稻谷釋放氣體中應(yīng)用

氣質(zhì)聯(lián)用儀憑借氣相色譜選擇性和質(zhì)量分析器靈敏性廣泛被應(yīng)用于農(nóng)業(yè)與糧食行業(yè)中，對于離子源選擇、進樣技術(shù)選擇、質(zhì)量分析器選擇等方面都使用質(zhì)量分析器。對于不同的溫度和濕度條件儲藏稻谷進行微生物活動監(jiān)測，實驗結(jié)果可以看出，稻谷在30℃，濕度在70%～80%度之間，微生物活動水平相對比較低，當儲藏環(huán)境濕度超過80%時，就會影響到稻谷和糙米表面微生物，糧層濕度會擴散。氣相色譜是一種很有效的分離分析方法，定性方面存在很多弊端問題，就是在殘留分析方面，質(zhì)譜儀定性上有非常重要作用，氣質(zhì)聯(lián)用儀能夠提供可信的定性信息，氣相色譜和多級質(zhì)譜的選擇性，可以消除基質(zhì)影響，廣泛應(yīng)用于水稻殺蟲劑、除草劑、殺菌劑和稻谷熏蒸劑中，各種藥劑之間不同物理特性，也會受到一定條件影響，檢測儀器，樣品制備方法等都受到不同選擇，氣質(zhì)聯(lián)用是常用靈敏檢測手段，已經(jīng)成為藥劑殘留檢測重要的技術(shù)手段，氣質(zhì)聯(lián)用現(xiàn)在有不少科研人員都在使用。

4 氣質(zhì)聯(lián)用儀質(zhì)量分析器選擇

氣質(zhì)聯(lián)用儀一般有四級桿，主要就是飛行時間和扇形磁場檢測器，單獨的四級，只是用來分析器掃描工作，適合于分析小分子和多電荷大分子，該質(zhì)量法分辨儀器保留時間接近，質(zhì)量相差幾個數(shù)量，因而影響測定結(jié)果準確性。氣質(zhì)聯(lián)用常常會出現(xiàn)基質(zhì)效應(yīng)問題，可以誘導相同濃度的藥劑在基質(zhì)溶液中的色譜值數(shù)據(jù)，就會造成溶劑標準計算含量變化，基質(zhì)誘導效用就會成為假陽性結(jié)果，使得揮發(fā)組沉淀物質(zhì)和熱變形基質(zhì)對于色譜柱的污染會造成很多影響，可以減少難揮發(fā)化合物和不穩(wěn)定化合物抑制基質(zhì)誘導方法。

對稻谷和糙米等儲糧品種的儲藏安全進行研究，在實踐中主要難點問題就是相同溫度條件，稻谷和糙米本身會發(fā)生很多生物化學變化，同時也會導致品質(zhì)變化，另外就是霉菌會使得稻谷和糙米品質(zhì)劣變，最主要因素就是濕度過大，就容易導致霉菌產(chǎn)生，對于稻谷和糙米呼吸作用總體來說儲藏結(jié)構(gòu)與原理，受到環(huán)境、氣候和通風條件限制，糧倉溫度和濕度會發(fā)生變化，非常容易造成糧食發(fā)霉情況，針對這一問題，可以選用智能化多參數(shù)糧情檢測方法，把糧食儲存情況做智能記錄，使得整個系統(tǒng)都能夠正常運轉(zhuǎn)。

5 氣質(zhì)聯(lián)用的改進方法

氣質(zhì)聯(lián)用適用于分析非極性和揮發(fā)性成分，對于極性和非揮發(fā)性穩(wěn)定性較差的，氨基甲酸酯類農(nóng)藥極性熱不穩(wěn)定農(nóng)藥，這類檢測一般都使用液質(zhì)聯(lián)用，某些有機磷農(nóng)藥也屬于極性農(nóng)藥，氣質(zhì)聯(lián)用測定經(jīng)常會導致回收率低現(xiàn)象發(fā)生，就限制了氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀檢測靈敏度應(yīng)用范圍，對于揮發(fā)性不穩(wěn)定性農(nóng)藥有很多突破。

利用兩個色譜保持真空狀態(tài)下，連接分析色譜柱和進樣口，保持常壓狀態(tài)下，使用傳統(tǒng)分析方法拖尾柱藥劑改善峰形，提高藥劑檢測限，然后影響到色譜柱分離能力，分離同分異構(gòu)體上，使得這些分異構(gòu)體有很低的分辨率，優(yōu)化條件實現(xiàn)快速和高靈敏特點。

氣相色譜和四級桿、離子飛行時間質(zhì)量分析儀器都已經(jīng)廣泛被應(yīng)用，氣相色譜串聯(lián)實驗室分析最常見和最熟悉的檢測方法，就是許多標準譜庫使定性簡單，氣相色譜在低壓條件下結(jié)合很多技術(shù)是氣質(zhì)聯(lián)用儀未來發(fā)展趨勢。色譜柱的安裝應(yīng)該嚴格按照說明進行操作，切割時候應(yīng)該使用專用陶瓷技術(shù)，割面要平整，對于不同規(guī)格毛細管柱要選用不同石墨，還要多注意端口和質(zhì)譜不能混合，對于儀器公司提供的工具要進行專門工具比對，一般可以使用接質(zhì)譜前先開機方式，看看是否有氣泡溢出等，防止造成固定液被氧化流失而損壞色譜柱。另外對氣質(zhì)聯(lián)用儀要及時進行改進，對于極性和非揮發(fā)性不穩(wěn)定組分要進行氨基甲酸酯農(nóng)藥檢測工作。

6 結(jié)論

質(zhì)譜法可以有效定性分析很多復雜有機化合物，不論是對于儲糧稻谷還是糙米釋放出氣體，都能很好分離和分析出方法，特別是適合于進行有機化合物定量分析，但是一般的定性分析比較困難，這兩者有效結(jié)合必將會為化學家和生物學家提供一個先進的復雜有機化合物處理器，可以成為一種很好定性和定量分析出樣品的工具。也可以將兩種方法進行相互結(jié)合，使用聯(lián)用技術(shù)將氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)合起來，也就是氣質(zhì)聯(lián)用儀，被廣泛應(yīng)用于分離和鑒定各種物質(zhì)，具有高度靈敏度和分辨率，生物樣品藥物和代謝物定量也具有一定工具效能。

參考文獻

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第5篇：生物質(zhì)譜技術(shù)與方法范文

目前蛋白質(zhì)組學技術(shù)在實驗診斷與臨床醫(yī)學中已經(jīng)得到越來越多的應(yīng)用。在蛋白質(zhì)組學中以下三項技術(shù)的進步對于實驗診斷與臨床醫(yī)學研究進展將具有決定性的影響[2~5]。

1•1蛋白質(zhì)的分離技術(shù)

在蛋白質(zhì)組學中應(yīng)用分離技術(shù)有兩個目的。第一,通過將蛋白質(zhì)的混合物分離成單一蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)小組以簡化復雜的蛋白質(zhì)混合物;第二,通過標記的方法可以比較兩個蛋白質(zhì)的混合物樣品中蛋白質(zhì)的不同表現(xiàn)。其中主要的技術(shù)有雙向電泳(two-dmiensionalgelelectrophoresis,2-DE)、高效液相層析(high-performanceliquidchromatography,HPLC)、毛細管電泳(capillaryelectrophoresis,CE)、親和層析(affinitychoromatography)、蛋白芯片(proteinmi-croarray)、磁性微球(magneticbeads)和免疫組等。特別是蛋白芯片和磁性微球兩項新的蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)克服了以往技術(shù)的缺點,具有高靈敏度、高通量、結(jié)果重復性好(CV<5~10%)、可機械化操作和方法靈活等特點。待測樣品來源廣泛,不需作特殊前處理,可以直接點樣檢測,如血清、尿液及組織液等;檢測快速,一般一例標本的檢測時間僅需約5min,從標本制備到出結(jié)果全過程僅約1h。蛋白芯片和磁性微球兩項新的蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)有可能在體液中潛在腫瘤標志(tumormarker)檢測方面創(chuàng)造革命性突破。

1•2生物質(zhì)譜(biologicalmassspectrometry)技術(shù)

生物質(zhì)譜是化學領(lǐng)域中非常重要的一種分析方法。它通過測定分子質(zhì)量和相應(yīng)的離子電荷實現(xiàn)對樣品中分子的分析。19世紀末科學家已經(jīng)奠定了這種方法的基礎(chǔ),1912年科學家第一次利用它獲得對分子的分析結(jié)果。在質(zhì)譜分析領(lǐng)域,已經(jīng)出現(xiàn)了幾項諾貝爾獎成果,其中包括氫同位素氘的發(fā)現(xiàn)(1934年諾貝爾化學獎成果)和碳60的發(fā)現(xiàn)(1996年諾貝爾化學獎成果)。不過,最初科學家只能將它用于分析小分子和中型分子,由于生物大分子比水這樣的小分子大成千上萬倍,因而將這種方法應(yīng)用于生物大分子難度很大。美國科學家約翰•芬恩與日本科學家田中耕一在傳統(tǒng)的質(zhì)譜分析法基礎(chǔ)上發(fā)明了一種新方法:對生物大分子的質(zhì)譜分析法。首先將成團的生物大分子拆成單個的生物大分子,并將其電離,使之懸浮在真空中,然后讓它們在電場的作用下運動。不同質(zhì)量的分子通過指定距離的時間不同,質(zhì)量小的分子速度快些,質(zhì)量大的分子速度慢些,通過測量不同分子通過指定距離的時間,就可計算出分子的質(zhì)量。蛋白質(zhì)組學常用的生物質(zhì)譜有五種,分別簡介如下。

1•2•1電噴霧電離質(zhì)譜(electrosprayionizsationmassspectrometry,ESI-MS):在毛細管的出口處施加一高電壓,所產(chǎn)生的高電場使從毛細管流出的液體霧化成細小的帶電液滴,隨著溶劑蒸發(fā),液滴表面的電荷強度逐漸增大,最后液滴崩解為大量帶一個或多個電荷的離子,致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進入氣相。電噴霧離子化的特點是產(chǎn)生高電荷離子而不是碎片離子,使質(zhì)量電荷比(masstochargeratio,m/z)降低到多數(shù)質(zhì)量分析儀器都可以檢測的范圍,因而大大擴展了分子質(zhì)量的分析范圍,離子的真實分子質(zhì)量也可以根據(jù)質(zhì)荷比及電荷數(shù)算出。

1•2•2基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtmieoffightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)的基本原理:將分析物分散在基質(zhì)分子中并形成晶體,當用激光照射晶體時,由于基質(zhì)分子經(jīng)輻射吸收能量,導致能量蓄積并迅速產(chǎn)熱,從而使基質(zhì)晶體升華,致使連同分析物一起進入氣相。MALDI-TOF-MS所產(chǎn)生的質(zhì)譜圖多為單電荷離子,因而質(zhì)譜圖中的離子與多肽和蛋白質(zhì)的質(zhì)量有一一對應(yīng)關(guān)系。MALDI-TOF-MS與蛋白芯片分離技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用即為表面增強激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜(surfaceenhancedlaserdesorption/ionizationtmieoffightmassspectrometry,SELDI-TOF-MS)。

1•2•3快原子轟擊質(zhì)譜(fastatombomebardmentmassspectrometry,FABMS):一種軟電離技術(shù),應(yīng)用快速惰性原子射擊存在于底物中的樣品,使樣品離子濺出進入分析器。這種軟電離技術(shù)適于極性強、熱不穩(wěn)定的化合物的分析,特別適用于多肽和蛋白質(zhì)等的分析研究。

1•2•4同位素質(zhì)譜:一種開發(fā)和應(yīng)用比較早的技術(shù),被廣泛地應(yīng)用于各個領(lǐng)域,但它在醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用只是近幾年的事。由于某些病原菌具有分解特定化合物的能力,該化合物又易于用同位素標示,人們就想到用同位素質(zhì)譜的方法檢測其代謝物中同位素的含量以達到檢測該病原菌的目的,同時也為同位素質(zhì)譜在醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用開辟了一條思路。

1•2•5免疫組質(zhì)譜(mimunomicmassspectrometry,IMS):質(zhì)譜與抗體分離技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用。免疫組質(zhì)譜檢測(mimunomicmassspectrometryanalysis,IMSA)的定義為一組多種(類)抗體與質(zhì)譜聯(lián)合來精確地鑒別變異或修飾生物標志群的方法。在一個抗體組基質(zhì)上同時捕獲多個生物標志,并對捕獲的變異或修飾的生物標志進行質(zhì)譜精確分析?？梢酝瑫r檢測多個生物標志群。免疫組質(zhì)譜檢測的主要優(yōu)點為節(jié)省生物標志的排序鑒定及鑒別變異或修飾的生物標志。在實驗診斷與臨床醫(yī)學研究中應(yīng)用比較廣泛的是電噴霧電離質(zhì)譜技術(shù)(ESI-MS)和基質(zhì)輔助激光解析/電離質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF-MS),這兩項質(zhì)譜技術(shù)都能與多種分離技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用,例如LC-MS、CE-MS和SELDI-TOF-MS等。質(zhì)譜技術(shù)在未來幾年的實驗診斷與臨床醫(yī)學研究中必然會像SDS-PAGE一樣普遍和重要。

1•3蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫

蛋白質(zhì)組學的發(fā)展離不開蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的發(fā)展及檢索方法的改進,同時由于蛋白質(zhì)組學的發(fā)展,使得蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫日益豐富。數(shù)據(jù)庫的專一性和綜合性越來越強,而且通過生物信息學的應(yīng)用,可以對多個不同的數(shù)據(jù)庫進行銜接。蛋白質(zhì)組學常用的數(shù)據(jù)庫按研究內(nèi)容可以分為兩類:結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫和系統(tǒng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫包括蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)功能等數(shù)據(jù)庫,這類蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫主要提供蛋白質(zhì)的序列、功能、主要結(jié)構(gòu)等信息以幫助鑒定蛋白質(zhì),如NCBInr,Genpept,SwissProt,OwlanddbEST等數(shù)據(jù)庫。系統(tǒng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫包括雙向凝膠電泳及蛋白質(zhì)指紋圖譜庫等,這類蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫主要提供生命體各個系統(tǒng)或器官的總體蛋白質(zhì)系統(tǒng)動態(tài)變化幫助對某個系統(tǒng)內(nèi)或疾病中的全景的蛋白質(zhì)水平進行觀察,如expasy.ch、等數(shù)據(jù)庫。

2蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)用于疾病的檢測[6~9]

2006年10月28日美國長灘HUPO第五屆世界年會上提出疾病生物標志(biomarker)的研究分為三個階段:發(fā)現(xiàn)疾病生物標志、鑒定疾病生物標志、驗證疾病生物標志。目前在臨床疾病檢查及診斷方面已建立了生化檢查、器械檢查、免疫及遺傳學檢查、手術(shù)及病理檢查等多種多樣的方法。但在疾病早期或受各種因素干擾而未出現(xiàn)癥狀或體征前,這些檢測方法多不靈敏或特異,難以對病人作出及時正確的診斷。而蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)在對臨床疾病檢測時,抓住絕大多數(shù)疾病都有特異的生物標志的本質(zhì),進行疾病監(jiān)測和識別。即可對生物標志做直接鑒定,故優(yōu)于酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELSIA)、免疫熒光試驗等間接測定生物標志的方法。同時,還有一套靈敏的監(jiān)測系統(tǒng)來檢測和識別這些微量生物標志;因而決定了它在臨床檢測中的敏感性和準確性。從理論上推論,任何有生物標志表達的疾病都應(yīng)能被檢出,并作出及時診斷。在過去五年里,部分病例檢測和研究驗證了此設(shè)想,特別是在腫瘤檢測方面取得了突破性進展。

2•1腫瘤檢測

2004年,美國國立腫瘤研究所(NCI)組織的早期疾病探測研究機構(gòu)(EDRN)多中心(6大機構(gòu))三期臨床實驗得出結(jié)論:通過血清及儀器標準化質(zhì)控,蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)是目前最有希望的腫瘤早期檢測方法[10]。據(jù)國內(nèi)外對12種腫瘤血清及尿液檢測結(jié)果統(tǒng)計,蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)檢測敏感性和特異性均為80%~90%,明顯高于傳統(tǒng)腫瘤標志物的檢測方法,故蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)特別對評估傳統(tǒng)腫瘤標記物陰性的惡性腫瘤有意義[11]。

2•1•1肝癌:中國目前有1•3億乙型肝炎的病原攜帶者,其中包括2300萬乙型肝炎引起的肝硬化患者。肝細胞性肝癌主要由乙型肝炎導致的肝硬化引起。目前用于輔助診斷肝癌的甲胎蛋白試劑盒的特異性與敏感性都很差,無法用于鑒別肝癌與肝硬化。Liu等[12~13]在2003年《美國第94屆腫瘤年會》上正式報道蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)可鑒別由乙型肝炎引起的肝硬化與肝癌。通過分析血清蛋白質(zhì)指紋峰,發(fā)現(xiàn)下述五種蛋白質(zhì)指紋(2045,3935,4469,8687及8933u)可以用于區(qū)分乙型肝炎肝硬化與肝癌(P<0•001)。鑒定蛋白峰8933u為C3a-desArg。用已知的五項蛋白質(zhì)指紋,雙盲驗證乙肝引起肝硬化與肝癌敏感性為91%,特異性為89%。用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)也可鑒別由丙型肝炎引起的肝硬化與肝癌。Ward等[14]通過分析182例丙型肝炎引起肝硬化與肝癌,雙盲測試丙型肝炎引起肝硬化與肝癌敏感性為94%,特異性為86%。肝硬化的治療方法是保守治療,而肝癌必須通過手術(shù)治療,蛋白質(zhì)指紋方法準確率為85%~90%。因此,這是目前最好的無創(chuàng)性檢測方法。

2•1•2乳腺癌:Li等[15]2002年發(fā)表了通過蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)三個腫瘤標志BC1(4•3ku),BC2(8•1ku)和BC3(8•9ku)來聯(lián)合檢測乳腺癌。Mathelin等[16]通過實驗的方法來驗證這些腫瘤標志的真實有效性,在49例乳腺癌,13例良性疾病和27例健康婦女中進行測試。BC2腫瘤標志有效性未得到確定,但是發(fā)現(xiàn)了兩個蛋白峰BC1a(4286u)和BC1b(4302u)能與Li的BC1相對應(yīng),在乳腺癌中表達下調(diào)(分別是P<0•00007和P<0•0002)。同樣BC3a(8919u)和BC3b(8961u)兩個蛋白峰能與Li的BC3相對應(yīng),在乳腺癌中表達上調(diào)(分別是P<0•02和P<0•0002)。使用BC1a/BC1b/BC3a/BC3b的組合對乳腺癌的檢測準確性達33%和45%,相同的樣品用CA153檢測準確率僅為22%。結(jié)合BC1a/BC1b/BC3a/BC3b的組合和CA153增加了乳腺癌檢測的敏感性。總體來說,實驗證明Li的研究結(jié)果BC1和BC3在對乳腺癌檢測中是具有幫助的。

2•1•3卵巢癌:CA125是一種廣泛用于卵巢癌檢測的較好的輔助診斷方法,但該抗原多在晚期病人中才能檢測出來,Ⅰ期病人僅50%~60%陽性。因此,病人經(jīng)臨床確診時多為晚期,五年存活率僅約35%。美國癌癥研究所等最早應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)進行卵巢癌檢測和研究,經(jīng)對50例卵巢癌病人(包括18例臨床診斷Ⅰ期病人),66例非惡性腫瘤病人及63名正常人進行血清檢測,結(jié)果顯示,敏感性100%,特異性95%,陽性預(yù)測值94%[17]。提示采用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)對卵巢癌病人進行早期檢測,可大大提高她們的五年存活率[18]。

2•1•4前列腺癌:前列腺特異性抗原(PSA)是目前檢測前列腺癌主要的敏感參考指標,雖然它的敏感性很高,不容易漏診,但特異性僅20%~40%,如在許多良性前列腺肥大病人中PSA亦增高。然而,應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù),通過檢測前列腺癌病人血清中9種特異蛋白質(zhì)生物標志,可將正常人、前列腺癌和良性前列腺肥大病人清楚的區(qū)分開來,而其敏感性和特異性均在90%左右[19]。

2•1•5胃癌:Xu等[20]分析不同病理分期胃癌和健康人的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜。進一步鑒定一個1465u的蛋白質(zhì)指紋為端切纖維蛋白肽A(fibrin-opeptideA-degAla,FPA-degAla)。端切纖維蛋白肽A可作為最好的檢測早期胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的單個指標,雙盲驗證在診斷胃癌的敏感性和特異性達到85•4%和100%。這些發(fā)現(xiàn)表明,凝血系統(tǒng)中纖維蛋白肽A減少或者纖維蛋白肽A的變異片段是胃癌生物學的早期事件。通過對胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者和胃癌無淋巴結(jié)侵犯者血清中的端切纖維蛋白肽A進行分析,可用于臨床胃癌輔助診斷、手術(shù)療效、轉(zhuǎn)移與復發(fā)及分期的判斷。其他腫瘤診斷:我國已有38個單位應(yīng)用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)進行肺癌、肝癌、胃癌、腸癌、食管癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、鼻咽癌、膀胱癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等的臨床檢驗和研究,均取得了與國際相似的結(jié)果[21~27]。美國NCI(NationalCancerInstitute)主席Dr.AndrewvonEschenbach在2005年4月16日(美國第96屆腫瘤年會上)宣布美國將用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)對腫瘤早期定性和PET-CT對腫瘤早期定位相結(jié)合等手段對腫瘤作出極早期診斷,使腫瘤在2015年成為非致死性疾病。

2•2其他疾病的檢測

蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)對其他疾病的檢測目前尚不普及,但一些研究報告的結(jié)果亦非常鼓舞人心。

2•2•1心血管疾病:蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)在心血管疾病診斷方面也取得重大突破。首先,用SELDI-TOF-MS鑒定血清載脂蛋白A-Ⅰ(apoA-Ⅰ)和載脂蛋白A-Ⅱ(apoA-Ⅱ),解決了ELISA法的抗體交叉反應(yīng)問題,這對糖尿病及心血管病的并發(fā)癥的監(jiān)控有重大意義[28]。其次,用SELDI-TOF-MS鑒定補體C3-α鏈及纖維蛋白原的早期降解蛋白質(zhì)指紋,能更早地發(fā)現(xiàn)心肌梗死[29]。第三,用SELDI技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)載脂蛋白C-Ⅰ(apoC-Ⅰ)和載脂蛋白C-Ⅲ(apoC-Ⅲ)可區(qū)別缺血性和出血性腦卒中[30]。

2•2•2感染性疾病:艾滋病是一種傳播越來越廣,嚴重危害人類健康和生命的一種嚴重免疫缺陷病。在艾滋病感染的人群中,有2%~3%的人并不發(fā)病。自1986年以來,經(jīng)過一系列的研究,認為是被稱之為“CAF”的抑制因子抑制了HIV-1的復制。但對其確切機制并不十分清楚[31]。2002年美國著名艾滋病專家、雞尾酒療法創(chuàng)始者何大一教授借助蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù),在短短三個月內(nèi)檢測發(fā)現(xiàn)在2%~3%艾滋病感染者而不發(fā)病的人群中,存在三個蛋白質(zhì)指紋,鑒定為α-defensin1、2和3抗艾滋病病毒的生物標志[31]。這不僅極大推進了艾滋病的發(fā)病機理及抗艾滋病機制的研究,也將推動臨床艾滋病的防治進展。對鼠疫和嚴重急性呼吸綜合征(SARS)的病原學診斷,特別是發(fā)病早期的檢測有時比較困難,通常主要依靠臨床和流行病調(diào)查進行診斷?，F(xiàn)在通過蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)在發(fā)病早期即可進行病原學診斷,研究已發(fā)現(xiàn)有五種生物標志與鼠疫桿菌發(fā)病有關(guān)[32]。中國學者對早期SARS病人血清進行蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)檢測,發(fā)現(xiàn)病人在臨床發(fā)病早期(1~7d),即可檢測出相關(guān)的特異蛋白,其敏感性為98•6%,特異性為94•6%[33]。

2•2•3老年性癡呆癥:老年性癡呆癥是危害老年人身心健康的常見病,過去由于缺乏可靠的檢查方法及客觀診斷標準,所以主要依靠病人的臨床表現(xiàn)加以診斷,而且一經(jīng)確診病人病情則已比較嚴重。一些研究曾發(fā)現(xiàn),一種β型淀粉樣多肽增高與該病發(fā)病有關(guān),但由于缺乏精細的檢測方法,對引發(fā)該病的多肽確切片段和分子質(zhì)量不甚清楚。因此,不能將其作為確診的標準。現(xiàn)用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)則能確定抗原變異片段,發(fā)現(xiàn)β型多肽中的片段1~42,分子質(zhì)量4514u是引發(fā)疾病的關(guān)鍵生物標志。該生物標志不僅可作為診斷的主要參考指標,還可為病人進行早期診斷和早期治療提供依據(jù)[34]。

2•2•4慢性腎病:慢性腎病是臨床常見病,既往臨床上主要依靠腎小球濾過率及血清肌酐水平檢測進行診斷及評價腎功能的受損程度。但這些檢測結(jié)果受許多因素的影響,如血液的稀釋度及其他非腎臟疾病的影響,均可能引起腎小球濾過率及肌酐水平的改變,因而并非慢性腎病所特異。然而,用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)已從慢性腎病病人中檢測到有一種分子質(zhì)量為26000u,鑒定為Lipocalin型前列腺素D合成酶(L-PGDS)的糖蛋白,在慢性腎病時增高,對診斷有特殊意義[35]。

2•2•5移植檢測:腎移植排斥反應(yīng)目前主要依靠腎活檢。但這種創(chuàng)傷性檢查有一定的危險性和應(yīng)用的局限性。現(xiàn)在,美國和加拿大科學家用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)進行尿液檢測,可無創(chuàng)性、24h不間斷地監(jiān)測病情變化,鑒定急性腎移植排斥反應(yīng),其準確率高達91%~94%。這對腎移植后免疫抑制劑用量的調(diào)整、并發(fā)癥與療效判斷有重大意義[36~37],也將對其他移植(肝、心)技術(shù)的精密組織配型、療效判斷、并發(fā)癥的研究提供重大參考價值。

3免疫組質(zhì)譜檢測

質(zhì)譜與抗體分離技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用即為免疫組質(zhì)譜(Immunomicmassspectrometry,IMS)。免疫組質(zhì)譜檢測(Immunomicmassspectrometryanalysis,IMSA)為一組多種(類)抗體與質(zhì)譜聯(lián)合來精確地鑒別變異或修飾生物標志群的方法。在一個抗體組基質(zhì)上同時捕獲多個生物標志,并對捕獲的變異或修飾的生物標志進行質(zhì)譜精確分析?？梢酝瑫r檢測多個生物標志群(biomarkers)。目前ELISA等技術(shù)主要依靠間接的化學或放射測定法,因而無法直接鑒定抗原的變異,而用免疫組質(zhì)譜技術(shù)能測定抗原變異片段的分子質(zhì)量。另外,還可以將多種疾病的特異性抗原的抗體同時標在一個基質(zhì)點上。即用質(zhì)譜同時可檢測多種疾病特異性抗原的分子質(zhì)量(如乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、梅毒),及進行窗口期檢查,而ELISA技術(shù)及免疫熒光技術(shù)無法做到[34,38]。我國Xu等[39]首創(chuàng)用抗FPA(纖維蛋白肽A)、抗C3a(補體C3a)、抗ApoA-I(載脂蛋白A-I)、抗ApoA-II(載脂蛋白A-II)抗體組聯(lián)合標記至磁珠上,通過分析正常人及消化系統(tǒng)腫瘤病人的血清蛋白質(zhì)指紋峰,發(fā)現(xiàn)1465u(纖維蛋白肽A其N端除去了丙氨酸)、8938u(補體C3a其C端除去了精氨酸)、28078u(載脂蛋白A-I)、8707u(載脂蛋白A-II)生物標志可以用于區(qū)分正常人、消化系統(tǒng)腫瘤生物標志群變異表達。該檢測方法的靈敏度為:胃癌95%(198/208)、肝癌81%(183/226)、結(jié)直腸癌病人87%(158/182)。而消化系統(tǒng)腫瘤中胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌的AFP和CEA檢測靈敏度為:46%~60%。免疫組質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)對AFP和CEA表達陰性的胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌檢測陽性,故免疫組質(zhì)譜技術(shù)特別對評估傳統(tǒng)腫瘤標記物陰性的惡性腫瘤有更大的意義。

由于每種特異性抗體所捕獲生物抗原的分子質(zhì)量是不同的,故免疫組與質(zhì)譜聯(lián)合應(yīng)用時,質(zhì)譜儀就非常容易地將這四種抗原同時分開了。用三種以上抗體組標在磁珠上與質(zhì)譜聯(lián)合,可同時檢測出多種(三種以上)的生物標志及一種或一種以上變異或修飾的生物標志。這樣產(chǎn)生了一種新型可用質(zhì)譜儀直接進行分析多種(三種以上)生物標志及一種或一種以上變異或修飾生物標志的方法。三色免疫熒光法可以同時分析三種生物標志,但無法達到三種以上的生物標志的分析或像免疫組質(zhì)譜檢測來精確地、高效地確定一種變異或修飾的被分析物(抗原或生物標志)。這些生物標志組合可以用于同時鑒別正常人及不同種類疾病的檢測方法。目前用于臨床疾病治療療效監(jiān)測的方法和評估預(yù)后的指標多為宏觀和粗略的。如根據(jù)腫瘤包塊大小變化,陰影消失與否;血象和生化指標的改變;根據(jù)骨髓中原始幼稚細胞的百分比作為判斷白血病緩解與否的指標;有時還采用的是回顧性分析指標。因此,難以反映疾病本身本質(zhì)變化規(guī)律,在一定程度上缺乏客觀性。如果根據(jù)疾病生物標志類型和含量的改變,可能更符合客觀實際,更有助于臨床治療。

4蛋白質(zhì)指紋圖譜庫建立及標準化

目前,由于全世界實驗室在質(zhì)控血清建立及儀器標準化狀態(tài)、儀器自動化應(yīng)用方面存在不統(tǒng)一的標準,故用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)疾病標志進行臨床診斷和治療干預(yù)之前,必須經(jīng)過嚴格的多中心和三期臨床質(zhì)控驗證。只有經(jīng)過如上所述的嚴格驗證,才能將此技術(shù)用于疾病生物標志的檢測與臨床診斷[10,40]。2004年,美國國立腫瘤研究所(NCI)組織的早期疾病探測研究機構(gòu)(EDRN)多中心(6大機構(gòu))統(tǒng)一了血清及儀器標準化質(zhì)控[10]。蛋白質(zhì)指紋圖譜儀也經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局批準進入中國市場[41]。中國的質(zhì)譜標準化質(zhì)控血清制備定義符合如下標準:供血者男女各半,血型為O型;年齡為18~30歲;民族,漢。生化指標正常,包括:總膽固醇、甘油三酯、空腹血糖、乙肝表面抗原、肝功能檢查、腎功能檢查;無遺傳病家族史;無重大傳染病史。女性無懷孕,男性無吸煙史者。使用蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)已經(jīng)成為研究比較蛋白質(zhì)組學和發(fā)現(xiàn)生物標記可選用的方法,尤其在多肽及低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)指紋圖譜分析的研究中非常有用[13,20~27]。但是,我們在進行蛋白質(zhì)指紋圖譜分析時發(fā)現(xiàn)血液樣本離體后如不及時分離血清,對結(jié)果影響很大,因而及時分離血清成為實驗的首要保障。分離血清的操作也比較簡便可行。

第6篇：生物質(zhì)譜技術(shù)與方法范文

汽油中烴類物質(zhì)的太赫茲時域光譜研究

利用太赫茲技術(shù)研究重油燃料油標準物質(zhì)中的微量硫含量

利用太赫茲技術(shù)研究煤炭中的灰分含量與碳含量

固化劑及其固化物的太赫茲光譜分析

吐溫與纖維相互作用的太赫茲波譜分析

沐浴露產(chǎn)品在THz波段的光譜特性

環(huán)氧樹脂及其混合物的太赫茲光譜分析

用太赫茲時域光譜定性鑒別十六烷值增進劑的產(chǎn)品性能

基于S3C2440和Linux的溫濕度測控系統(tǒng)設(shè)計

離子遷移(IMS)漂移管的多物理場模擬方法研究

基于性能最優(yōu)的磁流變阻尼器勵磁線圈纏繞方法研究

基于嵌入式機器視覺技術(shù)的血型自動識別系統(tǒng)

基于光纖陀螺的組合導航系統(tǒng)中雙DSP通信研究

級聯(lián)型多電平逆變器單元電路數(shù)字化控制的研究

小型便攜化SPR生物傳感系統(tǒng)的研制與應(yīng)用

基于計算機視覺技術(shù)的BGA芯片精準焊接定位的研究

大容量生物樣品快速灰化裝置研制及初步驗證

嵌入式ARM在基于以太網(wǎng)的AUV控制系統(tǒng)中的應(yīng)用

力帆620汽車EPS系統(tǒng)故障自診斷研究

高可靠性礦用瓦斯爆炸防控系統(tǒng)

基于ANSYS的振動盤給料器動態(tài)分析

基于手持設(shè)備的煙塵濃度監(jiān)測軟件設(shè)計

溫室數(shù)據(jù)采集器誤差分析及校正

PDF軟件在質(zhì)量體系文件管理中應(yīng)用

自動化立體倉庫的應(yīng)用與物流發(fā)展的灰色關(guān)聯(lián)分析

一種PN碼快速捕獲的方法

法布里干涉近紅外光譜儀測定煙草品質(zhì)成分

應(yīng)用熒光光譜法檢測藍藻生物量

氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在水環(huán)境突發(fā)性污染事件中的應(yīng)用

頂空萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法測定一種兒童專用防痱止癢水的揮發(fā)性成分

土壤中全磷測定的不確定度評定

采用計算化學方法比較四種核苷的第一電離能

氣相色譜-質(zhì)譜法快速測定豬肉中的膽固醇

地物光譜儀在熱致變色材料表征中的應(yīng)用

氣相色譜法測定土壤中的6種酞酸酯

氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法測定全血中的五種酰胺類除草劑

便攜式質(zhì)譜儀對某化工園區(qū)特征揮發(fā)性半揮發(fā)性有機物調(diào)查研究

離子色譜法測定葡萄酒中葡萄糖和果糖

HPLC及LC-MS技術(shù)在低聚糖檢測中的應(yīng)用

制氫方法及氫氣中微量雜質(zhì)的測定

綜合實驗室成功實施LIMS的關(guān)鍵-量身定制

大型儀器管理人員工作交接的實踐與探討

動態(tài)光散射激光粒度儀的特點及其應(yīng)用

TurboMatrix系列頂空進樣器的維修及保養(yǎng)

UltraPyc系列真密度分析儀在稠油密度測試中的應(yīng)用

便攜式氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析儀的研制及應(yīng)用

AutoTDA自動熱脫附解吸儀及其應(yīng)用

全自動凱氏定氮儀簡介

環(huán)保部:公眾支持PM2.5納入空氣質(zhì)量標準

中微子超光速實驗結(jié)果獲“確認”質(zhì)疑仍存

靈敏度升十倍廉價石墨烯傳感器問世

科學家研制出萬能流感疫苗無需每年接種

我國工業(yè)排放氣制乙二醇技術(shù)獲突破

《現(xiàn)代科學儀器》征稿啟事

《現(xiàn)代科學儀器》關(guān)于論文中英文摘要的寫作要求

關(guān)于召開2012北京教育裝備展示會的通知

2011年《現(xiàn)代科學儀器》1～6期總目錄

復雜裝置環(huán)境側(cè)裝裝校系統(tǒng)碰撞檢測

第7篇：生物質(zhì)譜技術(shù)與方法范文

關(guān)鍵詞：農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全；檢測技術(shù)

目前我國農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)正處于由量變到質(zhì)變轉(zhuǎn)化的重要轉(zhuǎn)型期。農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全已成為影響農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展的重要問題。建立農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量技術(shù)體系可以發(fā)揮重要的作用。農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量技術(shù)體系由農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測檢驗技術(shù)和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全追溯技術(shù)組成。其中，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測檢驗技術(shù)是評價農(nóng)產(chǎn)品安全的重要依據(jù)。

一、無損檢測技術(shù)（NDT）

利用農(nóng)產(chǎn)品內(nèi)部結(jié)構(gòu)異?；蛉毕荽嬖谒鸬膶?、聲、光、電、磁等反應(yīng)的變化，來探測各種農(nóng)產(chǎn)品的缺陷。并對缺陷的類型、性質(zhì)、數(shù)量、形狀、位置、尺寸、分布及其變化做出評價。

二、食品微生物檢驗技術(shù)

1.農(nóng)藥殘留的快速檢測技術(shù)

（1）化學快速檢測技術(shù)：該技術(shù)主要用于果蔬中有機磷的檢測，利用有機磷農(nóng)藥在金屬催化劑作用下水解為磷酸與醇，水解產(chǎn)物與檢測液反應(yīng)，檢測液的紫紅色褪去成無色，如“速測靈”。

（2） 酶抑制技術(shù)：根據(jù)有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對乙酰膽堿酯酶的特異性生化反應(yīng)建立起來的農(nóng)藥殘留的微量與痕量快速檢測技術(shù)。

（3）免疫技術(shù)：有些發(fā)達國家如美國、德國等已開發(fā)出有機磷類、氨基甲酸酯類、硫代氨基甲酸酯類、有機氯類、三嗪類、擬除蟲菊酯類和酰胺類等幾十種農(nóng)藥的酶免疫商品檢測試劑盒應(yīng)用。

2.獸藥殘留的快速檢測技術(shù)。主要有酶聯(lián)免疫法（ELISA）、放射免疫方法、膠體金試紙條和蛋白芯片。幾種方法中ELISA 方法為定量方法，其利用標記物的酶催化底物顯色反應(yīng)來反映抗原抗體的結(jié)合過程，將酶催化底物的靈敏性與抗原抗體的特異性相結(jié)合。

放射免疫檢測法是采用同位素標記技術(shù)來檢測抗原抗體的高靈敏度方法，其最成功的是美國CHARM Science公司Charm6600/7600 抗生素快速檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用專一性受體來識別同一類抗生素中的母環(huán)，并以最快速度檢測同一抗生素族在樣品中的殘留情況。

試紙條方法因靈敏度低，特異性差，僅適合殘留限量要求不高的少數(shù)藥物的粗篩。蛋白芯片可用于多殘留檢測，但是靈敏度需進一步提高。

3.光譜分析儀器。光譜分析儀器主要是對農(nóng)產(chǎn)品中重金屬元素含量進行分析檢測。已研制出的氣相色譜-原子吸收光譜（GC-AAS）聯(lián)用儀器，進一步拓展了原子吸收光譜法的應(yīng)用領(lǐng)域。

三、色譜及質(zhì)譜分析儀器

1.氣相色譜法（GC）。目前約80%的農(nóng)藥可用氣相進行分析，如農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、氨基酸等。ECD檢測器測定含氯化合物；TSD檢測器測定含硫、磷化合物；PFPD檢測器測定含硫、磷、氮、鉛、砷、錫等有機化合物。

二維氣相色譜（GC-GC）分析技術(shù)，利用兩根極性不同的色譜柱，待混合物在第一根色譜柱上預(yù)分離后，將需要進一步分離的待測組分轉(zhuǎn)移到第二根色譜柱進行更有效的分離?？梢蕴岣咿r(nóng)產(chǎn)品復雜基質(zhì)中農(nóng)藥多殘留分析的能力有重要意義。

2.高效液相色譜法（HPLC）。世界上幾百萬種化合物有80%可用HPLC進行分析。其在農(nóng)產(chǎn)品的污染物、營養(yǎng)成分、添加劑、毒素、保健品的有效成分、核酸、農(nóng)獸藥殘留等檢測方面得到充分應(yīng)用。借助于傳統(tǒng)HPLC理論及原理，涵蓋小顆粒填料、非常低系統(tǒng)體積及快速檢測手段等全新技術(shù)，出現(xiàn)了超高效液相色譜（UPLC）。

3.色譜-質(zhì)譜分析法。質(zhì)譜儀（MS）在農(nóng)產(chǎn)品安全分析中能夠定性或定量地檢測出其中揮發(fā)性成分、糖類組成、氨基酸（蛋白質(zhì)）、香味成分及有毒有害物質(zhì)等成分。

（1）氣-質(zhì)聯(lián)用（GC-MS或GC-MS-MS）。GC-MS法不僅依據(jù)樣品中待測組分在圖譜上的保留時間，更主要是依據(jù)在此保留時間內(nèi)殘留農(nóng)藥裂解的特征離子碎片，由質(zhì)譜儀按其分子量和分子結(jié)構(gòu)對農(nóng)藥進行準確定性，并以此為定量依據(jù)，從而克服因未凈化掉的雜質(zhì)峰與農(nóng)藥保留時間重疊而造成的將雜質(zhì)峰誤判為農(nóng)藥的缺點。

（2）液-質(zhì)聯(lián)用（LC-MS或LC-MS-MS）。獸藥多殘留分析以LC-MS-MS分析為主。它能有效地測定待測物中的痕量組分，能很好分析非揮發(fā)性農(nóng)藥殘留物、糖類等物質(zhì)。同時使用LC-MS-MS可克服背景干攏，通過MS-MS的選擇反應(yīng)控制模式（SRM）或多反應(yīng)檢測模式（MRM），提高信噪比，故對復雜樣品可達到很高的靈敏度。

（3） UPLC-MS-MS技術(shù)。UPLC與質(zhì)譜聯(lián)用不僅獲得高速、高分離度，而且顯著地提高質(zhì)譜檢測的靈敏度。UPLC-MS-MS可在更短的時間內(nèi)、以更高分離度獲得更高靈敏度的、更高置信度的檢測結(jié)果。τ謔稱泛團┎品中氯霉素、硝基呋喃及其代謝產(chǎn)物、蘇丹紅、孔雀石綠、丙烯酰胺、D-內(nèi)酰胺、氟喹諾酮等多種藥物殘留和農(nóng)藥殘留及其代謝產(chǎn)物等的分析，UPLC-MS-MS皆可體現(xiàn)其快速、靈敏的明顯技術(shù)優(yōu)勢。

四、前處理

由于農(nóng)產(chǎn)品基體復雜，有害污染物含量極其微量，同時各種標準對待測物最大殘留的檢出限提出了更嚴格的要求，而我國傳統(tǒng)的樣品前處理技術(shù)已成為瓶頸，故一些前處理新技術(shù)相繼出現(xiàn)并很快得到推廣，如固相萃取技術(shù)（SPE），固相微萃?。⊿PME），基質(zhì)固相分散萃取（MSPDE）， 超臨界流體萃?。⊿FE），凝膠滲析萃取（GPC）。

最新的PrepLinc Platform樣品前處理平臺系統(tǒng)，融合了GPC樣品凈化技術(shù)、SPE固相萃取技術(shù)和全自動定量濃縮技術(shù)，并將其有機地結(jié)合起來，使樣品可按預(yù)設(shè)的程序自動完成GPC樣品凈化，SPE凈化及濃縮、定容及溶劑轉(zhuǎn)換功能。此外微波萃取、微孔液膜萃取、納米富集材料等新技術(shù)及全自動加溫加壓快速溶劑萃取等，都將在未來農(nóng)產(chǎn)品、食品安全的檢測中發(fā)揮作用。

五、結(jié)論與展望

由于航天科技、生命科學、軍事、反恐和環(huán)保等領(lǐng)域的迫切需求，近幾年來儀器微型化、全微分析、芯片技術(shù)等發(fā)展極快，出現(xiàn)了鞋盒大小的微型質(zhì)譜、微型色譜、芯片毛細管電泳儀、陣列傳感器和生物芯片。新儀器、新方法的不斷開發(fā)，必將使這些新技術(shù)延伸和擴散到食品安全檢測領(lǐng)域，催生出新一代方法和儀器，既具有大型分析儀器的靈敏度、檢出限，又便于使用和攜帶。

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第8篇：生物質(zhì)譜技術(shù)與方法范文

【關(guān)鍵詞】電感耦合；離子體質(zhì)譜法；金屬元素

金屬元素是人體必不可少的重要組成成分，但是部分金屬元素超過一定濃度時，可引起中毒。職業(yè)人群生物樣品檢驗?zāi)軌蜉^為準確地提供勞動者的實際接觸水平，有毒物質(zhì)的增高說明體內(nèi)的過度吸收，尿中元素的生物學水平是反映環(huán)境質(zhì)量和職業(yè)接觸的重要指標。目前國內(nèi)的標準分析方法多采用傳統(tǒng)的原子吸收，原子熒光，分光光度法等檢測方法，以上方法操作復雜，試劑繁多，需要逐一單項檢測。本文使用電感耦合等離子體質(zhì)譜法快速測定尿中釩、鉻、鈷、砷、鎘、鉛、鉈。該方法可同時測定多種元素，具有靈敏度高、檢出限低的優(yōu)點。

一、材料與方法

1.儀器與試劑

1.1儀器

（1）電感耦合等離子體質(zhì)譜儀 美國Agilent 7700X ICP-MS，碰撞/反應(yīng)池，自動進樣器，耐高鹽霧化器，鎳采樣錐和截取錐；

（2）超純水處理系統(tǒng) 美國Milli-Q，MILLIPORE公司。

1.2試劑與標準溶液

濃硝酸：68%（V/V），優(yōu)級純；單元素標準溶液：釩、鉻、鈷、砷、鎘、鉛、鉈（國家標準物質(zhì)物質(zhì)研究中心）；內(nèi)標溶液：用1.0%HNO3將釔（Y）、銦（In）、鈥（Ho）單元素標準溶液配制成1.0mg/L的混合內(nèi)標貯備液。

1.3儀器操作條件：射頻功率：1450kW；采樣深度：8.0mm；等離子體氣：15.0L/min；炬管水平位置：-0.5mm；輔助氣：0.25L/min；炬管垂直位置：-0.0mm；載氣：0.85L/min；掃描模式：Fullquant；積分時間：0.10s（AsHg為0.2s）；采集次數(shù)：3；提取透鏡1：2.0V；提取透鏡2 ：-105.0V。

1.4標準曲線的配制

準確量取釩（V）、鉻（Cr）、鈷（Co）、砷（As）、鎘（Cd）、鉈（TL）、鉛（Pb）的混合標準貯備液0.0mL、0.010mL、0.050mL、0.10mL、0.50mL、1.0mL置100mL容量瓶，用1% HNO3定容至刻度，配制成0.0?g/L、0.10?g/L、0.50?g/L、1.0?g/L、5.0?g/L、10.0?g/L標準曲線；用1.0%HNO3將內(nèi)標溶液稀釋成10.0?g/L的應(yīng)用液。

1.5樣品制備

用1%硝酸把尿樣稀釋20倍，直接進樣。

二、結(jié)果與討論

2.1前處理方法的選擇

取一份混合尿樣50mL，加入10.0 mg/L混合標準貯備溶液0.10mL，配制7種待測元素加標濃度為20.0?g/L的尿樣，分別采用三種前處理方法進行測定：

方法1：用1.0%HNO3將尿樣稀釋20倍后測定，標準曲線以1.0%HNO3為介質(zhì)；

方法2：用1.0%HNO3將尿樣稀釋10倍后測定，標準曲線以1.0%HNO3為介質(zhì)；

方法3：用0.5%NH3H2O將尿樣稀釋20倍后測定，標準曲線以0.5%NH3H2O為介質(zhì)；

結(jié)果表明，方法3的整體精密度較差，可能是因為有些元素與氨水形成的絡(luò)合物較難電離；方法2的尿砷回收率偏高，可能是因為尿樣的基體效應(yīng)使As的信號增強，而方法1前處理效果最好，因為尿樣稀釋倍數(shù)加大后，基體效應(yīng)減小，同時尿樣中的Cl 含量降低，40Ar35Cl對砷的干擾也減少，其各項性能指標均能滿足規(guī)范要求，因此我們選用方法1作為前處理方法。

2.2標準曲線和最低檢出濃度

ICP-MS具有7個數(shù)量級的線性范圍，因此實際應(yīng)用時可根據(jù)實際需求進行調(diào)整。本方法的線性范圍是結(jié)合待測元素的生物限值和本底值配制，各元素線性的相關(guān)系數(shù)和線性范圍如表2所示；將儀器調(diào)至最佳狀態(tài)，以研制的測定方法連續(xù)測定11次空白溶液，由測量值計算其濃度平均值和標準差，以標準差法計算各元素的檢出限（3SD）和定量限（10SD），以尿樣稀釋20倍計算其最低檢出濃度

2.3 精密度

將混合尿分成 4 組，每組100ml，其中 1 組為本底尿，其他 3 組分別加入鎘標準溶液（1.0mg/L ）0.25mL、0.50mL、1.0mL，加入鉛標準液（10.0mg/L ）0.20mL、0.50mL、1.0mL，加入釩、鉻、鈷、砷、鉈混合標準液（10.0mg/L ）0.10mL、0.20mL、0.50mL，配制成鎘的加標濃度為2.5?g/L、5.0?g/L、10.0?g/L，鉛加標濃度為20.0?g/L、50.0?g/L、100?g/L，其他待測元素加標濃度為10.0?g/L、20.0?g/L、50.0?g/L的低、中、高濃度尿樣；將上述加標尿樣在配制當天進行6次重復測定，作為批內(nèi)精密度，結(jié)果在1.69%～8.97%，3天內(nèi)進行6次測定，作為批間精密度，結(jié)果在1.69%～8.97%，如見下表3、表4。

2.4 準確度

分別測定待測元素配制成低、中、高濃度的尿樣，每組濃度測定3次，取平均值，減去空白本底后，分別計算每個元素的加標回收率在86.2%～105%，如表6所示。

用電感耦合等離子體質(zhì)譜法快速測定尿中釩、鉻、鈷、砷、鎘、鉛、鉈元素，簡便、快速、準確、靈敏度高、覆蓋元素種類多，合適人尿中微量元素的測定。采用1%硝酸稀釋尿樣直接進樣，簡化前處理過程，與碰撞池ICPMS技術(shù)結(jié)合，適用于尿樣中多種微量元素的快速測定。

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第9篇：生物質(zhì)譜技術(shù)與方法范文

關(guān)鍵詞:SELDI-TOF-MS;蛋白質(zhì)組學;診斷

中圖分類號:R2-03 文獻標識碼:A 文章編號:1673-7717(2010)01-0051-03

Application of SELDI-TOF-MS in Clinical Diagnosis

LIU Chibo,LIANG Yong,CHEN Jinguang,PAN Chunqin,YAN Dongliang,WANG Haibao,ZHOU Kaiyu

(Taizhou Municipal Hospital,Taizhou 318000,Zhejiang,China)

Abstract:The technique of surface-enhanced laser desorption/inionation-time of flight-mass spectrometry(SELDI-TOF-MS) provides the most effective platform for research of proteomics. SELDI-TOF-MS, which combine the technologies of proteinchip with time of flight-mass spectra and integrate separation, purification, analysis of sample and realize rapid, high performance and high throughput detection, is an extremely important tool for diagnosis of disease at the molecular level.

Key words:SELDI-TOF-MS; proteomics; diagnosis

蛋白質(zhì)組學(proteomics)技術(shù)是后基因組時代的一重要研究工具,在生命科學領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。蛋白質(zhì)組學是通過對不同時間和空間發(fā)揮特定功能的蛋白質(zhì)群體進行研究,闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達和功能模式,包括鑒定蛋白質(zhì)表達、存在方式(修飾形式)、結(jié)構(gòu)、功能及相互作用方式等,從機體或細胞的蛋白質(zhì)整體活動來揭示生命規(guī)律。而SELID蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一個新的蛋白質(zhì)組學技術(shù)。嚴格來說,SELDI技術(shù)是一種“比較”技術(shù),也是在現(xiàn)有蛋白質(zhì)組學技術(shù)中唯一在檢測樣本數(shù)量和每個樣本中蛋白質(zhì)數(shù)量兩方面達到高通量的技術(shù)。在過去幾年中,隨著儀器性能和相關(guān)技術(shù)方法的改進和探索,應(yīng)用SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)對腫瘤標志蛋白的研究獲得廣泛和迅猛發(fā)展。2004年以來,該技術(shù)在美國已被列入人類蛋白質(zhì)組計劃主要推薦技術(shù)之一。我國已有20余個單位開展此項研究。以下對SELDI質(zhì)譜技術(shù)的基本原理、優(yōu)點及在臨床診斷中的應(yīng)用前景進行綜述。

1 SELDI-TOF-MS原理

SELDI-TOF-MS技術(shù)結(jié)合了蛋白芯片和生物質(zhì)譜技術(shù),是繼基因芯片之后出現(xiàn)的新一代生物芯片技術(shù)。該芯片設(shè)計的基本原理是:首先用生物或化學方法在載體表面制成點狀芯池,再點入待檢的生物樣品,其中的蛋白分子通過其自身的生物或理化性質(zhì)(親水性、疏水性、金屬絡(luò)合及離子作用等)與芯片相結(jié)合,從而實現(xiàn)捕獲、保留和純化與之特異性結(jié)合的蛋白分子。接著用緩沖液洗脫未結(jié)合或非特異性結(jié)合的分子后再用激光脈沖進行轟擊,即釋放出靶點上的特異性蛋白分子。不同質(zhì)荷比(m/z)的離子在電場中飛行的時間長短不一,分子量越大的離子在電場中飛行的時間越長,反之則越短。最后通過生物質(zhì)譜(TOF-MS)即可繪制出一張質(zhì)譜圖。該圖經(jīng)分析軟件處理后還可形成模擬譜圖,用于更直觀地顯示樣品中各種蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量、含量及磷酸化位點等信息。蛋白質(zhì)芯片根據(jù)表面物質(zhì)的不同,可將其劃分為化學型和生物型兩類?；瘜W型芯片通過化學作用結(jié)合樣品中的蛋白質(zhì),并根據(jù)其作用原理的不同又可進一步細分為疏水性芯片、親水性芯片、陽離子芯片、陰離子芯片和金屬親和芯片等類型;生物型芯片則是把生物活性分子,如抗體、酶、受體、DNA等結(jié)合到芯片表面,借助抗原-抗體、酶-底物、受體-配體、蛋白質(zhì)-DNA等相互作用結(jié)合樣品中的蛋白質(zhì)。生物芯片特異性高,還可以進行蛋白質(zhì)定量。

2 SELDI-TOF-MS蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的優(yōu)點

相比傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組技術(shù),如二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-PAGE)、電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)、基質(zhì)輔助激光解吸離子飛行時間質(zhì)譜 (MALDI-TOF-MS)技術(shù),SELDI蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的優(yōu)勢在于:①可分析2D-PAGE無法分析的蛋白質(zhì),包括疏水性蛋白質(zhì),低分子量(

3 SELDI-TOF-MS技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用

3.1 在腫瘤特異性標志物的篩選中的應(yīng)用

3.1.1乳腺癌 Li等[1]用SELDI-TOF-MS技術(shù)及配套蛋白質(zhì)芯片檢測49例乳腺癌和37例非乳腺癌疾病患者的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜,并運用SPSS 10.0軟件判別分析處理數(shù)據(jù)和篩選標志物,建立了3個診斷模型。組合構(gòu)建的診斷模型Ⅰ包括6個蛋白質(zhì)峰,質(zhì)荷比分別為8611、16827、25711、28931、25485和2437,鑒別乳腺癌和非乳腺癌疾病的敏感性為81.6%,特異性為78.4%。組合的診斷模型Ⅱ也包括6個蛋白質(zhì)峰,其質(zhì)荷比分別為4470、10854、19193、3883、2011和7470,鑒別Ⅰ期乳腺癌與非乳腺癌疾病的敏感性為80.0%,特異性為89.2%。組合的診斷模型Ⅲ包括5個蛋白質(zhì)峰,其質(zhì)荷比分別為2726、27014、2247、4477和19333,鑒別Ⅰ期與Ⅱ～Ⅳ期乳腺癌的敏感性為91.2%,特異性為93.3%。Ricolleaun[2]等采用SELDI-TOF-MS技術(shù)分析了30例非結(jié)節(jié)性無再發(fā)乳腺癌患者和30例發(fā)生轉(zhuǎn)移性再發(fā)患者的病理標本,發(fā)現(xiàn)多達72個峰,其中兩個被證明是泛肽和鐵蛋白輕鏈(FLC)。進一步研究表明,細胞溶質(zhì)的泛肽水平增高和(或)FLC的水平下降可以很好地預(yù)示乳腺癌。

3.1.2胃癌 Liang等[3]在胃癌方面檢測了33例胃腺癌患者和31例健康者的血清蛋白質(zhì)組,建立了質(zhì)荷比分別為5910、5084、6640和8691的差異蛋白峰的胃癌特征性蛋白質(zhì)波譜模型,用該模型檢測的靈敏度為90.91%(30/33),特異性為93.55%(29/31),陽性預(yù)測值為93.75%(30/32)。Melle等[4]對74份包括胃癌組織、癌旁組織及正常胃上皮的冰凍切片進行分析,發(fā)現(xiàn)了一個在癌組織中明顯下調(diào)的蛋白,免疫組化鑒定為胃蛋白酶(原)C(pepsinogen c)。高春芳等[5]研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者與正常人在質(zhì)荷比為1723～14048間有18種血清蛋白質(zhì)含量有顯著差異,其中質(zhì)荷比為2786、2878、3170、13872、5257的5種蛋白質(zhì)組成的生物標志物可將正常人與胃癌患者準確地分組,其敏感性與特異性均高于用CEA診斷胃癌。Qian等[6]利用 SELDI-TOF-MS技術(shù)及生物標記軟件(BPS)發(fā)現(xiàn)了血清中16個有統(tǒng)計學意義的蛋白質(zhì)峰,其中9個峰在胃癌患者中高表達。經(jīng)過BPS分析,其中兩個峰組成的腫瘤標記物模型在診斷的敏感性、特異性及準確性均高于目前臨床上的血清標記物CEA、CA19-9和 CA72-4,尤其研究中的所有I/II期胃癌患者均被正確識別,但該診斷模型的臨床意義仍需大規(guī)模的研究來驗證。劉池波等[7]利用SELDI技術(shù)發(fā)現(xiàn)胃癌患者中一簇質(zhì)荷比在11.1～11.9KD的蛋白峰明顯高于健康者,經(jīng)蛋白質(zhì)組學技術(shù)鑒定該簇蛋白為血清淀粉樣蛋白A,可用于胃癌患者的早期診斷、療效觀察。

3.1.3 前列腺癌 Pant等[8]使用SELDI-TOF-MS技術(shù)。對83例前列腺癌 (PCA)患者和95例健康人血清標本進行了檢測比較。在PCA患者血清中有4種蛋白表達水平升高,8種蛋白表達水平降低,出現(xiàn)了18個潛在的生物標記。選擇其中8個蛋白標記通過建立的五層決策樹分類系統(tǒng)鑒別診斷PCA和健康人,特異性為92.6%,敏感性為96.4%。Adamt等[9]為了尋找PCA特異蛋白標記物,設(shè)定了3組研究對象(PCA患者167例,良性前列腺增生患者77例,年齡匹配健康男性82例),使用SELDI-TOF-MS進行血清檢測,在PCA患者中發(fā)現(xiàn)9個蛋白質(zhì)峰與正常人及前列腺增生患者不同。以檢測到的9個蛋白質(zhì)峰為分析依據(jù),結(jié)果腫瘤組檢測敏感性為83%,對照組特異性為97%,對試驗組的陽性預(yù)測值為96%,合并試驗組分析(PCA和非癌組)的陽性預(yù)測值為9l%。研究者認為,SELDI-TOF-MS和五層決策樹分類系統(tǒng)對于PCA的早期診斷是一種高準確性和創(chuàng)新性的方法。

3.1.4肝癌 Wang[10]等將106份血清樣本(包括52例肝細胞癌患者、22例肝硬化患者和32例健康志愿受試者血清)隨機分成兩組。訓練組包括35例肝細胞癌患者、14例肝硬化患者和。21例健康受試者血清,用以建立人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)模型;試驗組包括17例肝細胞癌患者、8例肝硬化患者和11例健康受試者血清。采用SELDI-TOF-MS技術(shù)對訓練組56例樣本(35例肝細胞癌患者、21例健康受試者血清)分析后獲得241個蛋白質(zhì)峰,其中21個峰用于肝細胞癌和正常對照比較(P

3.2在男性不育相關(guān)領(lǐng)域疾病研究方面的應(yīng)用

楊歡等[11]利用H4、SAX2等芯片鑒定出幾個在少精癥患者異的生物標志物,如在H4芯片上,少精癥患者精漿與生育男性精漿蛋白質(zhì)圖譜比較,有1處蛋白質(zhì)峰明顯增高,其相對分子質(zhì)量為11507.4,有1處蛋白質(zhì)峰明顯降低,其相對分子質(zhì)量為11022.9,在SAX2蛋白質(zhì)芯片上,少精癥患者精漿與生育男性精漿蛋白質(zhì)圖譜相比有1處蛋白質(zhì)峰明顯增高,其相對分子質(zhì)量為16751.6。由此,可根據(jù)患者精漿中的差異蛋白含量可來幫助鑒定是否患有少癥。白潔等[12]利用CM10芯片通過無癥組與正常組比較有28種蛋白質(zhì)表達存在差異,差異的蛋白質(zhì)中有24種含量低于正常組,其中4個M/Z在7 196.058、7 630.573、7 547.610和7 709.833的蛋白質(zhì)差異極顯著(P

3.3在膝骨性關(guān)節(jié)炎不同中醫(yī)證型領(lǐng)域研究中的應(yīng)用

王海寶[13]應(yīng)用CM10蛋白芯片分析了30例肝腎虧虛型膝骨性關(guān)節(jié)炎患者、35例氣滯血瘀型膝骨性關(guān)節(jié)炎患者血清和40例健康著血清的蛋白指紋圖譜,獲得的蛋白質(zhì)譜采用Biomarker Wizard和Biomarker Pattern軟件分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝腎虧虛型膝骨性關(guān)節(jié)炎患者與健康者血清蛋白質(zhì)譜相比有18個顯著差異蛋白質(zhì)(P

4展 望

蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是近年來興起的的一種蛋白質(zhì)組學研究的新方法,以質(zhì)譜分析替代傳統(tǒng)的免疫診斷也是一種新出現(xiàn)的疾病診斷模式,以SELDI質(zhì)譜蛋白質(zhì)芯片技術(shù)為尋找疾病標志物建立了一個良好的技術(shù)平臺,其快速、高通量、準確的特點已經(jīng)被廣泛的認同。隨著這項技術(shù)逐漸推向臨床,也發(fā)現(xiàn)這項技術(shù)尚待完善,如差異蛋白的在線鑒定問題;如圖譜中的峰高和蛋白質(zhì)濃度之間的關(guān)系并非都是線性的;不同的研究者,由于檢測過程中諸多因素的控制不一,對同種疾病得到的具有區(qū)分作用的峰是有差異的。所以 SELDI-TOF-MS要全面應(yīng)用于臨床研究,還需要在標準化、定性等問題上深入研究,在今后的實踐過程中還有很多的問題需要解決,但SELDI-TOF-MS技術(shù)必將成為快速診斷、發(fā)現(xiàn)并鑒定腫瘤標志物的有效手段。

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