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關(guān)鍵詞:胃卡他;胃腸炎;腺炎;灌腸療法;喂養(yǎng)護(hù)理要點(diǎn)
中圖分類號(hào):S858.292 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A
1.緒論
犬的消化系統(tǒng)疾病是最常見而最重要的犬類疾病,而這其中大多疾病都是由于其主人缺乏科學(xué)合理的營(yíng)養(yǎng)、喂養(yǎng)、護(hù)理知識(shí)而引起的。尤其是在愛犬患病或病愈恢復(fù)過程中,犬的消化功能。必然受到了很大的削弱。由于胃腸功能的削弱及紊亂,犬機(jī)體所攝入的營(yíng)養(yǎng)必然減少,容易對(duì)機(jī)。體產(chǎn)生各種不利的影響。
2.犬易發(fā)的三種消化系統(tǒng)疾病
犬病門診中,消化系統(tǒng)疾病最為多見,現(xiàn)結(jié)合臨床實(shí)踐,介紹犬易發(fā)的胃卡他、胃腸炎、腺炎三種疾病。
2.1胃卡他
胃卡他是指胃粘膜表面的炎癥,臨床以嘔吐、胃痛、脫水為特征,常呈急性經(jīng)過。
2.1.1病因
多因一次性過食難以消化的食物或采食了污穢、腐敗的食物,或食物過冷過熱,或喂給刺激性藥物引起。也可繼發(fā)于某些傳染病、寄生蟲病等。
2.1.2癥狀
病犬精神沉郁,食欲減退或廢絕,飲欲增加,但喝后即吐,嘔吐頻繁,初吐食糜,以后吐出帶泡沫的粘液。弓背,觸壓腹前部胃區(qū)敏感疼痛,常伸展前肢臥于冷暗處,眼淚增加,舌苔黃白,口臭。嘔吐嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)眼球凹陷、皮膚彈性降低等脫水癥狀。
2.1.3治療
保護(hù)胃粘膜,消除炎癥,糾正脫水及酸堿平衡紊亂。
①禁食。由食物原因引起的胃卡他,應(yīng)禁食24小時(shí)并限制飲水,24小時(shí)后,只給少量溫水、稀飯、溫奶等。
②對(duì)癥治療。維持消化機(jī)能可肌注維生素B100毫克/次,止吐可肌注胃復(fù)安2~4毫升/次,解痙止痛可肌注鹽酸山莨菪堿(654-2)1毫克/公斤體重。脫水嚴(yán)重者,靜脈注射5%葡萄糖生理鹽水50~80毫升/公斤體重,維生素C 0.5克/次,維生素B2毫升,每天1~2次。
③抗菌消炎。肌注慶大霉素或氨芐青霉素1萬~2萬單位/公斤體重,地塞米松2~4毫克/次。也可并用犬病消,0.3~0.4毫升/公斤體重。
④健胃。病情好轉(zhuǎn)后,可口服多酶片1~2片/次,中藥保和丸1~2丸/次。
2.2胃腸炎
胃腸炎為胃和小腸粘膜及粘膜下組織的重劇炎癥,以腹瀉、腹痛、發(fā)熱、毒血癥為特征。臨床上多見粘液性、出血性胃腸炎。
2.2.1病因
原發(fā)性胃腸炎由單純的胃腸卡他發(fā)展而來,如采食了發(fā)霉變質(zhì)的肉類、魚類,很快發(fā)生腹痛、腹瀉、發(fā)熱等癥狀。B族維生素缺乏,機(jī)體抵抗力降低,外感風(fēng)寒也可引起。繼發(fā)性胃腸炎可見于某些病毒?。ㄈ缛翢?、犬細(xì)小病毒?。?、細(xì)菌?。ㄈ绱竽c桿菌病、沙門氏桿菌?。?、寄生蟲?。ㄈ缃{蟲、蛔蟲感染)以及濫用抗生素等。
2.2.2癥狀
病初呈急性胃腸卡他癥狀,以后呈胃腸炎癥狀。病犬精神不振,食欲廢絕,嘔吐喜飲,飲后即吐。發(fā)展為腸炎時(shí),表現(xiàn)頻繁水樣下痢,并混有粘液、血液,體溫升高到40~40.5℃,松弛,排便失禁。隨腹瀉的發(fā)展,病犬眼球下陷,皮膚彈性降低,結(jié)膜發(fā)紺,出現(xiàn)脫水和酸中毒癥狀。
2.2.3治療
排除病因,采取綜合治療措施。
①飲食療法。禁食24小時(shí),只給少量口服補(bǔ)液鹽飲水,配方為氯化鈉3.5克、碳酸氫鈉2.5克、氯化鉀1.5克、葡萄糖20克、水1000毫升,混合溶解,每次每公斤體重50~100毫升,飲服或灌服。
②對(duì)癥治療。止吐:胃復(fù)安10毫克/次,肌注;止血:止血敏15~20毫克/公斤體重,肌注;增強(qiáng)抵抗力:維生素B100毫克/次,維生素C0.5克/次,肌注;久瀉不止:口服復(fù)方苯乙哌啶片2.5毫克/次,一日2~3次。
③強(qiáng)心,補(bǔ)液,防止酸中毒。5%葡萄糖生理鹽水50毫升/公斤體重,50%葡萄糖10~20毫升,維生素C0.5克,鹽酸山莨蓉堿1毫克/公斤體重,混合靜注。心衰時(shí)加入10%安鈉咖0.5~2毫升。伴隨酸中毒時(shí),可將5%碳酸氫鈉注射液按3~5毫升/公斤體重用5%葡萄糖稀釋至1.25%,靜脈注射。
2.3腺炎
是犬腺排泄管阻塞,分泌物積聚,發(fā)生感染而引起的炎癥。
2.3.1病因
犬腺位于內(nèi)外括約肌之間的腹側(cè),呈球形,直徑約1厘米,左右各1個(gè)。腺以2~4厘米長(zhǎng)的管道開口于粘膜與皮膚交界處,相當(dāng)于時(shí)鐘4點(diǎn)和8點(diǎn)的位置,將犬尾提起易看到。其分泌物為灰色或褐色油脂狀,具強(qiáng)烈臭味。當(dāng)腺過度分泌時(shí),腺導(dǎo)管阻塞或括約肌功能不良,均易致腺體內(nèi)分泌物滯留,引起感染、發(fā)炎、腫脹。
2.3.2癥狀
早期患犬表現(xiàn)不安,食欲減少或廢絕,不斷回頭試圖啃、舔部位,或后軀坐地有擦肛動(dòng)作。有的病犬排糞困難,不時(shí)努責(zé)但僅能排出少量干硬糞便。日久則紅腫,向外突出,流灰褐色液體,附近有多量灰褐色分泌物附著。擠壓腺,可從中排出多量灰褐色液體,有的呈化膿性感染,形成膿腫,易破潰與外界相通。
2.3.3治療
徹底擠出腺內(nèi)液體,并用生理鹽水或0.1%高錳酸鉀溶液反復(fù)沖洗,然后注入青霉素溶液10萬~20萬單位。也可用慶大霉素8萬單位、2%鹽酸普魯卡因4毫升混合注入腺內(nèi)。配合肌注清開靈、犬病康等,效果更好。
3、巧用灌腸療法治療犬消化系統(tǒng)疾病
在寵物治療中最多碰到是犬的消化系統(tǒng)疾病,針對(duì)病情采用的簡(jiǎn)單的灌腸法可收到了不錯(cuò)的效果。
3.1灌腸療法的適用范圍
①犬表現(xiàn)為上吐下瀉,糞便帶血腥臭等腸胃炎癥狀時(shí),可以應(yīng)用灌腸療法進(jìn)行治療,排除稀糞,清空腸道,直腸直接給藥。
②犬發(fā)生大便干燥,排便困難等糞便秘結(jié)時(shí),可應(yīng)用灌腸治療軟化糞便,腸道。
③犬表現(xiàn)強(qiáng)烈的嘔吐,食欲廢絕,按壓腹壁可以摸到香腸狀的有彈性的硬物等腸套疊癥狀時(shí),可以用深部灌腸法來治療。
④在犬口服給藥困難的情況下,可以用直腸灌腸進(jìn)行給藥。
3.2具體操作方法
取輸液空瓶一只,內(nèi)裝溫?zé)醄35度左右]的灌腸液,安裝上輸液器,把輸液器下方的連接頭剪去,將塑料管的端插入人用14號(hào)導(dǎo)尿管中。打開輸液開關(guān),檢查插頭處是否漏水,如有漏水,可將塑料管再向內(nèi)插緊,關(guān)上輸液開關(guān)。
將犬俯臥保定在治療臺(tái)上,把治療臺(tái)的后兩只腿墊起,使犬呈前低后高的。如果犬較為馴服,可讓其站立進(jìn)行灌腸。剪去犬周圍的污濁被毛,把導(dǎo)尿管的圓頭端從插入,邊插邊放液,以腸道易于插入。盡量多地插入導(dǎo)尿管,尤其是作保留灌腸時(shí),利于藥物深入腸管。如發(fā)現(xiàn)堵塞,可來回抽動(dòng)導(dǎo)尿管,或讓犬將積糞排除后再繼續(xù)灌腸。
作用是通便驅(qū)氣和清潔腸道。灌腸溶液較大,一般一次用量250-1000毫升[根據(jù)犬體形大小而定],常將溶液瓶抬高,使罐入壓力增大,灌腸速度較快。灌完后立即讓犬排泄。
3.2.1留液灌腸法
作用是輸入治療藥物,補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或軟化硬結(jié)的糞便,灌腸速度不宜過快,溶液量不宜過大,灌完后仍保持前低后高的,并用犬尾根堵塞一段時(shí)間。在做輸入藥物和補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的保留灌腸之前,最好先用溫水進(jìn)行洗腸,將積糞排出。
3.2.2常用的灌腸溶液
①生理鹽水刺激性輕,可用于腸道有疾患的清腸通便。
② 0.1%-0.2%肥皂水(在開水中加入肥皂至乳白色為止),用于手術(shù)前清腸或分娩前催產(chǎn),同時(shí)可起驅(qū)氣作用。
③松節(jié)油溶液(松節(jié)油4毫升加入500毫升肥皂水?dāng)噭颍?,可以?qū)出腸內(nèi)積氣。
3.2.3留液灌腸的灌腸液
①在生理鹽水中加入抗菌消炎藥物,可以治療急慢性腸炎。
②30-60毫升甘油或植物油,加溫水至100-200毫升[盛和林等編著:哺乳動(dòng)物學(xué)概論,華東師范出版社,1985];用5%硫酸鎂30毫升、甘油60毫升,加入90毫升溫水配制成1:2:3灌腸液;用食鹽10克溶于100毫升溫水中,配制成10%高滲鹽水,可以用來軟化糞便,腸道,促使積糞排出。
③5毫升地塞米松、10毫升安痛定、40毫升魚腥草,加生理鹽水100毫升,配制成混合溶液,可以用來治療犬的各種高熱,能起到迅速退熱的作用。
④生理鹽水200毫升加入安乃近5毫升或加入0.5%阿托品1毫升,深部灌腸,可治療早期的腸套疊,緩解腸痙攣,減輕疼痛,充盈腸管,可使套疊的腸管復(fù)位。
4、預(yù)防犬消化系統(tǒng)疾病的常識(shí)
犬的消化系統(tǒng)疾病是最常見而最重要的犬類疾病,而這其中大多疾病都是由于其主人缺乏科學(xué)合理的營(yíng)養(yǎng)、喂養(yǎng)、護(hù)理知識(shí)而引起的。尤其是在愛犬患病或病愈恢復(fù)過程中,犬的消化功能 必然受到了很大的削弱。由于胃腸功能的削弱及紊亂,犬機(jī)體所攝入的營(yíng)養(yǎng)必然減少,容易對(duì)機(jī) 體產(chǎn)生各種不利的影響。因此,主人在平時(shí)的喂養(yǎng)管理、患病期間及恢復(fù)過程應(yīng)注意以下幾點(diǎn):
4.1健康犬只平時(shí)的喂養(yǎng)管理要點(diǎn)
4.1.1幼犬(出生-8月齡)
剛出生的幼犬由于其消化器官還未完全發(fā)育成熟,其消化能力極其有限,胃腸只能消化母乳。因而1月齡以內(nèi)的幼犬最好喂母乳。在喂乳時(shí)可加入少許酵母片的水溶液,以幫助幼犬更好地消化吸收母乳。同時(shí),喂母乳宜分多次進(jìn)行,一般每天可以分6~8次喂食。
為了你的幼犬健康,請(qǐng)堅(jiān)持母 乳哺乳幼犬原則。小犬?dāng)嗳楹螅渖眢w的生長(zhǎng)發(fā)育,尤其是自身骨骼、牙齒的生長(zhǎng)形成往往需要充足而均衡的營(yíng)養(yǎng)。特別是對(duì)蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、微量元素及維生素等的需求較迫切,這些物質(zhì)需求的滿足與否會(huì)直接關(guān)系其日后能否長(zhǎng)成一條健康體美的成犬。
普通的食物則很難完全搭配滿足到幼犬的營(yíng)養(yǎng)需要,這就需要給你的愛犬提供專門配置的優(yōu)良犬糧了。因此,市面提供的各種專業(yè)特制的幼犬糧不妨用間隔搭配的方法喂給犬。這對(duì)減少幼犬胃腸道疾病和日后更好、更快的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生極為重要的作用。
此外,該時(shí)期幼犬的胃腸道疾病也可能由體內(nèi)腸道寄生蟲和感染外界的細(xì)菌、病毒引起。最常見的腸道寄生蟲是蛔蟲、鉤蟲和鞭蟲,因而每月定期預(yù)防性驅(qū)蟲是必要的。而細(xì)菌性胃腸道病則多是在機(jī)體勞累、衰弱、抵抗力下降時(shí),被致病性菌種經(jīng)污染的食物、呼吸道等途徑入侵感染而致病的。因而,在日常喂養(yǎng)管理上應(yīng)盡量保持犬食的清潔衛(wèi)生,喂食時(shí)要做到定時(shí)、定量、定質(zhì)的原則。對(duì)于病毒性胃腸道疾病,免疫接種是最安全和有效的預(yù)防解決辦法。一般確認(rèn)有效的免疫 程序是在小犬滿2個(gè)月齡的時(shí)候進(jìn)行首次免疫接種疫苗,必要時(shí)可以21日的間隔時(shí)段再注射2針,以確保幼犬獲得足夠的機(jī)體保護(hù)力。
許多其它因素也會(huì)直接或間接地誘發(fā)消化道的疾病,因而主人應(yīng)盡量避免犬只受到這些因素的影響。最常見是因天氣突然變化、洗澡或吹冷氣等引起的受凍感冒,又或者是食物轉(zhuǎn)變過快引發(fā)的胃炎。幼犬的食物應(yīng)盡量煮熟后方可食用,食用時(shí) 可加入些許含碘食鹽,以幫助其調(diào)節(jié)胃口。切記不要讓犬吃生雞蛋、生肉、生肝及油膩的食物。
4.1.2成犬(8月齡-5歲)
對(duì)于生長(zhǎng)的犬來說,其消化功能日趨完善,有較強(qiáng)的消化吸收能力,故其消化道疾病發(fā)病率也逐漸降低,但犬主也不應(yīng)因此而放松對(duì)愛犬的護(hù)理。這個(gè)時(shí)期的胃腸道疾病多是繼發(fā)于一些傳 染病或內(nèi)科病,例如:由于主人粗心喂了大塊骨頭而導(dǎo)致便秘或腸梗塞,犬細(xì)小病毒病引起出血 性腸食炎,過引起反復(fù)性胃腸炎等。
4.1.3老年犬(5歲以上)
當(dāng)你的伴侶動(dòng)物進(jìn)入了老年期,它的消化、吸收能力將大大減退。同時(shí)伴隨其牙齒的磨損、脫落,食物若過難咀嚼完全則會(huì)對(duì)其消化系統(tǒng)增加負(fù)擔(dān)而導(dǎo)致胃腸道疾病的發(fā)生。老年犬易發(fā)生 便秘和消化不良等胃腸道功能紊亂疾病。為了避免這些疾病,對(duì)老年犬的喂養(yǎng)宜定時(shí)、少量,食 物要保證衛(wèi)生干凈、易消化。特別要注意多吃一些富含維生素及微量元素的物質(zhì),例如水果、鈣 片、肝臟等。尤其要注意的是讓老年犬多些運(yùn)動(dòng)和提供充足的飲水。
4.2患有消化道疾病或病愈恢復(fù)期的犬只的喂養(yǎng)護(hù)理要點(diǎn)
①給予容易消化的流體食物,如:稀肉粥,肝臟拌稀飯,菜肉湯等。
②適當(dāng)在犬食中加入少量健胃消食的保健性藥物或一些維生素,如:酵 母片、維生素 C片、魚肝油丸等。
③盡量避免過食,不要給予高脂肪、高蛋白,難以消化和加重胃腸負(fù)擔(dān)的食物。
④每天喂食要少量多餐,同時(shí)要努力做到定時(shí)、定量、定質(zhì)的大原則。
⑤患病期間應(yīng)盡量減少洗澡的次數(shù),以及加強(qiáng)保溫護(hù)理工作。
⑥患便秘的犬只應(yīng)給予充足的飲水和運(yùn)動(dòng),以促進(jìn)胃腸的蠕動(dòng)、排空,減少食物在胃 腸內(nèi)的積壓負(fù)擔(dān)。
⑦主人要多留意患病犬的飲食次數(shù)、食量、飲食欲,以及排便或尿的次數(shù)及其性狀。
參考文獻(xiàn)
[1]施新猷.醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1980..
[2]施新猷編:現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在醫(yī)學(xué)科學(xué)研究上的應(yīng)用[M].北京:中國(guó)醫(yī)科大學(xué),1982.
[3]徐叔云.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1982.
[4]侯燦著.醫(yī)學(xué)科學(xué)研究入門[M].上海:上??茖W(xué)技術(shù)出版社,1981.
[5]丁道芳,劉思誠(chéng)編著.醫(yī)學(xué)科學(xué)研究入門[M].北京:人民衛(wèi)生出版社.
[6]獸醫(yī)大學(xué).獸醫(yī)臨床處于手冊(cè)[M].東北:吉林人民出版社,1965.
[7]第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)論文集[A].第四軍醫(yī)大學(xué),1986.
[8]上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心等編.現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)講座匯編[C].上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)研究會(huì),1985.
[9]盛和林等.哺乳動(dòng)物學(xué)概論[M].四川:華東師范出版社,1985.
[10]南開大學(xué)生物系中草藥生物教研室.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物解剖[M].北京:人民教育出版社,1980.
[11]林熙.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的育種繁殖[M].上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)條件處[M].1982.
[12]魏文漢.病理生理學(xué)[M].上海:上??茖W(xué)技術(shù)出版社,1984.
[13]修瑞娟.微循環(huán)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程分冊(cè).1981,4(1):1,
關(guān)鍵詞 Mef2;原核表達(dá);多克隆抗體
中圖分類號(hào) R39211 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 10002537(2012)05006404
Mef2屬于MADS家族轉(zhuǎn)錄因子基因,MADS家族是指其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域含有高度保守的MADS結(jié)構(gòu)域的一類轉(zhuǎn)錄因子的總稱[1].MADS結(jié)構(gòu)域是一種DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,由55~63個(gè)氨基酸組成,所識(shí)別并結(jié)合的DNA保守序列為CArG框[CC(A/T)6GG].
Mef2位于果蠅2號(hào)染色體上,mRNA全長(zhǎng)5 990 bp,編碼501個(gè)氨基酸.脊椎動(dòng)物有4種MEF2蛋白(MEF2AD),而果蠅中只有1種MEF2蛋白(DMEF2)[2].不管是脊椎動(dòng)物還是果蠅中的MEF2蛋白都含有一個(gè)高度保守的MADS和MEF2結(jié)構(gòu)域,并且由它們來介導(dǎo)DNA結(jié)合、二聚作用、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的相互作用[3].
Mef2最初是在分化的肌肉細(xì)胞中作為一個(gè)肌肉特異結(jié)合的活性因子被鑒定的,1997 年卻發(fā)現(xiàn)Mef2基因在心臟發(fā)育的過程中起重要作用[4].在果蠅中,Mef2首先在原腸胚形成時(shí)在整個(gè)中胚層中表達(dá),隨著胚胎的發(fā)育,它的表達(dá)逐漸限制在體節(jié)、內(nèi)臟和心肌細(xì)胞中[56].鑒于Mef2基因在果蠅心臟發(fā)育的過程中起著重要的作用[7],所以制備一個(gè)特異性好的多克隆抗體尤其重要,對(duì)進(jìn)一步以果蠅為模型研究Mef2基因具有重要的意義.
1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑
大腸桿菌Rosseta菌種,pET28a菌種以及coli DH5α菌種為本實(shí)驗(yàn)室提供;限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ,DNA、蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量Marker,Tag DNA聚合酶購(gòu)自深圳晶美公司;pMD18T載體和連接酶購(gòu)自大連TaKaRa公司;UNIQ10柱式DNA 膠回收純化試劑盒購(gòu)自上海生工公司;質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司;Glutathione SepharoseTM 4B蛋白純化試劑盒購(gòu)自PIERCE公司;弗氏佐劑購(gòu)自Sigma公司;丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、IPTG(異丙基βD硫代半乳糖苷)等購(gòu)自上海Sangon公司;新西蘭大白兔購(gòu)自中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部.
1.2 引物設(shè)計(jì)與合成
從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ncbi.nlm.nih.gov)檢索出果蠅Mef2基因的序列,根據(jù)巢式PCR的原理利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)兩對(duì)引物:第一對(duì):DMef2S1:5′CGCCAGCTGCCGGAAATCCA 3′;DMef2A1:5′GCGTCTGCAGCGTGACCACT 3′.第二對(duì)(分別加入EcoR?、窈蚗ho Ⅰ酶切位點(diǎn)):DMef2S2:5′GAGAATTCATGGGCCGCAAA AAAATTCA 3′ EcoR?、?;DMef2A2:5′GGCTCGAGGTGGACTGGCCTGCAGCAGG 3′ Xho?、瘢?/p>
1.3 基因克隆和載體構(gòu)建
選取30只野生型果蠅,液氮冷凍30 min,用Trizol法提取總RNA[8],反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增,獲得firstchain cDNA.然后以firstchain cDNA為模板用第一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后以所得產(chǎn)物為模板,用第二對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到目的片段[9].目的片段經(jīng)純化后克隆入T載體,轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,酶切檢測(cè)篩選出陽性單克隆,經(jīng)測(cè)序鑒定后將DN段從pMD18TMef2質(zhì)粒上切下,連入pET28a載體(EcoRⅠ和XhoⅠ酶切線性化),得到陽性克隆,經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定后,得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET28aMef2.
1.4 Mef2融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化
pET28aMef2重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株Rosseta,篩選出陽性菌落,然后接種于LB 培養(yǎng)基(含100 mg/L 氯霉素,卡那霉素)37 ℃ 培養(yǎng)12 h左右,以1∶ 50轉(zhuǎn)接擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600達(dá)0.6,按0.1 mol/L 加IPTG,25 ℃誘導(dǎo),4、5、6、7 h各取1 mL菌液,確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間.
收集誘導(dǎo)后大腸桿菌,PBS漂洗后超聲裂解,離心取上清.4 ℃下與經(jīng)Binding Buffer漂洗活化后的NiIDA凝膠柱結(jié)合,Washing Buffer洗去雜蛋白,Elution Buffer洗脫目的蛋白,獲得純化的HisMef2融合蛋白,-80 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>
1.5 Mef2多克隆抗體制備
將純化后的HisMef2蛋白與弗氏完全佐劑按體積1∶ 1在注射器中推成乳劑,分散約12個(gè)點(diǎn)對(duì)同一新西蘭大白兔進(jìn)行背部皮下免疫注射.在第一次注射后14、21、28 d,將HisMef2蛋白按體積比1∶ 1與弗氏不完全佐劑在注射器中推成乳劑,進(jìn)行多次免疫.第35天主動(dòng)脈取血,靜置過夜(4 ℃),3 000 r/min離心處理10 min,取上清分裝保存(-80 ℃).
1.6 效價(jià)測(cè)定
獲得免疫兔血清后,用誘導(dǎo)的總蛋白進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗體效價(jià).將含pET28aMef2重組子的菌株在LB培養(yǎng)液中37 ℃培養(yǎng),將5 mL接種于200 mL新鮮培養(yǎng)基中,用IPTG在25 ℃條件下誘導(dǎo)5 h后,收集細(xì)菌,PBS重懸,然后用SDSPAGE電泳分離.將Mef2抗體分別以1∶ 100、1∶ 500、1∶ 1 000和1∶ 2 000的體積比稀釋后,以免疫前兔血清作為對(duì)照,采用Western blotting方法檢測(cè)抗體的特異性[10].
2 結(jié)果與分析
2.1 重組質(zhì)粒pET28aMef2的構(gòu)建與鑒定
將純化后的果蠅Mef2基因片段克隆到pMD18T載體中,經(jīng)測(cè)序鑒定與基因理論序列100%匹配,然后用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切,連入pET28a載體(EcoRⅠ和XhoⅠ酶切線性化),獲得重組質(zhì)粒pET28aMef2.經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒正確(圖1).
2.2 Mef2 融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化
將重組子轉(zhuǎn)入Rosseta感受態(tài)細(xì)胞中,以0.1 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),30 ℃條件下進(jìn)行時(shí)間梯度誘導(dǎo)1,2,3,4,5,6 h分別取樣檢測(cè)蛋白的表達(dá),結(jié)果(如圖2)顯示Mef2蛋白在誘導(dǎo)1 h后就開始表達(dá),隨著時(shí)間推移表達(dá)量增加,在3 h后趨于穩(wěn)定.
3 討論
為了以果蠅為模型進(jìn)一步研究Mef2基因的功能,本文通過試驗(yàn)獲得了Mef2原核表達(dá)融合蛋白,制備了高效價(jià)和特異性好的兔抗Mef2血清.在獲得融合蛋白的過程中,先通過軟件分析選取了親水性好而又含結(jié)構(gòu)域少的一段序列,為獲得特異性好的抗體提供了前提條件[12].在誘導(dǎo)蛋白的過程中,IPTG 的終濃度選取的是0.1 mmol/L ,蛋白表達(dá)量相對(duì)高,又不至于因IPTG 濃度太高對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生毒性作用,試驗(yàn)相對(duì)容易成功.
pET28a(+)載體是一種常用的原核表達(dá)載體,具有Kan抗性,質(zhì)粒大小為5.3 kb.載體的N端攜帶His標(biāo)簽、凝血酶基因及T7啟動(dòng)子標(biāo)簽序列;在C端具有His標(biāo)簽序列, pET28a(+)載體可在BL21(DE3)、Rosstea等表達(dá)菌株中高表達(dá)融合有His標(biāo)簽的蛋白,便于下游蛋白純化.pET28a這種載體沒有本身溶解性高的多肽融合蛋白,也沒有催化二硫鍵形成的酶融合蛋白,而且不含信號(hào)肽序列,所以同一種蛋白用這個(gè)載體,形成包涵體的可能性更大些[13].
本試驗(yàn)中,作者通過構(gòu)建pET28aMef2重組質(zhì)粒、誘導(dǎo)表達(dá)HisMef2融合蛋白獲得了高純度的蛋白并免疫新西蘭大白兔制備了Mef2抗體.通過效價(jià)檢測(cè)證明制備的Mef2多克隆抗體具有較好的特異性,能滿足試驗(yàn)要求. 因此,它為將來運(yùn)用染色質(zhì)免疫沉淀、免疫共沉淀、免疫組化等手段深入研究Mef2基因的功能奠定了基礎(chǔ).
參考文獻(xiàn):
[1] SOLER C, HAN J, TAYLOR M V, et al.The conserved transcription factor Mef2 has multiple roles in adult Drosophila musculature formation[J]. Development, 2012,139(7):12701275.
[2] MILLIGAN J N, JOLLY E R. Identification and characterization of a Mef2 transcriptional activator in schistosome parasites.[J]. PloS Negl Trop Dis, 2012,6(1):e1443.
[3] FLAVELL S W, COWAN C W, KIM T K, et al. Activitydependent regulation of MEF2 transcription factors suppresses excitatory synapse number[J]. Science, 2006,311(5763):10081012.
[4] BLANCHARD F J, COLLINS B, CYRAN S A, et al. The transcription factor Mef2 is required for normal circadian behavior in Drosophila[J]. J Neurosci, 2010,30(17):58555865.
[5] 吳秀山,袁婺洲,王躍群,等.心臟發(fā)育研究[M].長(zhǎng)沙:湖南科學(xué)技術(shù)出版社, 2004:214302.
[6] 吳秀山.心臟發(fā)育概論[M]. 北京:科學(xué)出版社, 2006:86103.
[7] WESSELLS R J, BODMER R. Agerelated cardiac deterioration: insights from drosophila?。跩]. Biosci, 2007,12:3948.
[8] WU X, GOLDEN K, BODMER R, et al. Heart development in drosophila requires the segement polarity genewingless?。跩]. Dev Biol, 1996,177:104116.
[9] LI S, ZHOU D Y, LU M M, et al. Advanced cardiac morphogenesis does not require heart tube fusion[J].Science, 2004,305(5690):16191622.
[10] 龔 琳,吳秀山,李永青,等.果蠅Nulp1特異性多克隆抗體的制備及檢測(cè)[J].湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào), 2011,34(4):6973.
[11] 閔 璐, 周云雷, 周 煌,等.lrrc10蛋白的表達(dá)、純化及多克隆抗體的制備[J].湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào), 2011,34(6):6871.
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