人類(lèi)口腔菌群研究中雙生子模型的進(jìn)展

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［摘要］人體內(nèi)有大量的微生物存在，且與人體的多種機(jī)能、代謝以及身體健康狀況、疾病等密切相關(guān)。不論是口腔疾病，還是全身的一些系統(tǒng)性疾病，其發(fā)生發(fā)展都與口腔菌群的定植、代謝、生長(zhǎng)、繁殖有關(guān)，因此對(duì)于口腔菌群的探索是研究口腔疾病及某些全身系統(tǒng)性疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。雙生子模型在遺傳方面具有特殊性，其組內(nèi)個(gè)體的遺傳背景高度一致，接觸環(huán)境也極其相似，可使研究的納入對(duì)象之間高度配對(duì)，從而能夠控制組內(nèi)變量，排除混雜因素，提高研究的可信度，在人類(lèi)菌群研究中有明顯的優(yōu)勢(shì)。目前，已有眾多學(xué)者通過(guò)雙生子模型證實(shí)了環(huán)境、遺傳等因素對(duì)人類(lèi)口腔菌群有一定的影響，從而為口腔及全身疾病的預(yù)防、治療提供了新的思路。本文就雙生子模型用于人類(lèi)口腔菌群研究的進(jìn)展情況作一綜述。

［關(guān)鍵詞］雙生子模型;口腔菌群;口腔疾病

人體攜帶著大量微生物，最新的研究估計(jì)，人體所攜帶的微生物數(shù)量與人體體細(xì)胞數(shù)目的比值約為1∶1［1］;并經(jīng)大量研究發(fā)現(xiàn)，這些微生物與人體健康和疾病均有著密切的聯(lián)系。口腔微生物不僅影響著口腔健康，導(dǎo)致齲病、牙周病等菌斑性疾病的發(fā)生［2－3］，同時(shí)還與心血管疾病、糖尿病、腫瘤等系統(tǒng)性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［4］。以齲病為例:齲病是一種常見(jiàn)的慢性、感染性疾病，可引起牙體缺損、牙髓炎癥、疼痛［5］，不僅會(huì)影響患者的生活質(zhì)量，同時(shí)還會(huì)增加社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前對(duì)齲損的主要治療方式是去齲后的充填治療。前期已有體外和口內(nèi)模型研究證實(shí)，抗菌藥物改性的充填材料能調(diào)節(jié)體外生物膜的生態(tài)結(jié)構(gòu)、功能［6－9］，從而達(dá)到抗菌目的。雖然這些研究盡可能的模擬口內(nèi)環(huán)境，但由于個(gè)體差異，以及體外生物膜菌種的單一等原因，依舊難以實(shí)現(xiàn)完全模擬。因此對(duì)于齲病乃至口腔菌群的研究仍亟待有更好的研究模型，而雙生子模型則能一定程度的解決以上問(wèn)題。雙生子分為同卵雙生子和異卵雙生子，其中同卵雙生子理論上擁有完全相同的遺傳基因，而異卵雙生子的基因約為50%相同;無(wú)論是同卵雙生子還是異卵雙生子，由于其早期在母體內(nèi)接觸到的環(huán)境基本相同，因此兩者個(gè)體差異較小?；陔p生子的這一特點(diǎn)，近幾十年來(lái)，已有國(guó)內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用雙生子模型對(duì)人類(lèi)口腔的菌群進(jìn)行了分析研究，以期找到可能與疾病相關(guān)的微生物及其與宿主的關(guān)系，但仍存在不足之處，如動(dòng)物模型的缺乏，前瞻性的研究較少等。本文就雙生子研究模型用于人類(lèi)口腔菌群研究的進(jìn)展情況作一綜述。

1雙生子模型的定義、優(yōu)點(diǎn)及運(yùn)用

雙生子研究是利用同卵雙生子和異卵雙生子的基因共享程度及表型相似性，來(lái)確定復(fù)雜疾病或性狀的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，并判斷遺傳因素和環(huán)境因素對(duì)表型變異的相對(duì)貢獻(xiàn)大?。?0］。相較于其他研究模型而言，雙生子模型在人類(lèi)研究中的優(yōu)勢(shì)在于:配對(duì)兩個(gè)體的基因相似、在母體內(nèi)和出生后所接觸的環(huán)境也類(lèi)似，且生活習(xí)慣接近，從而能很好的控制變量;在年齡、性別等方面能更好的匹配，有利于排除干擾、混雜因素，以便更高效能的研究疾病的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體內(nèi)某些因素或指標(biāo)之間的關(guān)系［11］。除此之外，由于同卵雙生子的相關(guān)性較高，因此運(yùn)用患病狀況不同的雙生子進(jìn)行病例對(duì)照研究時(shí)所需樣本量相對(duì)較少［12］。經(jīng)典的雙生子模型主要用于研究特定的表型或特征與遺傳和環(huán)境之間的聯(lián)系，如果某種特征在同卵雙生子組內(nèi)表現(xiàn)相同，而在異卵雙生子中有差異，則說(shuō)明該特征受到遺傳因素的影響較大;反之，如果某些特定的表現(xiàn)型在同卵和異卵雙生子中都不同，則考慮環(huán)境因素造成這種差異的可能性較大。同卵雙生子遺傳背景相同，且后天環(huán)境相似，但卻出現(xiàn)不同的表型時(shí)，這樣的雙子模型則可以作為病例對(duì)照研究的對(duì)象，有助于對(duì)人類(lèi)菌群與疾病關(guān)系的研究，Ridaura等通過(guò)在無(wú)菌鼠腸道接種胖瘦狀況不同的同卵雙生子的腸道菌群后發(fā)現(xiàn)，接種較胖個(gè)體微生物的小鼠體重增長(zhǎng)大于接種較瘦個(gè)體微生物的小鼠［13］。該研究為人類(lèi)肥胖癥的治療提供了更加有效且持久性的方式，即通過(guò)相關(guān)益生菌或益生元的植入并搭配飲食的改變可治療人類(lèi)肥胖癥。

2雙生子卵性鑒定

由于同卵雙生子和異卵雙生子在基因相似程度方面并不同，因此鑒別雙生子的類(lèi)別尤為重要，否則會(huì)影響其遺傳傾向性的判斷，尤其是在樣本量較小的實(shí)驗(yàn)研究中?，F(xiàn)有多種分辨雙生子類(lèi)別的方法，其中相對(duì)簡(jiǎn)單的方法是通過(guò)問(wèn)卷的形式，若雙生子個(gè)體身體形態(tài)、面部長(zhǎng)相等特征相同的多，且兩人常被其他人認(rèn)錯(cuò)時(shí)，則判定為同卵雙生子，反之為異卵雙生子。雖然這種方法帶有一定的主觀性，但由于簡(jiǎn)單易行，已成為一種常用的方法，尤其是在樣本量較大時(shí)，其可行性較高。且有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)問(wèn)卷和詢問(wèn)的方式來(lái)鑒別雙生子卵性時(shí)，其準(zhǔn)確度可以達(dá)到90%［14］。隨著分子技術(shù)的發(fā)展，DNA標(biāo)記物成為了判斷同卵或異卵雙生子更為準(zhǔn)確、可靠的方法［15］。鑒定方法的逐漸成熟，為雙生子的準(zhǔn)確卵性確定和雙生子模型的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。

3雙生子模型在人類(lèi)口腔菌群研究中的應(yīng)用

在口腔菌群的研究中，雙生子模型的使用較為廣泛，涉及了唾液微生物、齲病微生物、口腔菌群定植時(shí)間等方面，旨在探究齲病、牙周病等相關(guān)微生物的特征與遺傳和環(huán)境因素之間的關(guān)系。Goodman在20世紀(jì)50年代首次使用雙生子模型進(jìn)行口腔領(lǐng)域的研究。該研究共納入38對(duì)性別相同的雙生子(其中19對(duì)同卵19對(duì)異卵)，并利用體外培養(yǎng)計(jì)數(shù)的方式檢測(cè)了雙生子唾液中變異鏈球菌和乳酸桿菌的檢出情況，結(jié)果顯示異卵雙生子的組內(nèi)差異總是大于同卵雙生子的組內(nèi)差異，提示基因?qū)θ祟?lèi)唾液微生物可能存在決定性的作用;作者分析認(rèn)為，這種差異可能是由于同卵雙生子的父母會(huì)以更為相似的方式對(duì)待孩子，從而導(dǎo)致同卵雙生子所接觸到的環(huán)境更加相似，至于雙生子唾液微生物的組成和量與齲損之間存在怎樣的聯(lián)系，還需后續(xù)的研究進(jìn)一步證實(shí)［16］。此后，相繼有越來(lái)越多的研究者通過(guò)雙生子模型研究遺傳或后天環(huán)境因素對(duì)于口腔菌群各方面特征的影響。部分研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境因素對(duì)于口腔微生物的影響可能超過(guò)遺傳因素的影響。例如:杜芹等［17］使用聚合酶鏈反應(yīng)－變性梯度凝膠電泳(PCR－DGGE)探究了20對(duì)雙生子的口腔微生物群組的組成和結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同卵雙生子和異卵雙生子組內(nèi)均表現(xiàn)出明顯的聚類(lèi)分布，說(shuō)明雙生子間口腔微生物的組成相似度比較高;但同卵雙生子和異卵雙生子之間的相似度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，根據(jù)經(jīng)典雙生子模型的研究結(jié)果判斷，口腔微生物的組成受環(huán)境因素影響的可能性更大。Papapostolou等［3］也得到了相似的結(jié)果，作者對(duì)雙生子齦上和齦下菌斑進(jìn)行了限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLPanalysis)后發(fā)現(xiàn)，在納入的95對(duì)雙生子中，同卵雙生子組和異卵雙生子組在齦上、齦下菌斑組成的相似性上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Ooi等［18］研究發(fā)現(xiàn)，同卵雙生子中兩個(gè)個(gè)體均能檢出變異鏈球菌的概率與異卵雙生子相似，兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而且乳酸桿菌的檢出率也有相似的情況。齲病的發(fā)生受多種因素的影響，其中牙菌斑是重要的始動(dòng)因素之一，而變異鏈球菌和乳酸桿菌則是現(xiàn)代科學(xué)家們普遍認(rèn)同的主要致齲菌。從以上的研究結(jié)果來(lái)看，人類(lèi)口腔菌群的組成受到環(huán)境因素的影響較大，而遺傳方面的影響相對(duì)較小。Bretz等［19］側(cè)重于口腔菌群的產(chǎn)酸情況進(jìn)行了相關(guān)研究，結(jié)果顯示，其研究對(duì)象中的各對(duì)雙生子的菌群產(chǎn)酸量的分布無(wú)顯著差異，在同卵和異卵雙生子間也是如此，從而得到了環(huán)境因素對(duì)口腔菌群產(chǎn)酸情況的影響大于遺傳因素影響的結(jié)論。以上研究結(jié)果提示，治療和預(yù)防齲病過(guò)程中可考慮將環(huán)境因素作為靶點(diǎn)，即通過(guò)調(diào)節(jié)環(huán)境而中斷或防止齲病的發(fā)生。但由于環(huán)境因素所指代的范圍過(guò)于廣泛，以上研究也并未指出某些能發(fā)揮具體作用的部分。因此，仍需大量的后續(xù)研究，一方面進(jìn)一步證實(shí)這些結(jié)果的準(zhǔn)確性;另一方面則希望能對(duì)環(huán)境和口腔菌群之間的關(guān)系有更深入的研究，以期找到更加具體和明確的研究靶點(diǎn)，從而發(fā)現(xiàn)齲病防治的新方法。除了經(jīng)典的雙生子模型外，由于雙生子在一些個(gè)體基本特征上的高度匹配性(如性別、年齡、種族及基因型等)，也常有研究者將其運(yùn)用到齲病及口腔菌群的研究中。Bockmann等［20］以151對(duì)同卵雙生子?jì)胗變?受試者均為0～1歲)為對(duì)象，結(jié)果顯示:有93%的雙生子其口腔變異鏈球菌的定植時(shí)間相同(平均在12個(gè)月左右)，從而為人群中嬰幼兒口腔中變異鏈球菌定植時(shí)間的確定提供了參考。變鏈球菌是重要的致齲菌之一，深入研究其在口腔中的定植等情況，對(duì)于預(yù)防或延遲兒童感染變異鏈球菌，更好的判斷個(gè)體的患齲風(fēng)險(xiǎn)而言意義重大。通常而言，要找到整個(gè)人群的口腔變異鏈球菌的定植時(shí)間，所需流行病學(xué)調(diào)查的樣本量巨大，且操作困難，而納入雙生子為研究對(duì)象，則可以減少樣本量，降低操作難度，所得到的數(shù)據(jù)也具有一定的參考價(jià)值。Corby等［11］通過(guò)雙生子模型評(píng)價(jià)了口腔生物膜中細(xì)菌定植能力的可遺傳性。該研究共納入102對(duì)雙生子(其中包括齲活躍性高的個(gè)體以及未患齲的個(gè)體，并要求一對(duì)雙生子內(nèi)兩個(gè)個(gè)體的患齲情況相同)，通過(guò)對(duì)雙生子牙菌斑中微生物DNA的棋盤(pán)雜交、微生物豐富度計(jì)算、可遺傳性分析后發(fā)現(xiàn)，約有20種微生物在齲活躍度高的組和未患齲的組之間有顯著性差異;與無(wú)齲組相比，齲活躍組牙菌斑中豐富度高的細(xì)菌多為與齲病相關(guān)的細(xì)菌，如變異鏈球菌和乳桿菌屬;而在無(wú)齲組牙菌斑中檢出較多的細(xì)菌則是一些已知的或可能有益于口腔健康的細(xì)菌，且多具有中等或較高的可遺傳性。由于齲病的發(fā)病率較高，其防治依舊是公共衛(wèi)生的一大難題。通過(guò)分析患齲與非患齲個(gè)體口腔菌群的差異，或許能夠找到與齲病發(fā)生高度相關(guān)的細(xì)菌，然后再針對(duì)這些細(xì)菌及其特征找到預(yù)防、治療齲病的新方法，以期達(dá)到降低個(gè)體的患齲風(fēng)險(xiǎn)、減輕社會(huì)醫(yī)療負(fù)擔(dān)的目的。目前對(duì)于人類(lèi)菌群方面的研究，已經(jīng)逐步發(fā)現(xiàn)了遺傳及環(huán)境因素等與菌群的相關(guān)性，包括口腔微生物、腸道微生物等領(lǐng)域。其中腸道菌群的研究較為深入和成熟，而在口腔菌群方面，目前已有的眾多研究大多僅局限于描述性的，究竟口腔菌群的相關(guān)特征受環(huán)境因素或遺傳因素的影響何者更大，以及口腔菌群是如何受到影響的，都尚未有較為肯定的答案，還需后續(xù)更加深入的研究來(lái)揭示口腔疾病的有關(guān)機(jī)理，雙生子模型也將發(fā)揮更大的作用。

4展望

隨著微生物研究從單一物種轉(zhuǎn)向群落的研究，研究中能夠得到的信息量越來(lái)越大，如何合理選擇和利用數(shù)據(jù)，是研究者們需要思考的問(wèn)題之一，這其中，模型的使用顯得尤為重要。一個(gè)好的模型不僅能提高數(shù)據(jù)的可信度，降低研究操作難度，同時(shí)還能夠?yàn)楹笃诘念?lèi)似實(shí)驗(yàn)提供參考。雙生子模型基于其獨(dú)特的遺傳環(huán)境特性，在微生物群落研究中有著先天的優(yōu)勢(shì)。然而，目前對(duì)于雙生子模型在群落方面的應(yīng)用研究還不夠深入。比如，在口腔菌群的研究方面，利用雙生子模型研究主要還是描述性的研究為主，且多關(guān)注于比較同卵雙生子和異卵雙生子間有無(wú)差異，從而推斷遺傳因素或者環(huán)境因素的影響。但是，在大量的臨床診治和調(diào)查中，我們同樣會(huì)發(fā)現(xiàn)同卵雙生子的口腔健康狀況完全不同的病例出現(xiàn)，對(duì)于這類(lèi)患者目前仍僅有描述性研究。要解釋在遺傳背景相同，環(huán)境因素幾乎一致的配對(duì)個(gè)體組內(nèi)為何會(huì)出現(xiàn)這種差異，則需要進(jìn)行更加具有前瞻性的研究，來(lái)揭示口腔健康的奧秘。人源化的動(dòng)物模型是目前研究腸道菌群與相關(guān)疾病之間關(guān)系的常用手段之一，通過(guò)與雙生子模型的結(jié)合，可將宿主菌群轉(zhuǎn)移至動(dòng)物體內(nèi)，并復(fù)制宿主的表型，從而探究菌群與疾病之間的關(guān)系。但是，關(guān)于口腔菌群的研究，目前尚未見(jiàn)相應(yīng)的人源化動(dòng)物模型的報(bào)道。在今后的研究中，對(duì)于口腔菌群的研究可以利用患病情況不同的同卵雙生子的唾液和菌斑進(jìn)行人源化動(dòng)物模型的建立，然后再結(jié)合臨床資料以及基因水平的分析，以期能更有效的找到導(dǎo)致同卵雙生子口腔健康狀態(tài)不同的可能原因。雙生子模型在人類(lèi)菌群研究中的優(yōu)勢(shì)顯著，并能控制變量，減小個(gè)體間的差異;而人源化的動(dòng)物模型則能在一定程度上模擬人體內(nèi)的狀態(tài)，通過(guò)兩者的結(jié)合，有望能為人類(lèi)口腔菌群的研究打開(kāi)新的思路和方向。

作者：吳虹樂(lè) 任彪 程磊 單位：口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院