生物醫(yī)學(xué)雞胚運(yùn)用分析

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1資料和方法

1.1資料來(lái)源

由第一作者在2011-06進(jìn)行檢索。檢索數(shù)據(jù)庫(kù)：PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)，網(wǎng)址www.ncbi.nlm.gov/PubMed；CNKI數(shù)據(jù)庫(kù)，網(wǎng)址www.cnki.net/；英文資料的檢索時(shí)間范圍為1967/2011；中文資料的檢索時(shí)間范圍為1990/2011。英文檢索詞為“chickenembryochorioallantoicmembranemodel;neuronalculture”；中文檢索詞為“雞胚絨毛尿囊膜，模型；神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)”。

1.2入選標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①雞胚培養(yǎng)方法的應(yīng)用。②神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的研究。③疾病模型。排除標(biāo)準(zhǔn)：①與此文目的無(wú)關(guān)。②較陳舊的文獻(xiàn)。③重復(fù)同類(lèi)研究。

1.3質(zhì)量評(píng)估

基礎(chǔ)研究和疾病模型研究原著163篇，綜述40篇，述評(píng)2篇。

2結(jié)果

2.1納入文獻(xiàn)

基本情況初檢得到205篇文獻(xiàn)，中文123篇，英文82篇。閱讀標(biāo)題和摘要進(jìn)行初篩，排除因研究目的與此文無(wú)關(guān)112篇，內(nèi)容重復(fù)性的研究59篇，共保存34篇中英文文獻(xiàn)做進(jìn)一步分析。文獻(xiàn)[1-2]研究了雞胚的組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，文獻(xiàn)[3-30]篇分析了雞胚在腫瘤研究、病毒培養(yǎng)、藥物作用研究領(lǐng)域的應(yīng)用，文獻(xiàn)[31-34]篇利用雞胚研究了氧化應(yīng)激模型及子宮內(nèi)膜移位癥雞胚模型。

2.2結(jié)果描述

2.2.1雞胚的組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)雞胚一般是雞的受精卵從開(kāi)始孵化到雛雞的階段，該階段20~21d。雞胚有3個(gè)胚層發(fā)育而成，在發(fā)育的不同階段具有不同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用第5~11天的雞胚較多，在該階段雞胚具有胚體、羊膜、絨毛膜、尿囊和卵黃囊等結(jié)構(gòu)，外面被覆殼膜和殼。第10天絨毛膜與尿囊合并為絨毛尿囊膜，主要由3層構(gòu)成：外胚層，緊貼殼膜，由一到兩層絨毛膜上皮構(gòu)成；中胚層，富含大量毛細(xì)血管和間質(zhì)細(xì)胞；內(nèi)胚層，面向尿囊腔，是一層扁平的內(nèi)皮。絨毛尿囊膜緊貼多孔的殼，其中的血管網(wǎng)通過(guò)尿囊動(dòng)脈和靜脈與胚體的循環(huán)相連，是雞胚的呼吸器官。該結(jié)構(gòu)保證了足夠的氣體和養(yǎng)分交換，也使其能夠有效的支持移植物的生長(zhǎng)，從而成為多種實(shí)驗(yàn)的良好模型。卵黃囊是雞胚的營(yíng)養(yǎng)器官，含有豐富的血管網(wǎng)為雞胚提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。雞胚的免疫系統(tǒng)由T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫和B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫構(gòu)成。B細(xì)胞在相當(dāng)與哺乳動(dòng)物骨髓的法氏囊中分化，T細(xì)胞在胸腺分化。至孵育的第10天，雞胚的免疫系統(tǒng)尚未完全建立，孵育的第11天后才能檢測(cè)到T細(xì)胞和B細(xì)胞[2]，至第18天免疫系統(tǒng)方初步建立。這一特點(diǎn)使雞胚在孵育的早期不對(duì)異物產(chǎn)生排異反應(yīng)，有利于移植物的生長(zhǎng)。

2.2.2雞胚在腫瘤研究領(lǐng)域的應(yīng)用雞胚在腫瘤研究中的應(yīng)用主要有腫瘤血管生成，腫瘤種植與轉(zhuǎn)移，腫瘤侵襲等方面。目前認(rèn)為腫瘤的血管生成在腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移中起主要作用。腫瘤的生長(zhǎng)需要新生血管來(lái)提供養(yǎng)分，氧氣和排泄代謝廢物。如果沒(méi)有新生血管形成，原發(fā)腫瘤的大小一般不超過(guò)2mm×2mm×2mm。對(duì)腫瘤血管生成的研究分為促進(jìn)血管生成和抑制血管生成兩個(gè)方面。血管生成的反應(yīng)表現(xiàn)為圍繞移植物的輻輳放射狀血管生成和血管密度增加[3]；抑制血管生成的反應(yīng)為血管減少，密度降低直至消失。Vacca等[4]用絨毛尿囊膜模型來(lái)研究漿細(xì)胞條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)血管生成的能力，發(fā)現(xiàn)活動(dòng)性骨髓瘤患者的條件培養(yǎng)基較非活動(dòng)性骨髓瘤患者的條件培養(yǎng)基能顯著促進(jìn)血管的生成。他們還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤的促血管生成反應(yīng)和某些內(nèi)源性血管生成抑制因子的缺失有關(guān)[5]。Ribatti等[6]通過(guò)把不同神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者的活檢腫瘤組織移植入絨毛尿囊膜，證實(shí)有癌基因MYCN擴(kuò)增者比無(wú)MYCN擴(kuò)增者具有更顯著的促血管生成作用。Kern等[7]應(yīng)用絨毛尿囊膜模型研究發(fā)現(xiàn)硼替佐米(bortezomib,蛋白酶體抑制劑)有很強(qiáng)的抗血管生成作用，但這一作用可以被GRP-78因子所拮抗。通過(guò)構(gòu)建各種腫瘤的絨毛尿囊膜模型，雞胚在腫瘤的種植與轉(zhuǎn)移的研究中也有廣泛的應(yīng)用。絨毛尿囊膜模型最早由Knighton等[8]提出，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者已成功的建立卵巢癌絨毛尿囊膜模型[9]、胃癌絨毛尿囊膜模型[10]、前列腺癌絨毛尿囊膜模型[11]，鼻咽癌絨毛尿囊膜模型[12]，骨肉瘤絨毛尿囊膜模型等[13]。腫瘤組織來(lái)源不同構(gòu)建模型所需最佳條件有所區(qū)別，有文獻(xiàn)報(bào)道黑色素瘤細(xì)胞株、前列腺癌細(xì)胞株接種細(xì)胞數(shù)在105~106就可以有較好的成瘤效果[11,14]；膽管癌細(xì)胞須在4×106時(shí)才能較好的形成移植瘤[15]；卵巢癌要求更高，需要107~108才形成移植瘤[10]；所以在建立不同腫瘤細(xì)胞的絨毛尿囊膜模型時(shí)要首先摸索出模型建立的最佳條件。這些模型的建立對(duì)研究腫瘤的種植與轉(zhuǎn)移提供了很好的在體模型。Taizi等[16]利用白血病絨毛尿囊膜模型，通過(guò)DNA的定量分析，研究了白血病對(duì)各個(gè)臟器的侵襲情況。也有學(xué)者運(yùn)用絨毛尿囊膜模型研究了腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，如癌細(xì)胞通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到靶器官[17]；轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞通過(guò)血管壁轉(zhuǎn)移到細(xì)胞間質(zhì)和靶器官[18]；腫瘤細(xì)胞在靶器官內(nèi)的增殖等[19]。

2.2.3雞胚在病毒培養(yǎng)疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用雞胚適于部分敏感病毒的生長(zhǎng)，長(zhǎng)期以來(lái)被大量用于流感病毒等的培養(yǎng)和疫苗的生產(chǎn)。應(yīng)用雞胚材料進(jìn)行病毒培養(yǎng)有兩種方法：一種是直接接種在雞胚的不同部位，如尿囊腔、羊膜腔等；一種是接種在體外培養(yǎng)的雞胚細(xì)胞中，如成纖維細(xì)胞。郭芳等[20]應(yīng)用雞胚尿囊腔和羊膜腔接種法比較了流感病毒的雞胚培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)兩種分離方法的異同。發(fā)現(xiàn)雞胚培養(yǎng)法較細(xì)胞培養(yǎng)法具有病毒易復(fù)制，接種部位病毒含量大，對(duì)病毒不產(chǎn)生抗體，來(lái)源充足，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。Meyer等[21]利用原代雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)修飾的安卡拉痘苗病毒，經(jīng)過(guò)一系列的傳代得到了安卡拉痘苗。萬(wàn)學(xué)勤等[22]也利用雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)新城疫病毒來(lái)進(jìn)行抗腫瘤新城疫病毒疫苗的研究。富強(qiáng)等[23]從細(xì)胞病變和抗原滴度兩個(gè)方面比較了雞胚肝細(xì)胞培養(yǎng)禽腺病毒和SPF雞腎細(xì)胞培養(yǎng)禽腺病毒，兩者并無(wú)明顯差異，可以用雞胚肝細(xì)胞培養(yǎng)禽腺病毒來(lái)替代傳統(tǒng)的SPF雞腎細(xì)胞培養(yǎng)法。黃杰庭[24]利用SPF雞胚進(jìn)行了中國(guó)首例甲型H1N1病毒的分離培養(yǎng)和鑒定。目前常用的疫苗中有些是通過(guò)病毒接種雞胚培養(yǎng)法生產(chǎn)的，但是并非所有世界衛(wèi)生組織公布推薦的疫苗株在雞胚培養(yǎng)的過(guò)程中都具有良好的病毒復(fù)制能力。研究發(fā)現(xiàn)在雞胚中能夠良好復(fù)制的流感毒株通常在HA蛋白基因序列上和能夠在人群中流行的毒株存在一個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)差異[25]。尋找在雞胚中復(fù)制良好的高產(chǎn)株或者通過(guò)不同毒株之間的重配來(lái)獲得在雞胚上有良好復(fù)制能力的毒株也是目前利用雞胚生產(chǎn)疫苗研究的熱點(diǎn)。

2.2.4雞胚在藥物作用研究中的應(yīng)用雞胚在藥物作用的研究主要有抗腫瘤藥物和活血化瘀中藥的研究。有學(xué)者利用黑色素瘤絨毛尿囊膜模型研究了內(nèi)皮抑素和多西環(huán)素對(duì)腫瘤血管生成的影響[26]。李穎嘉等[27]過(guò)骨肉瘤OS-732細(xì)胞絨毛尿囊膜模型研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抗體對(duì)骨肉瘤血管生成及腫瘤增殖、凋亡狀態(tài)均有顯著影響；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抗體組腫瘤去血管數(shù)目及瘤細(xì)胞數(shù)顯著低于PBS對(duì)照組。Amin等[28]通過(guò)絨毛尿囊膜模型研究發(fā)現(xiàn)甘氨酸能抑制50%以上的胚胎血管形成，使損傷修復(fù)血管形成中所需要的纖維蛋白的形成減少30%以上。同時(shí)發(fā)現(xiàn)能使乳腺癌的生長(zhǎng)減少15%，微血管密度下降20%。提示甘氨酸具有抑制胚胎血管形成，抑制損傷修復(fù)和腫瘤生長(zhǎng)的作用。李漢青等[29]應(yīng)用絨毛尿囊膜模型用pH梯度法對(duì)復(fù)方三黃膠囊抑制腫瘤血管生成的活性部位進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)用乙酸乙酯萃取的酸性部位復(fù)方三黃膠囊具有顯著的抑制雞胚絨毛尿囊膜細(xì)小毛細(xì)血管的作用。董紀(jì)軍等[30]用雞胚心侵襲實(shí)驗(yàn)法研究了雌二醇對(duì)SAcc83細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響，發(fā)現(xiàn)雌二醇對(duì)SAcc83細(xì)胞有明顯的促增殖和轉(zhuǎn)移作用。

2.2.5雞胚在其他生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用雞胚還被用于其他研究中，如子宮內(nèi)膜移位癥雞胚模型。Maas等[31]利用該模型研究了子宮內(nèi)膜細(xì)胞的種植侵襲過(guò)程。俞超芹等[32]研究了葛根素對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞惡性行為的調(diào)控機(jī)制，結(jié)果顯示葛根素能明顯抑制種植內(nèi)膜囊泡及周邊血管形成，可以明顯上調(diào)EM在位基質(zhì)細(xì)胞凋亡基因BAD、BAX、CASP8、CASP9和TNFRSF6的表達(dá)，并增強(qiáng)細(xì)胞周期依賴(lài)性蛋白激酶抑制因子CDKN1B、CDKN2A及IFNA1、IFNB1基因表達(dá)；減少癌基因FOS、CHEK2、SRC和黏附侵襲基因ITGB5、MMP9及生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)錄因子基因PDGFA、NFKBIA表達(dá)。為了探討氧化應(yīng)激對(duì)胚胎發(fā)育的不良影響，研究疾病的發(fā)生機(jī)制，篩選和評(píng)價(jià)藥物活性，利用各種應(yīng)激原負(fù)荷建立了不同的雞胚氧化應(yīng)激模型[33]。也有學(xué)者利用雞胚背根神經(jīng)節(jié)與前腦細(xì)胞體外培養(yǎng)來(lái)研究神經(jīng)損傷修復(fù)與評(píng)價(jià)神經(jīng)生長(zhǎng)因子的作用和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)藥物的效果[34]。

3展望

如能充分利用雞胚的培養(yǎng)體系，則能為多領(lǐng)域的研究提供切實(shí)可行的方法與思路。目前神經(jīng)細(xì)胞體外培養(yǎng)作為一種基本的實(shí)驗(yàn)手段在神經(jīng)生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)界備受重視，借助神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，不但可以了解神經(jīng)元的形態(tài)發(fā)育過(guò)程，而且可探討細(xì)胞因子對(duì)神經(jīng)元存活、生長(zhǎng)的影響。但神經(jīng)細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，不能繼續(xù)增殖，對(duì)培養(yǎng)條件要求較高，技術(shù)要求嚴(yán)格，如能利用雞胚培養(yǎng)構(gòu)建神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)模型，則能為神經(jīng)科學(xué)的教學(xué)與科研提供一種價(jià)格便宜，操作簡(jiǎn)便，容易獲得，周期短的新方法與途徑。