探究對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生影響的因素

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1．方法

(1)本實(shí)驗(yàn)將C6細(xì)胞分成Q0、Q50、Q100和Q1504個(gè)組，Q0組加適量二甲亞砜(DMSO，即槲皮素溶劑，每2mlDMEM全培養(yǎng)基中加1μl二甲亞砜，低濃度DMSO對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)等無影響)處理，Q50、Q100和Q150槲皮素的濃度分別為50、100、150μmol/L。然后將其放入37℃、5%的CO2孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

(2)將三維細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)膠Matrigel置冰上或放于冰箱內(nèi)2～8℃過夜解凍，吸管輕輕吹打，避免吸入氣泡。將用高糖DMEM做1∶5稀釋后的Matrigel涂于Insert細(xì)胞生長(zhǎng)面，150～200μl/cm2，37℃作用30min，備用。將饑餓12～24h后的C6細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，離心棄培養(yǎng)液，PBS洗1～2遍，用含0．1%FBS的DMEM配養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)至于5×105個(gè)/厘米2。取200μl細(xì)胞懸液加入Transwell上室，取含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基500μl加入下室。37℃、5%的CO2培養(yǎng)36h后，用棉簽擦去Matrigel和上室內(nèi)細(xì)胞，甲醛固定10min。0．1%結(jié)晶紫室溫下孵育10min，清水漂洗3遍以上。將Transwell小室翻過來底面朝上置顯微鏡下觀察拍照，隨機(jī)選取8～10個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。

(3)將饑餓12～24h后的C6細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，離心棄培養(yǎng)液，PBS洗1～2遍，用含0．1%FBS的DMEM配養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)至于5×105個(gè)/厘米2。取200μl細(xì)胞懸液加入Transwell上室，取含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基500μl加入下室。37℃、5%的CO2培養(yǎng)36h后，用棉簽擦去上室內(nèi)細(xì)胞，甲醛固定10min。0．1%結(jié)晶紫室溫孵育10min，清水漂洗3遍以上。將Transwell小室翻過來底面朝上置顯微鏡下觀察拍照，隨機(jī)選取8～10個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。

(4)將培養(yǎng)好的C6膠質(zhì)瘤的細(xì)胞培養(yǎng)基半量換液，加入1ml含20μmol/LEdU的全培養(yǎng)基，其最終工作濃度為10μmol/L。將其置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后棄去培養(yǎng)液，加入1ml3．7%甲醛室溫下固定15min，棄去固定液，用3%BSA洗兩遍。然后再加入1ml0．5%TritonX－100室溫下孵育20min;棄去通透液，用3%BSA洗兩遍。然后加入0．5mlClick－iT反應(yīng)混合液，室溫下避光振蕩30min。棄去反應(yīng)液，用3%BSA洗1遍。然后再加入1ml1×Hoechst33342反應(yīng)液室溫下避光反應(yīng)30min。用PBS清洗兩遍后，將其置于激光共聚焦顯微鏡下拍照分析并計(jì)算其增殖細(xì)胞百分比。

(5)將收集的懸浮細(xì)胞室溫下400g離心5min。棄上清，加入250μl胰酶溶液(A液)，用手指輕彈將其混勻，室溫下反應(yīng)10min。然后再加入200μl的胰酶抑制劑和核糖核酸酶的混合液(B液)，用手指輕彈將其混勻，室溫下反應(yīng)10min。最后加入200μl冰冷的PI染液(C液)用手指輕彈將其混勻，4℃避光反應(yīng)10min。然后將其在3h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用SPSS13．0進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)及單因素方差分析(One－WayANOVA)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

1.槲皮素處理36h后，Q50、Q100和Q150組的侵襲細(xì)胞比率分別為(45．81±7．55)%、(13．63±3．15)%和(4．63±1．12)%，與對(duì)照組(100%)相比，槲皮素處理組的侵襲細(xì)胞比率顯著降低(P均＜0．01)，槲皮素能顯著降低C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力，且具有一定的濃度依賴性。槲皮素處理12h后，與對(duì)照組(100%)相比，Q50、Q100和Q150的遷移細(xì)胞比率分別為57．98%±6．84%、33．60%±3．91%和11．79%±3．27%(P均＜0．05)，槲皮素能顯著降低C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力，且具有一定的濃度依賴性。

2．槲皮素處理24h后，Q50、Q100和Q150組的增殖細(xì)胞百分比分別為21．49%、7．30%和1．12%，與對(duì)照組(45．37%)相比，其增殖細(xì)胞百分比顯著降低(P＜0．01)，且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。

4.討論

本研究發(fā)現(xiàn)槲皮素(處理時(shí)間為24h)通過抑制核苷酸類似物Edu摻入到其細(xì)胞核中來抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，并將其阻斷在S期。以上研究均證實(shí)槲皮素可明顯抑制大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，但阻斷其細(xì)胞周期的環(huán)節(jié)存在差異，這可能與操作時(shí)處理的時(shí)間及其細(xì)胞生長(zhǎng)狀況密切相關(guān);早期研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可將癌細(xì)胞阻斷在G0/G1期、S期或者是G2/M期;槲皮素阻斷細(xì)胞在S期還是G2/M期依賴于細(xì)胞的類型和對(duì)其處理的程度。該研究對(duì)膠質(zhì)瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的臨床研究具有一定的指導(dǎo)意義。綜上所述，槲皮素在體外對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞有抑制侵襲、遷移、增殖的作用，但其作用機(jī)制和應(yīng)用于臨床治療還需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

作者：苑召虎 張 彥 王惠麗 姚 芳 胡子有 顏曉慧 吳炳義 單位：南方醫(yī)科大學(xué)